專利名稱：血紅蛋白及血紅蛋白衍生物的測定方法、測定試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及血液試樣中的血紅蛋白及血紅蛋白衍生物的測定方法以及用于該方
法的試劑組合物、測定試劑盒、分析器件及分析系統，涉及更加迅速且準確地測定血紅蛋白 及血紅蛋白衍生物的技術。此外，本發明還涉及使生物學物質與蛋白質結合的方法。所得 的配體-蛋白質復合物可用作免疫測定中的凝集試劑。
背景技術：
作為血紅蛋白衍生物之一的血紅蛋白Alc因為可以排除進食對血糖值變化產生 的影響來判定平時的血糖水平，因此是為了早期發現生活習慣病而經常測定的項目。血紅 蛋白Alc是紅細胞中所含的血紅蛋白與葡萄糖結合而成的物質，以血紅蛋白Alc相對于血 紅蛋白的存在比例(％ )數值化。因此，為了測定血紅蛋白Alc的存在比例，需要分別測定 血紅蛋白及血紅蛋白Alc。血紅蛋白的測定一般采用利用血紅蛋白特有的光吸收特性而以 415nm附近的波長或540nm附近的波長進行測定的方法。作為以540nm附近的波長進行測 定的方法，周知氰化正鐵血紅蛋白法和SLS血紅蛋白法。此外，為了用免疫法測定血紅蛋白 Alc，需要以下的處理通過使血液試樣溶血而從紅細胞中取出血紅蛋白后，為了判別血紅 蛋白是非糖化血紅蛋白還是血紅蛋白Alc，通過改變血紅蛋白的立體結構而使血紅蛋白的 被糖化了的部分從其立體結構中暴露至外部。該處理稱為變性。另外，還可以通過使其與 特異性地識別被糖化了的部分的抗體反應，從而以免疫學的方式測定血紅蛋白Alc量。
還有，作為本發明的現有技術文獻，公開有國際公開第2006/112339號文本 (W02006/112339A1)，關于測定血紅蛋白Alc時的變性方法，其中也有記載。該方法是將含 血液成分的試樣用非離子型表面活性劑和氧化劑處理而使所述試樣中的血紅蛋白變性的 血紅蛋白衍生物的測定方法。 此外，近年來，在臨床檢查中，為了檢查各種疾病的發展程度，采用了各種各樣的 檢查方法，可以使血液等生物學試樣與分析試劑反應來對生物學試樣中的各種成分進行定 量的大型自動分析器件被實用化，變得在醫療領域中必不可少。在這樣的背景下，近年來市 場上渴望出現實現低成本、試樣液的少量化、短時間測定、裝置的小型化、多項目同時測定 等的更高精度且運用的自由度更高的分析裝置和分析方法。 作為運用的自由度高的分析裝置和分析方法之一，公知以抗原抗體反應為基礎的 測定原理，有免疫比濁法、免疫散射比濁法、膠乳免疫凝集法、免疫凝集抑制法、膠乳免疫凝 集抑制法、熒光免疫測定法、化學發光免疫測定法、電化學免疫測定法、熒光偏光免疫測定 法、免疫色譜法等免疫測定法。 基于粒子凝集反應的免疫測定中，對于生物學試樣中的特定成分的定性或定量的 測定根據游離狀態的抗分析對象抗體或與水懸浮性粒子結合的抗分析對象抗體的凝集的 有無及其程度來判定。作為該水懸浮性粒子最普遍被使用的為被稱作膠乳粒子的物質。
基于粒子凝集反應的免疫測定中，已知利用免疫學粒子凝集抑制反應的測定方 法。如果將抗分析對象抗體與對該抗體具有特異性的凝集試劑混合，則凝集試劑識別抗分
6析對象抗體而發生凝集，但如果其中存在分析對象，則該凝集受到抑制，所以通過以光學方
式測定或計數該凝集的程度，則可以定量地檢測分析對象。該測定方法能夠適用于各種分
析對象，可以廣泛應用。凝集反應中，凝集試劑的濃度對反應有較大的影響。 還有，作為關于免疫測定中使用的凝集試劑的現有技術文獻信息，已知配體_聚
合物復合物的制造方法， 一般被經常使用(例如參照日本專利特開平1-155272號公報)。
具體來說，關于作為用于測定生物學試樣中的特定成分、特別是血紅蛋白Alc的凝集試劑
的配體-聚合物復合物進行了公開，對使配體共價結合于聚天冬氨酸等聚合物材料上的配
體-聚合物復合物進行了記載。
圖14為現有的作為配體-聚合物復合物的凝集試劑的示
意圖，現有的凝集試劑4由多肽(載體)5、連接物2、配體3形成。通過介以連接物2使多
肽(載體)5與配體3結合而制成。 專利文獻1 :國際公開第2006/112339號文本 專利文獻2 :日本專利特開平1-155272號公報 發明的揭示 上述的測定血紅蛋白衍生物的方法的特征在于，使用不會對免疫反應造成不良影 響的非離子型表面活性劑和氧化劑。該方法中，將血紅蛋白變性后，先混合標記有針對血紅 蛋白衍生物的抗體的膠乳試劑，再混合凝集多價抗原，從而可以測定血紅蛋白衍生物。在這 里，為了準確地測定血紅蛋白中血紅蛋白衍生物的存在比例，必須在可靠地將血液試樣中 的所有血紅蛋白變性后測定血紅蛋白，進行采用免疫法的血紅蛋白衍生物的測定。尤其，為 了實現更迅速的血紅蛋白衍生物的測定，必須在短時間內高效地進行作為最初的工序的血 紅蛋白變性，但不能因過度使用蛋白質變性效果強的試劑而對后續的免疫測定中使用的抗 體造成破壞。 然而，根據所述的作為現有技術的國際公開第2006/112339號文本 (W02006/112339A1)中記載的方法，非離子型表面活性劑和氧化劑雖然對抗體不會造成破 壞，但使血紅蛋白變性的工序需要約3分鐘。這與采用胃蛋白酶或離子型表面活性劑等的 一般的血紅蛋白衍生物的測定方法中的血紅蛋白處理時間相比，也僅處于非常一般的水 平。然而，為了進行更迅速的血紅蛋白衍生物的測定，必須縮短血紅蛋白的變性工序的時 間。 此外，根據所述日本專利特開平1-155272號公報中記載的方法，通過由可控的數 量的配體與聚合物材料的結合而生成的配體_聚合物復合物，在基于采用該配體_聚合物 復合物的免疫測定的生物學試樣中的特定成分的測定中，雖然實現了反應性中的靈敏度提 高和涉及高再現性的技術提高，但未考慮到該測定所需的時間和配體_聚合物復合物的室 溫保存。即，現有的采用配體-聚合物復合物的免疫測定中，由于凝集反應速度慢，因此測 定需要較長的時間。此外，由于室溫下的保存不穩定，因此需要通過冷藏進行保存。
本發明的目的在于提供通過在不對免疫反應造成不良影響的情況下更迅速且可 靠地將血紅蛋白變性，從而迅速且準確地測定血紅蛋白及血紅蛋白衍生物，測定血紅蛋白 中的血紅蛋白衍生物的存在比例的血紅蛋白及血紅蛋白衍生物的測定方法以及用于該方 法的試劑組合物、測定試劑盒、分析器件及分析系統。 此外，本發明是解決所述現有的課題的發明，其目的在于在不對免疫反應造成不 良影響的情況下實現采用免疫測定的對于生物學試樣中的特定成分的測定時間的縮短和凝集試劑的保存穩定性的提高。 為了解決所述現有的課題，本發明在將對免疫反應的影響抑制至最低限度的同 時，具有迅速且更可靠的血紅蛋白的變性效果。 特別是本發明的權利要求1的血紅蛋白的測定方法的特征在于，包括以下的工 序將含血液成分的試樣用非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽進行處理，使所述試樣中 的血紅蛋白變性。 此外，本發明的權利要求2的血紅蛋白的測定方法是權利要求1所述的血紅蛋白 的測定方法，其特征在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金屬鹽。 此外，本發明的權利要求3的血紅蛋白衍生物的測定方法的特征在于，將含血液 成分的試樣用非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽進行處理后，進行所述試樣中的血紅 蛋白的測定，再使用與經變性的血紅蛋白衍生物的變性部位特異性地結合的抗體進行血紅 蛋白衍生物的免疫測定。 此外，本發明的權利要求4的血紅蛋白衍生物的測定方法是權利要求3所述的血
紅蛋白衍生物的測定方法，其特征在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金屬鹽。 此外，本發明的權利要求5的血紅蛋白衍生物的測定方法是權利要求3所述的血
紅蛋白衍生物的測定方法，其特征在于，所述金屬鹽的濃度是不會顯著地妨礙血紅蛋白衍
生物的免疫測定的濃度。 此外，本發明的權利要求6的血紅蛋白衍生物的測定方法是權利要求3所述的血 紅蛋白衍生物的測定方法，其特征在于，包括測定所述試樣中所含的血紅蛋白的工序；進 行所述試樣中所含的血紅蛋白衍生物的免疫測定的工序；算出所述血紅蛋白中的血紅蛋白 衍生物的存在比例的工序。 此外，本發明的權利要求7的血紅蛋白衍生物的測定方法是權利要求6所述的血
紅蛋白衍生物的測定方法，其特征在于，所述血紅蛋白衍生物是血紅蛋白Alc。 此外，本發明的權利要求8的試劑組合物是用于在測定含血液成分的試樣中的血
紅蛋白時對試樣進行處理的試劑組合物，其特征在于，至少包含使血紅蛋白變性的非離子
型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽。 此外，本發明的權利要求9的試劑組合物是權利要求8所述的試劑組合物，其特征 在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金屬鹽。 此外，本發明的權利要求10的試劑組合物是用于在測定含血液成分的試樣中的 血紅蛋白和血紅蛋白衍生物時對試樣進行處理的試劑組合物，其特征在于，至少包含使血 紅蛋白和血紅蛋白衍生物變性的非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽，還包含與經變性 的血紅蛋白衍生物的變性部位特異性地結合的抗體。 此外，本發明的權利要求11的試劑組合物是權利要求IO所述的試劑組合物，其特 征在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金屬鹽。 此外，本發明的權利要求12的試劑組合物是權利要求IO所述的試劑組合物，其特 征在于，所述金屬鹽的濃度是不會顯著地妨礙血紅蛋白衍生物的免疫測定的濃度。
