專利名稱：微波腔中的熒光顯微鏡的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種光學成像系統，其提供化學反應時間的提高以及實時監測反應的
能力，并且具有足夠的分辨率來觀察用發光分子標記的細胞內組分的位置、以及多種生物
分子之間的相互作用和對活細胞和組織中的局部化環境變化的響應。 在一個方面中，本發明涉及微波/光學成像系統，其包括 a)被封閉的容器，其包括微波腔并且在其中具有至少一個開口 ； b)設置于微波腔中用于保持至少一個樣品的樣品板，其中樣品包括檢測劑分子或
進行能夠被檢測的反應的組分； c)通信連接于微波腔用于將微波能量遞送進微波腔中并朝向樣品引導的微波能
4量產生源； d)設置用于向樣品遞送能量的電磁能量產生源；禾口 e)通信連接于微波腔的光學成像裝置，其設置為用于將來自電磁能量產生源的光 引導到樣品并且捕獲由樣品發射的發光發射。 在另一個方面中，本發明涉及微波/顯微鏡系統，所述系統包括 a)被密封的容器，其包括微波腔并且在其中具有預定尺寸的開口，其中微波腔的
內部包括用于放置至少一個樣品板的平臺，所述樣品板用于保持至少一個樣品，其中所述
樣品包括作為額外的標記分子而被包括在內的信號產生試劑或由于樣品中的化學反應而
形成的試劑； b)通信連接于微波腔用于將微波能量遞送進微波腔中的微波能量產生源；禾口
c)通信連接于微波腔的熒光顯微鏡系統，其設置為用于向樣品遞送激發能并且捕 獲來自樣品的發射，其中所述熒光顯微鏡系統包括
用于以一定頻率產生能量來激發樣品的電磁能量產生源； 設置為用于從所述電磁能量產生源接受電磁能量并將其聚焦在樣品上的物鏡；
設置在激光器和物鏡之間的二向色鏡，用于將來自能量源的電磁能量反射到物鏡 以及用于引導來自樣品的發射信號；禾口 設置在二向色鏡后面的管透鏡，用于收集來自樣品的發射并將其引導到檢測器裝置。 所述樣品板可以包括沉積在樣品板表面上的至少一層金屬材料，包括銀、金、銅、 鋅、鋁或鉑，其中所述金屬材料形成為帶圖案的形狀。優選地，所述帶圖案的形狀包括具有 至少一個頂端的幾何形狀，幾何形狀為例如三角形、正方形、矩形、梯形、多邊形、拋物線形、 橢圓形、圓的扇形、長橢圓形和/或其組合，其中所述多個頂端彼此相鄰，從而在其中產生 反應性區域。所述其中的反應性區域可以另外準備用于放置被固定的與檢測劑分子互補的 捕獲分子、用于與其它化學品反應的化學品、或用于與其它生物分子反應的生物分子。所述 反應性區域可具有的直徑或在相鄰和/或相對頂端之間的距離為約0. Olmm到5mm、更優選 2mm到約3mm。另外，所述反應性區域可以被設置在具有多個孔的試驗系統上，其中所述反 應性區域位于所述孔內并且暴露于微波能量下增強其中的反應。 樣品板可以由聚合物材料、玻璃、紙、硝化纖維素、其組合或為設置金屬材料提供 足夠穩定性的任何材料制成。 所述頂端區域/反應性區域暴露于一定量的微波能量下，用于提高生物學相互作 用的反應速率，用于提高感測技術中的來自化學發光反應、熒光、磷光或熒光標記的發射強 度；用于通過將電磁場聚焦在反應性區域內而增強電場，和/或用于增強反應性區域內所 含分子的布朗運動。 本發明的另一個方面涉及制備樣品板的方法，所述方法包括 a)向襯底表面施加至少一個金屬結構，所述襯底表面包括但不限于玻璃、聚合物、 紙、硝化纖維素，其中所述金屬結構由銀、金、鋁、鋅、鉬、銅或其組合物制成，其中所述金屬 結構具有成形的圖案，并且其中成形圖案的區域包括設置為鄰近另一個成形圖案頂端的頂 端區域，從而提供處于至少兩個頂端區域之間的反應性區域；禾口 b)引入包含至少一種生物分子的溶液，用于設置在所述相鄰的頂端區域之間的反