此外，本發明的權利要求13的試劑組合物是權利要求IO所述的試劑組合物，其特 征在于，所述血紅蛋白衍生物是血紅蛋白Alc。 此外，本發明的權利要求14的測定試劑盒是測定含血液成分的試樣中的血紅蛋白時使用的測定試劑盒，其特征在于，至少保有包含使血紅蛋白變性的非離子型表面活性 劑、氧化劑和金屬鹽的試劑組合物。 此外，本發明的權利要求15的測定試劑盒是權利要求14所述的測定試劑盒，其特 征在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金屬鹽。 此外，本發明的權利要求16的測定試劑盒是測定含血液成分的試樣中的血紅蛋 白和血紅蛋白衍生物時使用的測定試劑盒，其特征在于，至少保有包含使血紅蛋白和血紅 蛋白衍生物變性的非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽的試劑組合物以及與經所述試劑 組合物變性的血紅蛋白衍生物的變性部位特異性地結合的抗體。 此外，本發明的權利要求17的測定試劑盒是權利要求16所述的測定試劑盒，其特 征在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金屬鹽。 此外，本發明的權利要求18的測定試劑盒是權利要求16所述的測定試劑盒，其特 征在于，所述金屬鹽的濃度是不會顯著地妨礙血紅蛋白衍生物的免疫測定的濃度。
此外，本發明的權利要求19的測定試劑盒是權利要求16所述的試劑組合物，其特 征在于，所述血紅蛋白衍生物是血紅蛋白Alc。 此外，本發明的權利要求20的分析器件是測定含血液成分的試樣中的血紅蛋白 時使用的分析器件，其特征在于，至少包括添加所述試樣的試樣添加部位；與所述試樣添 加部位連接，通過包含非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽的試劑組合物使所述已添加 的試樣中的血紅蛋白變性的變性部；與所述變性部連接，檢測所述經變性的血紅蛋白的檢 測部。 此外，本發明的權利要求21的分析器件是權利要求20所述的分析器件，其特征在 于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金屬鹽。 此外，本發明的權利要求22的分析器件是測定含血液成分的試樣中的血紅蛋白 和血紅蛋白衍生物時使用的分析器件，其特征在于，至少包括添加所述試樣的試樣添加部 位，與所述試樣添加部位連接且通過至少包含非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽的試 劑組合物使所述已添加的試樣中的血紅蛋白變性的變性部，與所述變性部連接且檢測所述 經變性的血紅蛋白的檢測部，承載與經變性的血紅蛋白衍生物的變性部位特異性地結合的 抗體的免疫測定部；通過所述試劑組合物將所述試樣中的血紅蛋白衍生物變性后，使用所 述抗體對所述經變性的血紅蛋白衍生物進行免疫測定來檢測。 此外，本發明的權利要求23的分析器件的特征在于，權利要求22所述的測定試劑 盒中，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金屬鹽。 此外，本發明的權利要求24的分析器件是權利要求22所述的分析器件，其特征在
于，所述金屬鹽的濃度是不會顯著地妨礙血紅蛋白衍生物的免疫測定的濃度。 此外，本發明的權利要求25的分析器件是權利要求22所述的分析器件，其特征在
于，所述血紅蛋白衍生物是血紅蛋白Alc。 此外，本發明的權利要求26的分析器件是權利要求22所述的分析器件，其特征在 于，算出所述血紅蛋白中的血紅蛋白衍生物的存在比例。 此外，本發明的權利要求27的分析系統的特征在于，由權利要求22所述的分析器 件和用于對在所述分析器件的檢測部被檢出的所述血紅蛋白衍生物的量進行測定的測定 部構成。
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此外，為了解決所述課題，本發明的權利要求28所述的凝集試劑的制造方法是使受控的數量的配體與分子量6萬以上的具有高級結構的蛋白質以化學方式結合的凝集試劑的制造方法，其特征在于，使所述配體介以具有官能團的連接物與所述蛋白質結合。
此外，本發明的權利要求29所述的凝集試劑的制造方法是權利要求28所述的凝集試劑的制造方法，其特征在于，所述蛋白質是球蛋白樣蛋白。 此外，本發明的權利要求30所述的凝集試劑的制造方法是權利要求28所述的凝
集試劑的制造方法，其特征在于，所述具有官能團的連接物的長度在15A以下。 此外，本發明的權利要求31所述的凝集試劑的制造方法是權利要求28所述的凝
集試劑的制造方法，其特征在于，所述連接物具有直鏈結構。 此外，本發明的權利要求32所述的凝集試劑的制造方法是權利要求28所述的凝集試劑的制造方法，其特征在于，所述連接物具有平面結構。 此外，本發明的權利要求33所述的凝集試劑的制造方法是權利要求28所述的凝集試劑的制造方法，其特征在于，所述配體是識別特異的蛋白作為結合對象的物質。
此外，本發明的權利要求34所述的凝集試劑的制造方法是權利要求28所述的凝集試劑的制造方法，其特征在于，所述連接物是半抗原。 此外，本發明的權利要求35所述的凝集試劑的制造方法是權利要求28所述的凝集試劑的制造方法，其特征在于，所述凝集試劑是平均1個蛋白質結合有10個以上的配體的復合物。 此外，本發明的權利要求36所述的凝集試劑或生成物的特征在于，通過權利要求28 35中的任一項所述的凝集試劑的制造方法生成。 此外，本發明的權利要求37所述的分析對象的測定方法是進行粒子凝集抑制免疫測定來測定試驗試樣中的分析對象的測定方法，其特征在于，包括將與水懸浮性粒子結合的抗分析對象抗體與試驗試樣混合，使所述抗分析對象抗體與該試驗試樣中所含的分析對象結合的工序；將混合有所述與水懸浮性粒子結合的抗分析對象抗體和試驗試樣的溶液與凝集試劑混合，通過所述凝集試劑使未與所述試驗試樣中所含的分析對象結合的抗分析對象抗體凝集的工序，所述凝集試劑通過使具有對所述抗分析對象抗體具有特異性的結合部位的配體介以具有官能團的連接物與分子量6萬以上的具有高級結構的蛋白質以化學方式結合而形成；檢測由所述抗分析對象抗體與凝集試劑的反應而生成的凝集塊，對所述試驗試樣中的分析對象進行定量的工序。 此外，本發明的權利要求38所述的分析對象的測定方法是權利要求37所述的分析對象的測定方法，其特征在于，所述分析對象是血紅蛋白Alc，所述配體是與血紅蛋白Alc中的肽序列對應的糖化肽。 此外，本發明的權利要求39所述的分析對象的測定方法是權利要求37所述的分析對象的測定方法，其特征在于，所述凝集試劑的使用量為抗原過量的量，即在前帶(prozone)區域中。 此外，本發明的權利要求40所述的分析對象的測定方法是權利要求37所述的分析對象的測定方法，其特征在于，通過光學測定來檢測所述凝集塊的濁度。
此外，本發明的權利要求41所述的分析對象的測定方法是權利要求37所述的分析對象的測定方法，其特征在于，通過計數所述凝集塊來進行檢測。
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此外，本發明的權利要求42所述的試驗試劑盒是用于進行粒子凝集抑制免疫測定來測定試驗試樣中的分析對象的試驗試劑盒，其特征在于，保有與水懸浮性粒子結合的抗分析對象抗體和凝集試劑，所述凝集試劑通過使具有對抗分析對象抗體具有特異性的結合部位的配體介以具有官能團的連接物與分子量6萬以上的具有高級結構的蛋白質以化
學方式結合而形成。 此外，本發明的權利要求43所述的試驗試劑盒是權利要求42所述的試驗試劑盒，其特征在于，所述與水懸浮性粒子結合的抗分析對象抗體和所述凝集試劑以干燥狀態承載。 此外，本發明的權利要求44所述的分析器件是用于進行粒子凝集抑制免疫測定
來測定試驗試樣中的分析對象的分析器件，其特征在于，包括用于注入所述試驗試樣的試
樣注入部；與所述試樣注入部連接，用于在所述已注入的試樣中混合與水懸浮性粒子結合
的抗分析對象抗體和凝集試劑，通過所述凝集試劑使未與所述試驗試樣中所含的分析對象
結合的抗分析對象抗體凝集的凝集部，所述凝集試劑通過使具有對所述抗分析對象抗體具
有特異性的結合部位的配體介以具有官能團的連接物與分子量6萬以上的具有高級結構
的蛋白質以化學方式結合而形成；與所述凝集部連接，用于檢測由所述抗分析對象抗體與
所述凝集試劑的反應而生成的凝集塊，對所述試驗試樣中的分析對象進行定量的測定部。 此外，本發明的權利要求45所述的分析器件是權利要求44所述的分析器件，其特
征在于，所述分析對象是血紅蛋白Alc，所述配體是與血紅蛋白Alc中的肽序列對應的糖化肽。 此外，本發明的權利要求46所述的分析器件是權利要求44所述的分析器件，其特征在于，所述凝集試劑的承載量是抗原過量的量，即在前帶區域中。 此外，本發明的權利要求47所述的分析器件是權利要求44所述的分析器件，其特征在于，所述與水懸浮性粒子結合的抗分析對象抗體或者所述凝集試劑以干燥狀態承載。
此外，本發明的權利要求48所述的分析器件是權利要求44所述的分析器件，其特征在于，在所述測定部中，通過光學測定來檢測所述凝集塊的濁度。 此外，本發明的權利要求49所述的分析器件是權利要求44所述的分析器件，其特征在于，在所述測定部中，通過計數所述凝集塊來進行檢測。 此外，本發明的權利要求50所述的分析器件是權利要求44所述的分析器件，其特征在于，所述測定部和所述凝集部形成為一體。 如果采用本發明，通過使用非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽，可以更迅速且可靠地進行血紅蛋白的變性。 此外，特別是非離子型表面活性劑的一大特點是，通過免疫法測定血紅蛋白衍生
物時，對免疫測定的阻礙效果少。由于該特點，例如不需要用離子型表面活性劑對血紅蛋白
進行變性處理時所需的變性處理溶液的稀釋操作，可以排除測定精度因稀釋不均而下降的
問題。此外，因為不需要稀釋操作，所以可以構筑更簡潔的形態的免疫測定系統。 此外，通過同時測定血紅蛋白和血紅蛋白衍生物，可以算出血紅蛋白衍生物相對
于血紅蛋白的存在比例。 此外，試劑組合物的形態可以是液體狀、固體狀、將液體干燥而得的狀態中的任一種，通過將試劑組合物與含血紅蛋白衍生物的試樣液混合，可以將血紅蛋白衍生物變性并進行測定。 此外，通過采用組合有血紅蛋白衍生物的測定所需的試劑和采血器具、使用說明書等的測定試劑盒的形式，即使不具備專業的知識，也可以實現更簡便的血紅蛋白衍生物的測定。 此外，通過進一步設計承載有血紅蛋白衍生物的測定所需的試劑的分析器件，構筑與專用的分析裝置組合而成的分析系統，從而可以實現不易受手法的影響的簡便且迅速的血紅蛋白衍生物的測定。 此外，如果采用本發明的凝集試劑，通過蛋白質的高級結構，與水懸浮性粒子結合
的抗分析對象抗體和通過使具有對抗分析對象抗體具有特異性的結合部位的配體介以具
有官能團的連接物與分子量6萬以上的具有高級結構的蛋白質以化學方式結合而形成的
凝集試劑凝集的凝集反應速度加快，可以縮短凝集抑制免疫測定的測定時間。此外，凝集試
劑的保存穩定性提高，可在室溫下保存，所以不需要通過冷藏進行保存。 附圖的簡單說明 圖1是表示本發明的實施方式4的分析系統的構成的圖。 圖2是表示本發明的實施方式4的圖1所示的分析系統中使用的分析器件的具體構成的圖，圖2(a)是其分解立體圖，圖2(b)是表示該分析器件中添加有試劑的狀態的立體圖。 圖3是表示本發明的實施方式4的分析系統的另一構成的圖。 圖4是表示本發明的實施方式4的圖3所示的分析系統中使用的分析器件的具體
構成的圖，圖4(a)是其分解立體圖，圖4(b) (d)是表示分析器件的測定步驟的圖。 圖5分別表示本發明的實施例1中在非離子型表面活性劑和氧化劑中添加各種金
屬鹽而產生的血紅蛋白的吸收特性的經時變化，圖5(a)表示作為金屬鹽添加了 KC1的情
況，圖5(b)表示作為金屬鹽添加了 NaCl的情況，圖5(c)表示作為金屬鹽添加了 Na2S04的情況。 圖6分別表示本發明的實施例1中在非離子型表面活性劑和氧化劑中添加各種金屬鹽而產生的血紅蛋白的吸收特性的經時變化，圖6(a)表示作為金屬鹽添加了 MgCl2的情況，圖6(b)表示作為金屬鹽添加了 MgS04的情況，圖6(c)表示作為金屬鹽添加了 CaCl2的情況。 圖7是表示本發明的實施例1中SLS-血紅蛋白法和用非離子型表面活性劑、氧化
劑、金屬鹽處理的方法中的血紅蛋白與吸收特性的關系的圖。 圖8是說明本發明的實施例2中各金屬鹽對免疫反應產生的影響的圖。 圖9是表示本發明的實施例3中通過分析系統和自動糖化血紅蛋白分析計測定血
液標本A、B而得的結果的圖。 圖10是本發明的凝集試劑的示意圖。 圖11是表示凝集試劑濃度與吸光度變化的關系的圖。 圖12是表示由凝集試劑的種類產生的凝集速度的差異的圖。 圖13是表示由凝集試劑的種類產生的保存穩定性的差異的圖。 圖14是現有的凝集試劑的示意圖。 實施發明的最佳方式
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以下，對本發明的血紅蛋白或血紅蛋白衍生物的測定方法進行詳細說明。
(實施方式1) 本發明的實施方式1中，對包括將含血液成分的試樣用非離子型表面活性劑、氧 化劑和金屬鹽進行處理而使所述試樣中的血紅蛋白變性的工序的血紅蛋白的測定方法和 血紅蛋白衍生物的測定方法進行說明。 所述血紅蛋白(下面也記作"Hb")是指以a鏈和非a鏈(13 、 Y、 S鏈)的球
蛋白與血紅素結合并復合而形成的四聚體結構為基礎的蛋白質。其種類多樣，特別是結合 有糖的HbAl、由飲酒產生的乙醛化Hb、見于透析患者等的氨基甲酰化Hb等。其中，在血紅 蛋白的P鏈N末端結合有血液中的葡萄糖的血紅蛋白Alc公知為反映過去2 3個月內 的血液中的葡萄糖濃度的指標。由此，本實施方式l的血紅蛋白衍生物是指如前所述的血 紅蛋白的一部分區域經修飾的結構不同的衍生物。 此外，測定本實施方式1的血紅蛋白衍生物時，必須區分、識別該血紅蛋白衍生物 的有細微差別的區域，對各種血紅蛋白衍生物進行鑒定和定量。另外，本實施方式l中將 使該血紅蛋白衍生物的差異部分、即血紅蛋白衍生物的特異性部位從蛋白質的結構內暴露 至結構外的處理稱為"變性"，且將該蛋白質的從結構內暴露出來的部位稱為"經變性的部 位"。 另外，本實施方式1中，使用非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽進行該變性處
理。在這里，氧化劑具有氧化血紅蛋白而使其轉化為正鐵血紅蛋白的形態的作用，非離子型
表面活性劑具有使正鐵血紅蛋白變性的作用，金屬鹽具有促進這些作用的效果。因此，本發
明中所指的血紅蛋白的變性也包括血紅蛋白變化為正鐵血紅蛋白的形態的現象。 此外，金屬鹽也是在血紅蛋白衍生物的免疫測定中起到重要作用的試劑。即，蛋白
質的立體結構和抗原抗體反應依賴于氫鍵、靜電力、范德華力、疏水鍵，為了使它們適當地
發揮作用，必須準備適當的金屬鹽濃度的溶液。因此，非常重要的是以具有促進血紅蛋白的
變性的效果且適合于抗原抗體反應的金屬鹽濃度處理試樣液。 關于所述的非離子型表面活性劑和氧化劑，可以使用國際公開第2006/112339號 文本(W02006/112339A1)中所記載的試劑。作為金屬鹽，可以例舉含有Na、 K、 Mg、 Ca等的 金屬離子的試劑。作為這些試劑，可以例舉NaCl、 KC1、 MgS04、 Na2S04、 MgCl2、 CaCl2等，但只 要是堿金屬鹽或堿土金屬鹽等金屬鹽即可，并不限定于這些例子。此外，在這里，堿金屬鹽 是指由第l族元素構成的化合物，堿土金屬鹽是指由第2族元素構成的化合物。此外，金屬 鹽的濃度采用不會顯著地妨礙血紅蛋白衍生物的免疫測定的濃度。 此外，本實施方式1中，"用非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽進行處理"是指 調制滿足用于獲得所需的變性效果的條件的含非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽的溶 液并加入含血紅蛋白的標本中，或者將血液標本加入所述滿足用于獲得所需的變性效果的 條件的含非離子型表面活性齊U、氧化劑和金屬鹽的溶液。還有，將血液標本加入含非離子型 表面活性劑、氧化劑和金屬鹽的溶液的情況下，該非離子型表面活性劑不僅具有變性效果， 還兼具破壞紅細胞膜而使血紅蛋白溶出(稱為"溶血")的效果。 另外，用非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽進行處理的方法也包括如下的方 法以滿足用于獲得所需的變性效果的條件的方式，將由非離子型表面活性劑、氧化劑和金 屬鹽形成的固體的試劑直接加入所述含血紅蛋白衍生物的標本或血液標本。
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還有，所述"固體的"可以是干燥物，作為干燥方法，可以例舉風干、熱干燥、真空干 燥、真空冷凍干燥等。 并且，在如前所述用非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽對含血紅蛋白衍生物 的標本或血液標本進行處理而使試樣中的血紅蛋白變性后，以540nm附近的波長測定總血 紅蛋白，對于該經變性的血紅蛋白衍生物，使用識別因變性而暴露至血紅蛋白的結構外的 區域的抗體通過免疫測定法進行測定。藉此，可以算出試樣中的血紅蛋白衍生物相對于血 紅蛋白的存在比例。 在這里，本實施方式1中的血紅蛋白衍生物的測定方法的巨大優點在于，可以在 將對免疫反應的影響抑制至最低限度的同時，進行利用對用非離子型表面活性劑、氧化劑 和金屬鹽進行了處理的血紅蛋白衍生物的變性部位具有特異性的抗體的免疫測定。即，本 實施方式1中，可以在將對該免疫反應的影響抑制至最低限度的同時，將確定血紅蛋白衍 生物的特異性區域(變性部位)暴露至血紅蛋白的結構外，所以可以實施更具特異性的測 定，且伴隨抗原抗體反應的復合物的形成中位阻減小，因此也可以使抗原抗體反應的反應 效率提高。 本實施方式1中的免疫測定只要是測定原理以抗原抗體反應為基礎即可，可以是 公知的免疫比濁法、免疫散射比濁法、膠乳免疫凝集法、免疫凝集抑制法、膠乳免疫凝集抑 制法、熒光免疫測定法、化學發光免疫測定法、電化學免疫測定法、熒光偏光免疫測定法、免 疫色譜法中的任一種。 另外，所述的血紅蛋白衍生物中經常測定的是血紅蛋白Alc，近年來成為用于管理 作為三大成人病之一成為難題的糖尿病的患者的指標，作為1 3個月內的長期血糖控制 的基準。 如上所述，根據基于本實施方式1的血紅蛋白或血紅蛋白衍生物的測定方法，包
括將含血液成分的試樣用非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽進行處理而使所述試樣中
的血紅蛋白變性的工序，所以可以迅速且可靠地使試樣中的血紅蛋白變性。 此外，本實施方式1中，不使用有害的試劑，所以可以更安全地進行血紅蛋白衍生
物的測定。此外，所述非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽對于免疫反應的阻礙效果少，
因此在變性處理后通過免疫反應測定血紅蛋白衍生物的量時，不需要對該變性處理后的溶
液進行稀釋操作，可以防止稀釋引起的測定精度的下降，同時也可以大幅提高使用者的操
作性。特別是由非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽形成的固體的試劑是在干燥狀態下
穩定的試劑，所以也適合用于分析器件。(實施方式2) 本實施方式2關于至少包含非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽的用于測定血 紅蛋白或血紅蛋白衍生物的試劑組合物。在這里，作為血紅蛋白衍生物的一例，如實施方式 1中所說明，假定對血紅蛋白Alc進行測定。 該試劑組合物可以是液體狀或固體的混合物，也可以是使所述液體狀的試劑組合 物干燥而得的組合物。僅通過將該試劑組合物與含血紅蛋白的試樣溶液混合，就可使血紅 蛋白變性。因此，包含非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽的試劑組合物可成為用于簡易 地測定血紅蛋白和血紅蛋白衍生物的最基本的要素。在這里，金屬鹽為堿金屬鹽或堿土金 屬鹽。此外，金屬鹽的濃度采用不會顯著地妨礙血紅蛋白衍生物的免疫測定的濃度。
此外，非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽不論在液體狀或固體狀的情況下，都 能以混合狀態或各試劑獨立的狀態準備。只要是至少在測定血紅蛋白前這3種試劑溶入試 樣液的構成即可。 以溶液狀態使用該試劑組合物的情況下，通過冷藏或遮光，可使試劑的穩定性進
一步提咼o 還有，經干燥的試劑組合物的保存性比溶液狀態的試劑組合物好，可長期保存。