5應性區域。 本發明的另一個方面涉及使由微波誘導的生物分子的反應或相互作用實時數據 成像的方法，所述方法包括 a)提供包括至少一種生物分子和檢測劑分子的樣品，其中將所述樣品設置在樣品 板上； b)將樣品置于微波腔中，其中所述微波腔通信連接于微波產生源并且還通信連接 于光學成像系統，其中所述光學成像系統包括 i.用于以一定頻率產生能量來激發樣品的電磁能量產生源；
ii.設置用于接受激發電磁能量并將其聚焦在樣品上的物鏡； iii.設置在激光器和物鏡之間的二向色鏡，用于將來自能量源的電磁能量反射到 物鏡以及用于引導來自樣品的發射信號；禾口 iv.設置在二向色鏡后面的管透鏡，用于收集來自樣品的發射并將其引導到檢測 器裝置； c)用一定量的低功率微波能量輻射樣品以增加樣品中的相互作用或反應；禾口
d)用步驟b)的光學成像系統將檢測劑分子的發射信號成像。 使用被引導給置于由相鄰的金屬圖案形成的反應性區域中的樣品的低功率微波 能量提高在樣品內發生的化學反應的速度。 本發明的其它特征和優點通過以下發明詳述、附圖和權利要求而變得顯而易見。
圖1表示本發明的微波/顯微鏡的實施方案。 圖2表示用于制備在本文所述系統中使用的樣品板的樣品幾何結構方案。 圖3顯示10 MRu(by)2Cl2在不同溫度下的歸一化強度譜。玻璃幾何結構(插圖，
樣品幾何結構)的10iiM Ru(by)^l2溶液的歸一化強度比用箭頭標記，"蝶形領結"樣品幾
何結構(插圖，樣品幾何結構)的10iiMRu(by)^^溶液的歸一化強度比用虛線標記。歸一
化強度比計算為暴露于短微波脈沖過程中的時間依賴性發射強度與暴露于短微波脈沖之
前的最大發射強度的比值。 圖4表示'蝶形領結'(一 ---')和玻璃載片(--)樣品幾何結構在施加
低功率微波脈沖之前(大的破折號——)和過程中的Ru(by)2Cl2發射(沒有二向色鏡)的 歸一化光譜。疊加了二向色透射曲線來顯示二向色鏡對Ru(by)^l2發射的過濾作用。
圖5示出了得自CCD圖像的在IOO像素2區域內的歸一化的平均熒光強度(由 方框法估計的所選區域)的時間描圖，所述描圖是在施加5秒低功率微波脈沖(Mw脈 沖)過程中在不相交的'蝶形領結'接合點處以及在普通(plain)玻璃載片(對照)上的 10i!MRu(by)2Cl2溶液的描圖。樣品構造顯示在CCD圖像的右側(插圖)。
圖6顯示在A)普通玻璃襯底、B)用氣相淀積的金'蝶形領結'結構75nm改性的玻 璃襯底上的在暴露于五秒微波脈沖過程中10i!MRU(by)2Cl2的熒光強度降低的實時電影記 錄，顯示了在微波腔中的熒光顯微鏡的功能性。 圖7顯示了在普通玻璃載片(對照)上以及在75nm厚的不相交的'蝶形領結'幾 何結構的間隙中的得自化學發光溶液的最大像素強度時間描圖。以10Hz的速率收集CCD圖像大約10秒。樣品暴露于五秒微波脈沖(Mw脈沖)，所述脈沖在數據收集之后大約2秒 開始。離散的時間間隔被標記為a)0秒或穩態發射、b)在初始暴露于微波脈沖時的發射、 c)在施加微波脈沖過程中和d)最大'觸發'發射、e)最終的發射。 