使試劑組合物干燥時，可以采用風干、熱干燥、真空干燥、真空冷凍干燥等方法，特 別是進行冷凍干燥時，可通過冷凍該試劑組合物的容器的形狀來制成各種設計的試劑組合 物。此外，如果進行真空冷凍干燥，則可使溶解性進一步提高。 此外，使用鐵氰化鉀作為氧化劑情況下，通過遮光以及在干燥狀態下保存，可以制 成更長期穩定的試劑組合物。 如上所述，根據本實施方式2的用于血紅蛋白或血紅蛋白衍生物的測定方法的試 劑組合物，至少包含非離子型表面活性劑、氧化物和金屬鹽，所以可以迅速且可靠地進行所 述血紅蛋白的變性處理。 另外，因為所述試劑組合物還包含對所述血紅蛋白衍生物的經變性的部位具有特 異性的抗體，所以可通過使所述試劑組合物與所述試樣混合來檢測血紅蛋白衍生物，具有 可提高使用者的操作性的效果。
(實施方式3) 本實施方式3關于至少保有包含非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽的試劑組
合物，用于通過該試劑組合物測定血紅蛋白和血紅蛋白衍生物的測定試劑盒。在這里，作為
血紅蛋白衍生物的一例，如實施方式1中所說明，假定對血紅蛋白Alc進行測定。 測定試劑盒是指組合有血紅蛋白和血紅蛋白衍生物的測定所需的試劑和構件的
試劑盒。具體是指組合有血紅蛋白和血紅蛋白衍生物的測定所需的試劑以及使用說明書、
剌血針或注射器等采血用具、采血前后所需的消毒用品、用于添加試劑的分配器和吸液玻
璃管等稱量器具等構件的試劑盒，可以使用這些試劑及構件，采集作為檢查對象的試樣并
定量稀釋，進行該試樣的變性處理等后，使用臨床用的自動測定機或分光光度計等，簡便地
測定血紅蛋白和血紅蛋白衍生物。 測定試劑盒中，直至血紅蛋白的變性、甚至是其測定為止的方法按步驟劃分，所以 只要按照使用說明書，即使不具備專業的知識，也可以簡便地使用。此外，所述的血紅蛋白 和血紅蛋白衍生物的測定所需的試劑是指至少包含非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽 的試劑，藉此可以迅速且可靠地進行血紅蛋白的變性。在這里，金屬鹽為堿金屬鹽或堿土金 屬鹽。此外，金屬鹽的濃度采用不會顯著地妨礙血紅蛋白衍生物的免疫測定的濃度。
另外，所述測定試劑盒可以承載對血紅蛋白衍生物具有特異性的抗體。S卩，可考慮 由以下的部分構成的測定試劑盒使血紅蛋白溶血、變性的包含非離子型表面活性劑、氧化 劑和金屬鹽的試劑組合物；用于檢測血紅蛋白衍生物的具有對所述血紅蛋白衍生物的經變 性的部位有特異性的抗體的試劑，例如使用膠乳凝集抑制反應時為膠乳標記抗體和凝集多 價抗原的凝集試劑。通過將這些試劑類分別封入容器，將血紅蛋白衍生物的溶血及變性操 作以及免疫測定操作按步驟劃分，可以更簡便地測定血紅蛋白衍生物。還有，這里以膠乳凝 集抑制反應為例，但只要是將血紅蛋白變性并使用對該血紅蛋白衍生物的經變性的部位具
15有特異性的抗體對該經變性的血紅蛋白衍生物量進行免疫測定的方法即可，并不限定于上 述方法。 此外，所述測定試劑盒中保有的所述試劑組合物和所述抗體可以分別保有，也可 以將該抗體包含在試劑組合物中保有。 如上所述，根據本實施方式3的測定試劑盒，試樣中的血紅蛋白或血紅蛋白衍生
物的測定所需的試劑的一部分或全部被分別封入容器等，所以可以按照事先確定的步驟進
行溶血和血紅蛋白的變性，再使用特異性地識別經變性的血紅蛋白衍生物的試劑來測定經
變性的血紅蛋白衍生物量，即使使用者不具備專業的知識，也可以更簡便地進行血紅蛋白
或血紅蛋白衍生物的測定。(實施方式4) 本實施方式4關于用于測定血紅蛋白和血紅蛋白衍生物的分析器件，該分析器件
至少包括添加試樣的試樣添加部位；通過非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽使所述
試樣中的血紅蛋白變性的變性部；檢測該經變性的血紅蛋白的檢測部；承載與經變性的血
紅蛋白衍生物的變性部位特異性地結合的抗體，檢測血紅蛋白衍生物的檢測部。在這里，作
為血紅蛋白衍生物的一例，如實施方式1中所說明，假定對血紅蛋白Alc進行測定。 關于分析器件，可以與評價該分析器件的測定裝置組成套裝，采用分析系統的形
態。通過采用該形態，可以更簡便且迅速地測定血紅蛋白及血紅蛋白衍生物。 本實施方式4的分析器件采用在承載非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽的同
時承載有對血紅蛋白衍生物的經變性的部位具有特異性的試劑和凝集試劑的形態，還可以
采用將它們分別承載于不同地方的形態。 在這里，金屬鹽為堿金屬鹽或堿土金屬鹽。此外，金屬鹽的濃度采用不會顯著地妨 礙血紅蛋白衍生物的免疫測定的濃度。 作為測定的順序，首先使血液標本與非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽反應 的血紅蛋白的變性工序后，有以下的工序測定血紅蛋白，使該經變性的血紅蛋白衍生物與 對該血紅蛋白衍生物的經變性的部位具有特異性的試劑、例如將對血紅蛋白衍生物具有特 異性的抗體標記于膠乳而得的膠乳標記抗體及凝集試劑反應。 可以使所述膠乳標記抗體和凝集試劑同時與用非離子型表面活性齊U、氧化劑和金
屬鹽進行了處理的試樣溶液反應，也可采用使試樣溶液與膠乳標記抗體反應后再與凝集試
劑反應的方法或者將試樣溶液與凝集試劑混合后再與膠乳試劑反應的方法。 接著，在這樣使試劑反應后，測定反應液的吸光度的變化，從而算出血紅蛋白衍生
物的量。 藉此，可以算出血紅蛋白衍生物相對于血紅蛋白的存在比。 作為分析器件的形狀，重要的是可順利地推進所述的一系列的反應及測定。 作為分析器件的一例，例如可考慮利用離心力和毛細管力的器件，藉由通過分析
器件內形成的室(空間)與室之間形成的流路自由地輸送液體試樣，可以控制測定的順序
和試劑容量、反應時間等。另外，作為評價這樣的構成的分析器件的裝置的一例，可以例舉
裝載有可使所述分析器件旋轉的旋轉機構和可測定吸光度的光學測定機構的裝置。
以下，使用圖1、圖2，對所述的分析器件和包括該分析器件的分析系統的一構成
例進行說明。
圖1是表示本發明的實施方式4的分析系統的構成的圖。分析系統100的構成包 括分析器件101、自光源102對該分析器件101照射光并用檢測器103測定透射光的測定部 110、在挖去了其一部分的位置固定該分析器件101的旋轉基板104、使該旋轉基板104旋轉 的電動機105。還有，圖1中省略了與電動機105的驅動機構、光源102、檢測器103連接的 電路構成。 圖2 (a)、圖2 (b)是表示所述分析器件101的具體構成的圖，圖2 (a)是其分解立體 圖，圖2(b)是表示添加有試劑的狀態的圖。 分析器件101由下基板201、上基板213、在正反兩面具有粘接效果的粘接層202 構成，通過將它們粘合而形成。所述下基板201采用透明的樹脂基板，通過注塑成形等高精 度地形成有各種形狀的空間。具體來說，所述下基板201中，通過注塑成形在其上表面成形 有用于形成作為用于使血紅蛋白衍生物變性的變性部位的稀釋攪拌部203、稀釋液保持部 204、用于檢測所添加的血紅蛋白的量的檢測部A205、作為用于檢測該經變性的血紅蛋白衍 生物的量的檢測部位的檢測部B206的凹部。另外，作為所述下基板201的樹脂的原材料， 只要是透光的材質即可，作為一例，可以例舉聚碳酸酯、聚苯乙烯、丙烯酸類等塑料樹脂。
此外，粘接層202中，除了所述稀釋攪拌部203、稀釋液保持部204、檢測部A205、檢 測部B206的圖案形狀之外，還切去了連接它們的流路207的圖案形狀。另外，所述檢測部 A205及檢測部B206之前的流路207以將其一部分擴大的方式切去，藉此形成對向所述檢 測部A205及檢測部B206輸送的液量進行定量的定量部A208及定量部B209。作為粘接層 202的獲得粘接效果的材料，除了粘接劑之外，還可以使用可通過加熱而粘接的熱熔片等， 所述上基板213由透明的樹脂基板構成。 對于所述分析器件IOI，在粘合所述下基板201與所述粘接層202后、粘合所述上 基板213前，如圖2(b)所示，在所述下基板201的稀釋攪拌部203中承載由非離子型表面 活性劑、氧化劑和金屬鹽形成的變性試劑210，并在由所述下基板201和粘接層202形成的 定量室B209中承載可與血紅蛋白衍生物的經變性的部位特異性地反應的膠乳試劑211，再 在所述檢測部B206中承載由使多個血紅蛋白衍生物的特異性的表位結構結合而得的合成 多價抗原形成的凝集試劑212后，通過真空冷凍干燥使其干燥，然后將所述上基板213粘合 于所述粘接層202的上表面。此外，通過依次粘合所述下基板201、所述粘接層202、所述上 基板213而形成的在該粘接層202切出的流路207的2個開口部分別成為標本注入口 215 和稀釋液注入口 216。 下面，對所述分析系統100的動作進行說明。 試樣的分析中，例如使用分配器等，由分析器件101的標本注入口 215注入1 ii L 血液，并由稀釋液注入口 216注入500iiL稀釋液。藉此，血液被保持于標本注入口 215內 側的流路內，且稀釋液被保持于稀釋液保持部204。 接著，將注入有血液和稀釋液的分析器件101設置于所述旋轉基板104的被挖去 的位置，通過電動機105以規定的轉速旋轉一定時間。通過該旋轉，稀釋液和血液被送至所 述稀釋攪拌部203并混合而形成稀釋試樣液，通過非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽 的作用溶血，然后引發血紅蛋白的變性。 接著，通過停止旋轉基板104的旋轉，藉由毛細管現象將該試樣液通過流路207輸 送至定量部A208和定量部B209。
被送至所述定量部B209的試樣液在該定量部B209中與預先保有的膠乳試劑211 混合，膠乳試劑211與該試樣液中的血紅蛋白衍生物結合。 然后，再次通過電動機105使所述旋轉基板104以規定的轉速旋轉一定時間后， 被送至所述定量部A208的試樣液被送至檢測部A205，同時在所述定量部B209與膠乳試劑 211混合了的試樣液被送至檢測部B206。 承載于所述檢測部B206的凝集試劑212與未同血紅蛋白衍生物結合的膠乳試劑 結合，發生與血紅蛋白衍生物的濃度對應的膠乳凝集抑制反應。 一定時間后，實施檢測部 B206的透射光測定，從而檢測膠乳凝集抑制反應。 此外，同時測定檢測部A205，從而可以測定血紅蛋白的吸收，算出血紅蛋白濃度。所述檢測部B206中的膠乳凝集抑制反應的測定可通過600nm附近的波長進行，所
述檢測部A205中的血紅蛋白的測定可測定540nm附近的血紅蛋白吸收。 不論是哪一種情況，如果以事先確定的濃度的血紅蛋白和血紅蛋白衍生物的測定
結果為基礎，預先制成校正曲線，則可利用該校正曲線分別求出血紅蛋白和血紅蛋白衍生
物的濃度，也可以將該血紅蛋白的濃度和血紅蛋白衍生物的濃度相互關聯，算出血紅蛋白
衍生物的存在比。 在這里，作為一例，可以例舉具有分析器件101呈芯片狀、通過利用離心力和毛細 管力的液體輸送來控制測定體系的順序和試劑量、反應時間等的分析器件的分析系統，但 只要是可控制測定體系的順序和試劑量、反應時間的形狀即可，并不限定于該構成及方法， 對于液體輸送，例如可以采用使用泵以壓力進行液體輸送的方法等。此外，所述分析器件例 如可以是色譜法形態，更簡單的話，即使是長方體的塑料制盒的形狀，通過改進試劑的承載 方法也足以使用。 以下，使用圖3和圖4，對更簡單的構成的分析器件及采用該分析器件的分析系統 進行說明。 圖3是表示本發明的實施方式4的分析系統的另一構成的圖。分析系統300包括 自光源308對該分析器件301照射光并通過受光部309檢測透射光的測定部310。還有， 圖3中，省略了連接光源308和受光部309的電路構成或者用于將該分析器件301設置于 所述分析系統中的構成。 圖4(a) (d)是表示所述分析器件301的具體構成的圖，圖4(a)是其分解立體
圖，圖4(b) (d)是表示所述分析器件301中的試劑的變性處理步驟的圖。 分析器件301由具有用于注入血液標本的注入口 306的下部盒302b、用于將該下
部盒302b的開放的底面密閉的溶液試劑用密封材料305、上部盒302a、用于將所述注入口
306密閉的盒用密封材料307構成，通過用粘接劑將所述上部盒302a與下部盒302b的開放
的底面相互粘合而形成。 所述下部盒302b為底面開放的塑料制的長方體盒，如圖4B所示，在由非離子型表 面活性劑、氧化劑和金屬鹽及凝集試劑形成的試劑中添加對所述血紅蛋白衍生物的經變性 的部位具有特異性的抗體而得的試劑304通過溶液試劑用密封材料305密封而保持于其 中。 所述上部盒302a是形狀與所述下部盒302b大致相同的底面開放的塑料制的長方 體盒，如圖4B所示，可與血紅蛋白衍生物特異性地反應的膠乳試劑303經真空冷凍干燥而承載在其上端。 下面，對所述分析系統300的動作進行說明。 試樣的分析中，例如使用分配器等，在下部盒302b中注入包含非離子型表面活性 劑、氧化劑、金屬鹽及凝集試劑的試劑304，通過所述溶液試劑用密封材料305將該下部盒 302b密閉后，如圖4 (b)所示，通過粘接劑將該下部盒302b與所述承載有膠乳試劑的上部盒 302a粘合。將所述溶液試劑用密封材料305剝離后，例如使用分配器等，由所述注入口 306 注入O. 5iiL血液標本，如圖4(c)所示，通過盒用密封材料307將所述注入口 306密閉。接 著，以承載于所述上部盒302a的上端的膠乳試劑303不與所述試劑304接觸的方式，將所 述血液標本與試劑304溫和地混合，放置規定時間。還有，還算出血紅蛋白濃度的情況下， 這時將所述分析器件301如圖3所示設置于分析系統300中，通過測定部310測定540nm 附近的吸光度。 接著，如圖4(d)所示，使所述分析器件301的下部盒302b位于上方，使所述膠乳 試劑303混合于添加有血液標本的試劑304中，放置規定時間。 經過規定時間后，將所述分析器件301如圖3所示設置于分析系統300中，通過測
定部310測定600nm附近的吸光度，從而算出血紅蛋白衍生物的濃度。 如上所述，根據本實施方式4的分析器件，承載有血紅蛋白衍生物的測定所需的
試劑，所以可以進行不易受手法的影響的簡便且迅速的血紅蛋白及血紅蛋白衍生物的測定。 此外，根據本實施方式4的分析系統，將所述分析系統與該分析器件專用的測定 部組合，所以可以進行不易受手法的影響的簡便且迅速的血紅蛋白及血紅蛋白衍生物的測定。(實施例l) 以下，對測定作為血紅蛋白衍生物的代表性檢查項目的血紅蛋白Alc時的實施例 的具體內容進行記述。 首先，對血紅蛋白的變性和血紅蛋白濃度的測定進行說明。 將400 ii L用精制水稀釋至250倍的血液與400 y L相對于0. 3%蔗糖單月桂酸酯 及0. 5%鐵氰化鉀溶解有0 1M的各種濃度的堿金屬鹽的變性試劑液在光路長lcm的塑料 盒內進行攪拌，以535nm的波長觀察血紅蛋白的吸光度的經時變化。其結果示于圖5(a) (c)、圖6(a) (c)。由該結果可知，與僅用蔗糖單月桂酸酯和鐵氰化鉀進行血液處理的情 況相比，通過添加金屬鹽，血紅蛋白的吸光度達到穩定為止的時間明顯得到縮短。現有的方 法中，血紅蛋白的吸收特性達到穩定為止需要近2分鐘時間，而分別如圖5(a) (c)和圖 6(a) (c)所示，通過添加KCl、NaCl、Na2S04、MgCl2、MgS04、CaCl2，還確認血紅蛋白的吸收 特性達到穩定的時間隨著其鹽濃度的升高而縮短的傾向。此外，發現根據試劑的種類的不 同，使血紅蛋白的吸收穩定的時間存在差異。即，如圖5(a)的添加KCl的情況、圖5(b)的添 加NaCl的情況、圖5(c)的添加Na^04的情況所示，K和Na的一價的金屬鹽為了在30秒內 使血紅蛋白的吸收穩定而需要0. 2M以上的濃度，而如圖6 (a)的添加MgCl2的情況、圖6 (b) 的添加MgS04的情況、圖6 (c)的添加CaCl2的情況所示，Mg為0. 1M的濃度時血紅蛋白的吸 收在30秒內穩定，Ca為0. 05M的濃度時血紅蛋白的吸收在30秒內穩定。確認Ca和Mg是 二價的金屬鹽，具有以比一價的金屬鹽更少的濃度使血紅蛋白的吸收穩定的效果。
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此外，對于已知的血紅蛋白濃度的標本，將使用基于SLS-血紅蛋白法的"血紅蛋 白B Test Wako"(和光純藥株式會社(和光純薬株式會社)制)于535nm測定的血紅蛋 白濃度與用O. 15%蔗糖單月桂酸酯、0. 25%鐵氰化鉀和0. 2M NaCl處理同樣的標本并在30 秒后于535nm測定血紅蛋白的方法比較，結果如圖7所示，可確認非常良好的相關性。由以 上的結果可知，通過在蔗糖單月桂酸酯和鐵氰化鉀中加入金屬鹽，血紅蛋白的變性迅速進 行，因而在血紅蛋白的吸收特性達到穩定的時間得到縮短的同時，可實現與SLS-血紅蛋白 法同等的準確的血紅蛋白測定。
(實施例2) 接著，確認金屬鹽對膠乳凝集反應產生的影響。 在含0. 15%蔗糖單月桂酸酯和0. 25%鐵氰化鉀的膠乳試劑溶液中分別加入各種 濃度的KC1、 NaCl、 Na2S04、 MgCl2、MgS04、 CaCl2后，加入由凝集多價抗原形成的凝集試劑，測 定1分鐘后的550nm的吸光度的變化量。其結果示于表8。 由該結果可知，膠乳凝集反應中，金屬鹽的濃度越高，則凝集反應性越高，鹽濃度 達到一定濃度以上后，凝集反應性穩定。特別是血紅蛋白的吸收特性迅速穩定的各種鹽濃 度中，未發現凝集反應性下降的傾向，沒有發現金屬鹽對免疫反應產生的不良影響。由以上 的結果可知，通過在蔗糖單月桂酸酯和鐵氰化鉀中加入金屬鹽，免疫測定系統不受阻礙，可 以進行準確的血紅蛋白衍生物的測定。
(實施例3) 以下，對采用圖3所示的分析系統的血紅蛋白及血紅蛋白衍生物的測定進行說 明。
(a)分析器件的制作 首先，如圖4(b)所示，通過真空冷凍干燥使由包含可與血紅蛋白Alc特異性地結 合的膠乳試劑和5X蔗糖的溶液形成的膠乳試劑303承載于如圖4(a)所示的底面開放的長 0. 5cmX寬0. 5cmX高2cm的塑料制的上部盒302a的上端。 接著，如圖4(b)所示，在如圖4(a)所示的與所述上部盒302a同樣形狀的塑料制 的下部盒302b中注入作為試劑304的0. 2mL由0. 15%蔗糖單月桂酸酯、0. 25%鐵氰化鉀 和0. 15M氯化鈉形成的溶液以及用作凝集試劑的合成多價血紅蛋白Alc抗原，用溶液試劑 用密封材料305密封后，用粘接劑將所述上部盒302a和所述下部盒302b以開放的底面相 互對準的方式粘合，從而形成分析器件301。
(b)分析 首先，將溶液試劑用密封材料305剝離，由分析器件301的注入口 306注入0. 5 y L 的血液標本，如圖4(c)所示，通過在該注入口 306粘貼盒用密封材料307，從而將分析器件 301密閉。 接著，以承載于所述上部盒302a的膠乳試劑303不與試劑304接觸的方式，將血 液標本與試劑304溫和地混合，在該狀態下放置30秒后，如圖3所示，將分析器件301設置 于分析系統300內，通過所述測定部310測定535nm的吸光度。 接著，如圖4(d)所示，使分析器件301反轉，使所述上部盒302a的膠乳試劑303 與試劑304混合溶解后，如圖3所示，將所述分析器件301設置于分析系統300中，溶解所 述膠乳試劑303之后1分鐘后，通過測定部310測定550nm的吸光度。
對于測定部310略去詳細的說明，從光源308對分析器件301照射光，通過受光部309檢測透射光。還有，作為測定部310的一例，使用分光光度計的功能就足夠，所以詳細的說明省略。還有，在這里，以535nm的波長測定氰化正鐵血紅蛋白，以550nm的波長測定膠乳凝集。對2種血液標本A和B進行這一系列的測定動作。 然后，通過將如前所述得到的吸光度值代入以所述分析系統300利用已知濃度的血紅蛋白及血紅蛋白Alc溶液預先制成的氰化正鐵血紅蛋白的校正曲線以及血紅蛋白Alc的膠乳凝集抑制反應的校正曲線，求出所述血液標本A、 B各自的血紅蛋白濃度及血紅蛋白Alc濃度。 圖9是表示血液標本A、B各自的血紅蛋白Alc濃度及血紅蛋白濃度以及血紅蛋白Alc的存在比的圖。 如圖9所示，通過本分析系統300測定血紅蛋白Alc所占比例的結果是，血液標本A為4.9，血液標本B為10.3，分別與預先通過東曹株式會社(東Y—社)的自動糖化血紅蛋白分析計(HLC-723GHbV)測定血紅蛋白Alc所占比例而得的血液標本A為5. 0、血液標本B為10. 5的結果非常接近，確認通過本分析系統300可準確地測定血紅蛋白Alc濃度。
下面，對采用本發明的凝集試劑制造方法及凝集試劑的分析對象測定方法的實施方式及其試驗試劑盒、分析器件進行詳細說明。
(實施方式5) 本發明的實施方式5中，對采用凝集試劑制造方法及凝集試劑的血紅蛋白Alc測
定方法進行說明。 A.配體的制造 本發明的配體只要是識別特異性的蛋白質并將其作為結合對象的物質即可，可以是任意的。作為其代表性例子，可列舉半抗原。本實施方式5中，作為與血紅蛋白Alc中的肽序列對應的糖化肽，將以纈氨酸_組氨酸_亮氨酸_蘇氨酸_半胱氨酸的序列使氨基酸結合而得的肽(以下稱為VHLTC)用作凝集試劑的配體。通過使用該配體，可以與血紅蛋白Alc識別抗體特異性地結合。此外，通過改變該配體，可以制成特異性地識別各種抗體的配體。 B.凝集試劑的制造 本發明的凝集試劑是使受控數量的配體以化學方式介以具有官能團的連接物與分子量6萬以上的具有高級結構的蛋白質結合而得的試劑。此外，該凝集試劑是平均l個蛋白質結合有10個以上的配體的復合物。 在這里，蛋白質只要分子量在6萬以上即可，可以是任意的。作為其代表性的蛋白質的例子，可以例舉Y-球蛋白、甲狀腺球蛋白、白蛋白等球蛋白樣蛋白，但并不限定于這些蛋白質。更理想的是分子量為6萬 30萬左右的蛋白質。 在這里，作為蛋白質，較好是分子量在6萬以上的理由如下。S卩，分子量小于6萬的蛋白質的作為連接物化學結合的部位的氨基數量少，因此無法結合io個以上的配體，存在水懸浮性粒子的凝集反應性下降的缺點。相反地，分子量在6萬以上的蛋白質的作為連接物化學結合的部位的氨基數量多，因此可以結合io個以上的配體，具有水懸浮性粒子的凝集反應性高的優點。 具有官能團的連接物的長度理想的是15A以下。連接物只要具有官能團即可，
21可以是任何所需的連接物，可以具有直鏈結構或平面結構。作為代表性的連接物的例子，可使用N-(6-馬來酰亞胺基己酰氧基)琥珀酰亞胺(以下稱為EMCS)、琥珀酰亞胺基_反式-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-l-羧酸酯(以下稱為SMCC)、N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(以下稱為SIAB)等。
圖10是本發明的實施方式5的凝集試劑的示意圖。 圖10中，本發明的凝集試劑4由分子量6萬以上的蛋白質(載體)1、具有官能團的連接物2、 VHLTC(配體)3構成。該凝集試劑4通過使配體(VHLTC) 3介以具有官能團的連接物2與蛋白質(載體)l結合而制成。這時，預先平均1個載體結合20個左右的配體3。該配體3識別特異性抗體，與抗體結合。l分子凝集試劑的2個以上的配體結合抗體后，這些抗體相互介以凝集試劑結合，不斷凝集。 這樣制成的配體-蛋白質復合物被用作免疫測定中的凝集試劑。
C.膠乳識別抗體的制造 加入過量的抗人HbAlc抗體，使其與聚苯乙烯膠乳粒子結合，再用牛血清白蛋白(以下稱為BSA)封閉，從而制成膠乳標記抗體。該抗人HbAlc抗體識別并結合試驗試樣中的血紅蛋白Alc及凝集試劑的配體(VHLTC)3。此外，通過改變該抗體，可以制成識別各種試驗試樣中的成分及凝集試劑的膠乳識別抗體。 D.采用膠乳免疫凝集抑制法的被檢試樣中的分析對象的測定
為了測定血液標本中的血紅蛋白及血紅蛋白Alc，先稀釋血液標本，用包含非離子型表面活性劑和氧化劑的變性試劑，使其與經稀釋的血液標本混合，使血液標本中的血紅蛋白正鐵化并變性。通過這樣將血紅蛋白正鐵化，可通過540nm附近的吸光度測定血紅蛋白。然后，對于所述經稀釋及變性的標本，以540nm附近的波長測定吸光度，用正鐵血紅蛋白法算出總血紅蛋白量。但是，也可以使用SLS血紅蛋白法等其他血紅蛋白測定法。
接著，為了測定血紅蛋白Alc，將經變性的標本加入標記有抗人HbAlc抗體的膠乳標記抗體。在這里，在標記于該膠乳的抗人HbAlc抗體與血液標本中的血紅蛋白Alc的經變性的部位之間發生抗原抗體反應。然后，在與膠乳標記抗體反應了的標本中加入凝集試劑后，凝集試劑與未同血液標本中的血紅蛋白Alc結合的剩余的抗人HbAlc抗體結合。其結果是，在結合了凝集試劑的部分不斷發生凝集反應，形成凝集塊。反應液中產生的凝集塊的量與血紅蛋白Alc的濃度成相反關系，將該反應稱為膠乳凝集抑制反應。
接著，在一定時間后，為了通過光學測定檢測基于該反應液中產生的凝集塊的濁度，測定測定部的吸光度(A)。此外，在加入凝集試劑前，還預先測定測定部的吸光度(Al)。根據這些吸光度的差(A-A1)算出吸光度變化。
吸光度變化=A-A1
根據該吸光度變化，算出血液標本中的血紅蛋白Alc量。
根據這些結果，可以檢出血液標本中的血紅蛋白Alc相對于血紅蛋白的量，即存
<formula>formula see original document page 22</formula> 根據這樣的本實施方式5的凝集試劑，通過使受控數量的配體以化學方式介以具有官能團的連接物與分子量6萬以上的具有高級結構的蛋白質結合來制造，所以通過蛋白質的高級結構，可以加快與水懸浮性粒子結合的抗分析對象抗體間的凝集反應速度，能夠縮短凝集抑制免疫測定的測定時間。另外，凝集試劑的保存穩定性提高，可在室溫下保存，所以不需要通過冷藏進行保存。
(實施方式6) 本發明的實施方式6中，對至少保有凝集試劑、膠乳標記抗體及變性試劑的用于通過這些試劑測定血紅蛋白和血紅蛋白Alc的試驗試劑盒進行說明。 試驗試劑盒是指組合有血紅蛋白和血紅蛋白Alc的測定所需的試劑和構件的試劑盒。具體是指組合有血紅蛋白和血紅蛋白Alc的測定所需的試劑以及使用說明書、剌血針或注射器等采血用具、采血前后所需的消毒用品、用于添加試劑的分配器和吸液玻璃管等稱量器具等構件的試劑盒，可以使用這些試劑及構件，采集作為檢查對象的試樣并進行定量、稀釋、變性等后，使用臨床用的自動測定機或分光光度計等，簡便地測定血紅蛋白和
血紅蛋白Alc。 試驗試劑盒中，從采血直至測定為止的方法按步驟劃分，所以只要按照使用說明書，即使不具備專業的知識，也可以簡便地使用。此外，所述的血紅蛋白和血紅蛋白Alc的測定所需的試劑是指至少包含凝集試劑、膠乳標記抗體及變性試劑的試劑，藉此可以迅速且可靠地進行血紅蛋白Alc的測定。 此外，所述試驗試劑盒中保有的所述膠乳標記抗體和所述變性試劑可以分別保有，也可以將該變性試劑包含在膠乳標記抗體中保有。 如上所述，根據本實施方式6的試驗試劑盒，試樣中的血紅蛋白Alc的測定所需的
所有試劑被分別封入容器等中保有，所以使用者可以按照事先確定的步驟容易地進行血紅蛋白和血紅蛋白Alc的測定。
(實施方式7) 本發明的實施方式7中，對用于測定血紅蛋白及血紅蛋白Alc的分析器件進行說明，所述分析器件至少由用于注入分析試樣的注入口、用于保持稀釋液的稀釋液收納室、用于使已注入的分析試樣稀釋、變性的稀釋 變性室、用于檢測該經稀釋、變性的血紅蛋白的血紅蛋白測定室、用于使該經稀釋、變性的分析試樣與膠乳標記抗體反應的膠乳反應室、用于使與所述膠乳標記抗體反應了的分析試樣與凝集試劑反應的凝集室以及用于測定分析試樣中的分析對象的測定室構成。 關于分析器件，可以與評價該分析器件的測定裝置組成套裝，采用分析系統的形態。通過采用該形態，可以更簡便且迅速地測定血紅蛋白Alc。 本實施方式7的分析器件是將凝集試劑、膠乳標記抗體及變性試劑分別承載于不同地方的器件。 以下，對本實施方式7的分析器件的測定方法進行說明。 首先，將血液標本與變性試劑混合，進行血液標本的稀釋和變性，然后對于所述經稀釋和變性的血液標本，照射規定波長的光，測定總血紅蛋白。接著，將經稀釋、變性的血液標本與膠乳標記抗體混合，進行抗原抗體反應，進行測定部的空白吸光度的測定。然后，將該混合溶液與凝集試劑混合，使抗分析對象抗體相互凝集，測定由該凝集產生的凝集塊的吸光度。通過這些測定，使用實施方式5中記載的式子算出血紅蛋白Alc。通過這些血紅蛋
23白和血紅蛋白Ale的測定，算出試樣中的血紅蛋白Alc相對于血紅蛋白的量，即存在比例，從而可檢出濃度。 還有，也可以在進行血液標本的稀釋和變性的同時與膠乳標記抗體進行抗原抗體反應。 作為該分析器件的形狀，重要的是可順利地推進所述的一系列的反應及測定。
作為分析器件的一例，例如可考慮利用離心力和毛細管力的器件，藉由通過分析器件內形成的形成于多個室(空間)與該室之間形成的流路自由地輸送液體試樣，可以控制測定的順序和試劑容量、反應時間等。另外，作為評價這樣的構成的分析器件的裝置的一例，可以例舉裝載有可使所述分析器件旋轉的旋轉機構和可測定吸光度的光學測定機構的裝置。 以下，使用圖1、圖2，對所述的分析器件和包括該分析器件的分析系統的一構成例進行說明。 圖1是表示分析系統的構成的圖。分析系統100的構成包括分析器件101、自光源
102對該分析器件101照射光并用檢測器103測定透射光的測定部110、在挖去了其一部分
的位置固定該分析器件101的旋轉基板104、使該旋轉基板104旋轉的電動機105。還有，
圖1中省略了與電動機105的驅動機構、光源102、檢測器103連接的電路構成。 圖2是表示所述分析器件的具體構成的圖，圖2 (a)是其分解立體圖，圖2 (b)是表
示添加有試劑的狀態的圖。 分析器件101通過將下部基板201、上部基板213以在正反兩面具有粘接效果的粘接層202粘合而形成。作為基板的材料，采用透明的樹脂基板，通過注塑成形等高精度地形成有各種形狀的空間。具體來說，所述下基板201中，通過注塑成形在其上表面成形有用于形成作為用于使標本稀釋和變性的部位的稀釋 變性室203、稀釋液收納室204、用于檢測標本中的血紅蛋白的檢測部A205、用于檢測血紅蛋白Alc的檢測部B206的凹部。還有，作為所述上部基板213和所述下部基板201的樹脂的原材料，只要是聚碳酸酯、聚苯乙烯、丙烯酸類等塑料樹脂等透光的材質即可，并不特別限定于此。 此外，粘接層202中，除了所述稀釋*變性室203、稀釋液收納室204、檢測部A205、檢測部B206的圖案形狀之外，還切去了連接它們的流路207的圖案形狀。另外，所述檢測部A205及檢測部B206之前的流路207以將其一部分擴大的方式切去，藉此形成對向所述檢測部A205及檢測部B206輸送的液量進行定量的定量部A208及定量部B209。作為粘接層202的獲得粘接效果的材料，除了粘接劑之外，還可以使用可通過加熱而粘接的熱熔片等。
所述分析器件101如下形成在粘合所述下部基板201與所述粘接層202后、粘合所述上部基板213前，如圖2(b)所示，在所述下部基板201的稀釋 變性室203中承載變性試劑210，并在由所述下部基板201和粘接層202形成的定量室B209中承載膠乳標記抗體211，再在所述檢測部B206中承載凝集試劑212后，使其干燥，然后將所述上部基板213粘合于所述粘接層202的上表面。此外，通過依次粘合所述上部基板213、所述粘接層202、所述下部基板201而形成的在該粘接層202切出的流路207的2個開口部分別成為標本注入口 215和稀釋液注入口 216。
下面，對分析系統100的動作進行說明。 試樣的分析中，例如使用分配器等，由分析器件101的標本注入口 215注入1 ii L血液，并由稀釋液注入口 216注入500iiL稀釋液。藉此，血液被保持于標本注入口 215內側的流路內，且稀釋液被保持于稀釋液收納室204。 接著，將注入有血液和稀釋液的分析器件101設置于所述旋轉基板104的被挖去的位置，通過電動機105以規定的轉速旋轉一定時間。通過該旋轉，稀釋液和血液被送至所述稀釋 變性室203并混合而形成稀釋試樣液，通過變性試劑進行血紅蛋白的正鐵化和變性。 接著，通過停止旋轉基板104的旋轉，藉由毛細管現象將經正鐵化和變性的該試樣液通過流路207輸送至定量部A208和定量部B209。 被送至所述定量部B209的經正鐵化和變性的試樣液在該定量部B209中與預先保有的膠乳試劑211混合，膠乳試劑211與該試樣液中的血紅蛋白Alc結合。
然后，再次通過電動機105使所述旋轉基板104以規定的轉速旋轉一定時間后，被送至所述定量部A208的經正鐵化和變性的試樣液被送至檢測部A205，同時在所述定量部B209與膠乳試劑211混合了的試樣液被送至檢測部B206。 承載于所述檢測部B206的凝集試劑212與未同血紅蛋白Alc結合的膠乳試劑結合，發生與血紅蛋白Alc的濃度對應的膠乳凝集抑制反應。 一定時間后，實施檢測部B206的透射光測定，從而檢測膠乳凝集抑制反應。 此外，同時測定檢測部A205，從而可以測定血紅蛋白的吸收，算出血紅蛋白濃度。
所述檢測部B206中的膠乳凝集抑制反應的測定可通過600nm附近的波長進行，所述檢測部A205中的血紅蛋白的測定可采用測定540nm附近的血紅蛋白吸收的方法。
不論是哪一種情況，如果以事先確定的濃度的血紅蛋白和血紅蛋白Alc的測定結果為基礎，預先制成校正曲線，則可利用該校正曲線分別算出血紅蛋白和血紅蛋白Alc的濃度，能夠根據這些濃度算出血紅蛋白Alc的存在比。 在這里，作為一例，可以例舉分析器件101呈芯片狀且通過利用離心力和毛細管力的液體輸送來控制測定體系的順序和試劑量、反應時間等的分析系統，但只要是可控制測定體系的順序和試劑量、反應時間的形狀即可，并不限定于該構成及方法，對于液體輸送，例如使用泵以壓力進行液體輸送的方法等也可。此外，所述分析器件例如可以是采用色譜法的形態，更簡單的話，即使是長方體的塑料制盒的形狀，通過改進試劑的承載方法也足以使用。 如上所述，根據本實施方式7，設計承載有血紅蛋白Alc的測定所需的試劑的分析器件，并且構筑與該分析器件專用的測定部組合而成的分析系統，所以可以實現不易受手法的影響的簡便且迅速的血紅蛋白Alc的測定。
(實施例4) 以下，對關于凝集試劑的制造方法及膠乳標記抗體的制造方法的實施例的具體內容進行記述。 作為凝集試劑的制造方法，載體采用雞Y-球蛋白(以下稱為CGG)，連接物采用EMCS，配體采用VHLTC。通過將EMCS的N末端與VHLTC的半胱氨酸結合，再使EMCS的C末端與CGG的氨基結合，從而制成凝集試劑。這時，預先平均1個CGG結合20個左右的VHLTC。
此外，作為膠乳標記抗體的制造方法，加入過量的抗人HbAlc抗體，通過物理吸附與平均粒徑O. 12ym的聚苯乙烯膠乳粒子(積水化學工業株式會社(積水化學社)制)結合。在該膠乳粒子抗體復合物中加入0.5%的牛血清白蛋白(以下稱為BSA)封閉，制成膠乳標記抗體。還有，膠乳的粒徑并不局限于此，只要是0. 05 i！ m 1. 0 i！ m即可，可以是任意的。(實施例5) 以下，對關于第二種凝集試劑的制造方法的實施例的具體內容進行記述。
作為凝集試劑的制造方法，載體采用IgY(僅將作為CGG的主要成分的免疫球蛋白G純化而得的產物)，連接物采用EMCS，配體采用VHLTC。通過將EMCS的N末端與VHLTC的半胱氨酸結合，再使EMCS的C末端與IgY的氨基結合，從而制成凝集試劑。這時，預先平均1個IgY結合20個左右的VHLTC。該凝集試劑與使用CGG作為載體的情況相比，載體的批次間差異小，因此可以制造批次間差異小的凝集試劑。
(實施例6) 以下，對關于采用膠乳免疫凝集抑制法的被檢試樣中的分析對象的測定方法的實施例的具體內容進行記述。 首先，將400 y L用精制水稀釋至250倍的血液與400 y L由0. 3%蔗糖單月桂酸酯及0. 5%鐵氰化鉀形成的變性試劑混合，使血液中的血紅蛋白正鐵化和變性。還有，使血紅蛋白正鐵化和變性的工序中使用的試劑并不局限于這些，只要包含非離子型表面活性劑和氧化劑即可，可以是任意的。對于所述經稀釋和變性的血液以535nm的波長測定吸光度，算出總血紅蛋白濃度。 接著，為了測定血紅蛋白Alc，將所述經稀釋和變性的血液加入經真空冷凍干燥的實施例1的膠乳標記抗體中，使其進行抗原抗體反應。將其加入經真空冷凍干燥的本發明的凝集試劑中，使其在37t:進行凝集反應。還有，雖然對于膠乳標記抗體及凝集試劑采用了真空冷凍干燥，但只要是制成干燥物的方法即可，可以使用任意的方法，也可以采用風干、熱干燥、真空干燥等方法。此外，本發明的凝集試劑沒有妨礙免疫反應的性質，在抗原抗體反應中與現有的凝集試劑沒有本質上的區別。 為了通過光學測定檢測基于該凝集塊的濁度，以625nm的波長測定吸光度(A)。此外，在加入凝集試劑前，也測定了 625nm波長的吸光度(Al)。根據這些吸光度的差算出吸光度變化(A-A1)。 利用以事先確定的濃度的血紅蛋白和血紅蛋白Alc的測定結果為基礎預先制成的校正曲線，分別算出血紅蛋白和血紅蛋白Alc的濃度，根據這些濃度算出血紅蛋白Alc的存在比。(比較例) 使用由作為載體的CGG、作為連接物的EMCS、作為配體的VHLTC構成的本發明的凝
集試劑和由作為載體的聚賴氨酸、作為連接物的EMCS、作為配體的VHLTC構成的現有的凝
集試劑，分別進行了比較實驗。 (a)凝集試劑的濃度與吸光度變化的關系 圖11表示膠乳標記抗體和凝集試劑的膠乳凝集反應中所測定的吸光度變化與所添加的凝集試劑的濃度的關系。橫軸為凝集試劑的濃度，縱軸為加入凝集試劑之后l分鐘后的吸光度變化。根據圖ll，對于現有的凝集試劑和本發明的凝集試劑，都隨著凝集試劑的濃度升高，凝集物不斷增加，吸光度的測定值不斷升高，但凝集試劑的濃度超過某一水平
26的最大值，則反應液中的抗原達到過量的狀態，因此凝集形成受到抑制，表觀上的吸光度的測定值反而下降。例如，現有的凝集試劑的1 P g/mL以上的濃度范圍以及本發明的凝集試劑的5ii g/mL以上的濃度范圍呈吸光度的測定值降低的區域，一般將該區域稱為前帶區域，并且該現象被稱為前帶現象。通過使用該濃度區域的凝集試劑，可以減小凝集試劑的濃度變化對反應性的影響。此外，由于凝集試劑過量，因此可以加快凝集反應速度。由該結果可知，本發明的凝集試劑的動態范圍(dynamic range)更大。由于動態范圍大，因而校正曲線的斜率大，測定精度好。 此外，這時使用的凝集試劑的平均一個載體的配體量在本發明的凝集試劑(CGG)中為0. 11 ii mol/mg，在現有的凝集試劑聚賴氨酸(poly-Lys)中為0. 96 y mol/mg。
(b)各前帶區域的凝集試劑濃度下的凝集反應完成率與經時變化的關系
圖12表示采用各前帶區域的濃度的凝集試劑的膠乳凝集抑制反應中凝集反應完成率的經時變化。橫軸為自加入凝集試劑起的時間，縱軸為將加入凝集試劑170秒后假設為100%凝集時的凝集反應完成率。如圖12所示，采用本發明的凝集試劑的情況下，170秒后吸光度穩定，但采用現有的凝集試劑的情況下，由圖的斜率可知，170秒后反應依然在進行，吸光度上升。可知即使將170秒后假設為100%凝集，也明顯是本發明的凝集試劑的凝集速度更快，凝集反應完成率更高。即，例如對于凝集開始60秒后進行比較時，現有的凝集試劑完成了 60%的凝集反應，而本發明的凝集試劑完成了 75%的凝集反應。
由該結果可知，采用本發明的凝集試劑時凝集反應速度更快，反應在短時間內完成。采用本發明的凝集試劑的測定中，反應在凝集反應開始3分鐘以內完成。另一方面，對于現有的凝集試劑，完成同樣程度的凝集反應需要約2倍的時間。
(c)凝集試劑的保存穩定性 圖13表示凝集試劑的保存穩定性。將凝集試劑真空冷凍干燥，在40°C的環境下保存。使用該凝集試劑進行膠乳凝集抑制反應，用分光器測定吸光度，根據與反應前的吸光度差確認凝集試劑的反應性。橫軸為保存天數，縱軸為凝集反應測定時的與對照的吸光度變化比。還有，作為對照，采用于-8(TC冷凍保存的凝集試劑。由圖13可知，現有的凝集試劑中，保存3個月后的吸光度變化僅顯示對照的一半左右的吸光度變化，但本發明的凝集試劑中，保存3個月后也顯示與對照同等程度的吸光度變化，存在反應性穩定的傾向。
由該結果可知，與現有的凝集試劑在4(TC經過1個月時發現反應性的下降相比，本發明的凝集試劑在4(TC經過3個月時也保存穩定，保存穩定性顯著提高。
還有，本實驗通過日立株式會社(日立)制分光器(U2800)進行。
產業上利用的可能性 如果采用本發明，則可以迅速且可靠地使試樣液中的血紅蛋白變性，所以可以迅速且準確地測定血紅蛋白及血紅蛋白衍生物。 此外，如果采用本發明，則可以縮短凝集反應的時間，所以能夠迅速且準確地進行測定，而且由于凝集試劑的保存穩定性提高，因此可在室溫下保存。通過實現在室溫下保存，采用免疫測定的試樣分析片的操作變得簡便。
2權利要求
一種血紅蛋白的測定方法，其特征在于，包括以下的工序將含血液成分的試樣用非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽進行處理，使所述試樣中的血紅蛋白變性。
2. 如權利要求1所述的血紅蛋白的測定方法，其特征在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或 堿土金屬鹽。
3. —種血紅蛋白衍生物的測定方法，其特征在于，將含血液成分的試樣用非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽進行處理后，進行所述 試樣中的血紅蛋白測定，再使用與經變性的血紅蛋白衍生物的變性部位特異性地結合的抗體進行血紅蛋白衍 生物的免疫測定。
4. 如權利要求3所述的血紅蛋白衍生物的測定方法，其特征在于，所述金屬鹽是堿金 屬鹽或堿土金屬鹽。
5. 如權利要求3所述的血紅蛋白衍生物的測定方法，其特征在于，所述金屬鹽的濃度 是不會顯著地妨礙血紅蛋白衍生物的免疫測定的濃度。
6. 如權利要求3所述的血紅蛋白衍生物的測定方法，其特征在于，包括 測定所述試樣中所含的血紅蛋白的工序； 進行所述試樣中所含的血紅蛋白衍生物的免疫測定的工序； 算出所述血紅蛋白中的血紅蛋白衍生物的存在比例的工序。
7. 如權利要求6所述的血紅蛋白衍生物的測定方法，其特征在于，所述血紅蛋白衍生 物是血紅蛋白Alc。
8. —種試劑組合物，它是用于在測定含血液成分的試樣中的血紅蛋白時對試樣進行處 理的試劑組合物，其特征在于，至少包含使血紅蛋白變性的非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽。
9. 如權利要求8所述的試劑組合物，其特征在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金屬^! . o
10. —種試劑組合物，它是用于在測定含血液成分的試樣中的血紅蛋白和血紅蛋白衍 生物時對試樣進行處理的試劑組合物，其特征在于，至少包含使血紅蛋白和血紅蛋白衍生物變性的非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬 鹽，還包含與經變性的血紅蛋白衍生物的變性部位特異性地結合的抗體。
11. 如權利要求io所述的試劑組合物，其特征在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金
12. 如權利要求IO所述的試劑組合物，其特征在于，所述金屬鹽的濃度是不會顯著地 妨礙血紅蛋白衍生物的免疫測定的濃度。
13. 如權利要求10所述的試劑組合物，其特征在于，所述血紅蛋白衍生物是血紅蛋白Alc。
14. 一種測定試劑盒，它是測定含血液成分的試樣中的血紅蛋白時使用的測定試劑盒， 其特征在于，至少保有包含使血紅蛋白變性的非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽的試劑組合物。
15. 如權利要求14所述的測定試劑盒，其特征在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金
16. —種測定試劑盒，它是測定含血液成分的試樣中的血紅蛋白和血紅蛋白衍生物時 使用的測定試劑盒，其特征在于，至少保有包含使血紅蛋白和血紅蛋白衍生物變性的非離子型表面活性劑、氧化劑和金 屬鹽的試劑組合物以及與經所述試劑組合物變性的血紅蛋白衍生物的變性部位特異性地 結合的抗體。
17. 如權利要求16所述的測定試劑盒，其特征在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金
18. 如權利要求16所述的測定試劑盒，其特征在于，所述金屬鹽的濃度是不會顯著地 妨礙血紅蛋白衍生物的免疫測定的濃度。
19. 如權利要求16所述的測定試劑盒，其特征在于，所述血紅蛋白衍生物是血紅蛋白Alc。
20. —種分析器件，它是測定含血液成分的試樣中的血紅蛋白時使用的分析器件，其特 征在于，至少包括添加所述試樣的試樣添加部位；與所述試樣添加部位連接，通過包含非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽的試劑組 合物使所述已添加的試樣中的血紅蛋白變性的變性部；與所述變性部連接，檢測所述經變性的血紅蛋白的檢測部。
21. 如權利要求20所述的分析器件，其特征在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金屬^! . o
22. —種分析器件，它是測定含血液成分的試樣中的血紅蛋白和血紅蛋白衍生物時使用的器件，其特征在于，至少包括 添加所述試樣的試樣添加部位，與所述試樣添加部位連接且通過至少包含非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽的試 劑組合物使所述已添加的試樣中的血紅蛋白變性的變性部，與所述變性部連接且檢測所述經變性的血紅蛋白的檢測部，承載與經變性的血紅蛋白衍生物的變性部位特異性地結合的抗體的免疫測定部； 通過所述試劑組合物將所述試樣中的血紅蛋白衍生物變性后，使用所述抗體對所述經 變性的血紅蛋白衍生物進行免疫測定來檢測。
23. 如權利要求22所述的分析器件，其特征在于，所述金屬鹽是堿金屬鹽或堿土金屬^! . o
24. 如權利要求22所述的分析器件，其特征在于，所述金屬鹽的濃度是不會顯著地妨 礙血紅蛋白衍生物的免疫測定的濃度。
25. 如權利要求22所述的分析器件，其特征在于，所述血紅蛋白衍生物是血紅蛋白Alc。
26. 如權利要求22所述的分析器件，其特征在于，算出所述血紅蛋白中的血紅蛋白衍 生物的存在比例。
27. 如權利要求22所述的分析器件，其特征在于，由對在所述分析器件的檢測部被檢出的所述血紅蛋白衍生物的量進行測定的測定部構成。
28. —種凝集試劑的制造方法，它是使受控的數量的配體與分子量6萬以上的具有高 級結構的蛋白質以化學方式結合的凝集試劑的制造方法，其特征在于，使所述配體介以具有官能團的連接物與所述蛋白質結合。
29. 如權利要求28所述的凝集試劑的制造方法，其特征在于，所述蛋白質是球蛋白樣 蛋白。
30. 如權利要求28所述的凝集試劑的制造方法，其特征在于，所述具有官能團的連接 物的長度在15A以下。
31. 如權利要求28所述的凝集試劑的制造方法，其特征在于，所述連接物具有直鏈結構。
32. 如權利要求28所述的凝集試劑的制造方法，其特征在于，所述連接物具有平面結構。
33. 如權利要求28所述的凝集試劑的制造方法，其特征在于，所述配體是識別特異的 蛋白作為結合對象的物質。
34. 如權利要求28所述的凝集試劑的制造方法，其特征在于，所述配體是半抗原。
35. 如權利要求28所述的凝集試劑的制造方法，其特征在于，所述凝集試劑是平均1個 蛋白質結合有IO個以上的配體的復合物。
36. —種凝集試劑或生成物，其特征在于，通過權利要求28 35中的任一項所述的凝 集試劑的制造方法生成。
37. —種分析對象的測定方法，它是進行粒子凝集抑制免疫測定來測定試驗試樣中的 分析對象的測定方法，其特征在于，包括將與水懸浮性粒子結合的抗分析對象抗體與試驗試樣混合，使所述抗分析對象抗體與 該試驗試樣中所含的分析對象結合的工序；將混合有所述與水懸浮性粒子結合的抗分析對象抗體和試驗試樣的溶液與凝集試劑 混合，通過所述凝集試劑使未與所述試驗試樣中所含的分析對象結合的抗分析對象抗體凝 集的工序，所述凝集試劑通過使具有對所述抗分析對象抗體具有特異性的結合部位的配體 介以具有官能團的連接物與分子量6萬以上的具有高級結構的蛋白質以化學方式結合而 形成；檢測由所述抗分析對象抗體與凝集試劑的反應而生成的凝集塊，對所述試驗試樣中的 分析對象進行定量的工序。
38. 如權利要求37所述的分析對象的測定方法，其特征在于，所述分析對象是血紅蛋 白Alc，所述配體是與血紅蛋白Alc中的肽序列對應的糖化肽。
39. 如權利要求37所述的分析對象的測定方法，其特征在于，所述凝集試劑的使用量 在抗原過量的前帶區域中。
40. 如權利要求37所述的分析對象的測定方法，其特征在于，通過光學測定來檢測所 述凝集塊的濁度。
41. 如權利要求37所述的分析對象的測定方法，其特征在于，通過計數所述凝集塊來 進行檢測。
42. —種試驗試劑盒，它是用于進行粒子凝集抑制免疫測定來測定試驗試樣中的分析對象的試驗試劑盒，其特征在于，保有與水懸浮性粒子結合的抗分析對象抗體和凝集試劑，所述凝集試劑通過使具有對抗分析對象抗體具有特異性的結合部位的配體介以具有 官能團的連接物與分子量6萬以上的具有高級結構的蛋白質以化學方式結合而形成。
43. 如權利要求42所述的試驗試劑盒，其特征在于，所述與水懸浮性粒子結合的抗分 析對象抗體和所述凝集試劑以干燥狀態承載。
44. 一種分析器件，它是用于進行粒子凝集抑制免疫測定來測定試驗試樣中的分析對 象的分析器件，其特征在于，包括注入所述試驗試樣的試樣注入部；與所述試樣注入部連接，在所述已注入的試樣中混合與水懸浮性粒子結合的抗分析對 象抗體和凝結試劑，通過所述凝集試劑使未與所述試驗試樣中所含的分析對象結合的抗分 析對象抗體凝集的凝集部，所述凝集試劑通過使具有對所述抗分析對象抗體具有特異性的 結合部位的配體介以具有官能團的連接物與分子量6萬以上的具有高級結構的蛋白質以 化學方式結合而形成；與所述凝集部連接，檢測由所述抗分析對象抗體與所述凝集試劑的反應而生成的凝集 塊，對所述試驗試樣中的分析對象進行定量的測定部。
45. 如權利要求44所述的分析器件，其特征在于，所述分析對象是血紅蛋白Alc，所述 配體是與血紅蛋白Alc中的肽序列對應的糖化肽。
46. 如權利要求44所述的分析器件，其特征在于，所述凝集試劑的承載量在抗原過量 的前帶區域中。
47. 如權利要求44所述的分析器件，其特征在于，所述與水懸浮性粒子結合的抗分析 對象抗體和所述凝集試劑以干燥狀態承載。
48. 如權利要求44所述的分析器件，其特征在于，在所述測定部中，通過光學測定來檢 測所述凝集塊的濁度。
49. 如權利要求44所述的分析器件，其特征在于，在所述測定部中，通過計數所述凝集 塊來進行檢測。
50. 如權利要求44所述的分析器件，其特征在于，所述測定部和所述凝集部形成為一體。
全文摘要
在迅速且可靠地使試樣液中的血紅蛋白變性的同時，實現迅速且準確的血紅蛋白及血紅蛋白衍生物的測定。血紅蛋白及血紅蛋白衍生物的測定方法以及用于該方法的試劑組合物、測定試劑盒、分析器件及分析系統中，通過用非離子型表面活性劑、氧化劑和金屬鹽對含血液成分的試樣溶液進行處理來使試樣溶液中的血紅蛋白變性并測定血紅蛋白后，通過使用與經變性的血紅蛋白衍生物的變性部位特異性地結合的抗體的免疫法測定所述試樣中的血紅蛋白衍生物量。
文檔編號G01N33/531GK101755207SQ200880025118
公開日2010年6月23日 申請日期2008年10月29日 優先權日2007年10月30日
發明者北脅文久, 淺原千津, 田中宏橋, 田中正教 申請人:松下電器產業株式會社