圖8顯示了在普通玻璃載片(對照)上的不相交處的化學發光溶液在離散的時間 間隔處的CCD圖像。以10Hz的速率收集CCD圖像大約10秒。樣品暴露于五秒微波脈沖 (Mw脈沖)，所述脈沖在數據收集之后大約2秒開始。離散的時間間隔被標記為a) 0秒或穩 態發射、b)在初始暴露于微波脈沖時的發射、c)在施加微波脈沖過程中和d)最大'觸發' 發射、e)最終的發射。 圖9顯示了在不相交的'蝶形領結'接合點上在不相交處的化學發光溶液在離散 的時間間隔的CCD圖像。以10Hz的速率收集CCD圖像大約10秒。樣品暴露于五秒微波脈 沖(Mw脈沖)，所述脈沖在數據收集之后大約2秒開始。離散的時間間隔被標記為a)O秒 或穩態發射、b)在初始暴露于微波脈沖時的發射、c)在施加微波脈沖過程中和d)最大'觸 發'發射、e)最終的發射。 圖10顯示了 6 的化學發光溶液的綠色CCD電影記錄圖像，A)在玻璃襯底上， B)在不相交的'蝶形領結'幾何結構(破折號輪廓表示三角形的'蝶形領結'端部)的間隙中。 發明詳述 本發明涉及通信連接于微波能量產生源的實時光學成像系統，從而提供用于在施
加微波場過程中記錄生物分子相互作用的實時數據和生物系統中的反應的手段。 本發明的系統可以為微波或射頻驅動的在表面處、溶液中、在包括原核生物和真
核生物在內的活生物體中的蛋白質-蛋白質、DNA-蛋白質、RNA-蛋白質、DNA-RNA、化學
品_蛋白質、化學品-DNA、和化學品-蛋白質之間的相互作用提供實時成像。此外，本發明
為由微波誘導的對生物系統的影響提供實時成像，為原核生物和真核生物體中、在界面處、
表面處和溶液中的由微波誘導的生物分子反應提供實時成像。另外，本發明為由微波誘導
的將小生物分子轉染到活生物體、原核生物和真核生物中提供實時成像。 本文中使用的術語"生物分子"是指在自然界中存在的任何分子或這種分子的衍
生物。所述生物分子可以是活性的或無活性的形式。"活性形式"是指該生物分子處于可以
執行生物學功能的形式。"無活性形式"是指該生物分子必需在其執行生物學功能之前經過
天然或合成的處理。示例性的生物分子包括核酸、芳香碳環結構、NADH、 FAD、氨基酸、蛋白
質、肽、碳水化合物、甾族化合物、核黃素、DNA、RNA、寡核苷酸、核酸、脂肪酸、肌紅蛋白、糖類
例如葡萄糖等、維生素、輔助因子、嘌呤、嘧啶、間型霉素、脂質、植物光敏色素、phytofluor、
肽、脂質、抗體和藻膽蛋白。 本文中使用的術語"受體-配體"是指其中各組分彼此具有親合力的任何天然存 在的或非天然存在的結合對。例如，所述結合對可以包括抗體/抗原復合物、病毒包衣配體 /蛋白質細胞受體或探針和結合配對體的任何組合。術語"受體"是指對于樣品中的特定的 化學基團、分子、病毒、探針或任何生物制劑靶標具有親和力的天然存在的或合成的化學基 團、分子、生物試劑。用于本發明的受體-配體的選擇可以由疾病、病況或要檢測的感染來 決定。 本發明的系統包括檢測劑分子或對電磁激發、化學激發、光源激發、或連續或脈沖激發的激光束有響應以產生熒光的可檢測的化學反應，所述響應包括化學發光、熒光或磷 光發射。 檢測劑分子包括在該物質被不同波長(激發波長)的輻射照射時發射電磁能量的 熒光團，所述電磁能量例如為某一波長(發射波長)的光，并且意在包括能夠與樣品中的所 關心的被分析物特異性地相互作用或反應以提供一種或多種光信號的化學或生物化學分 子或其片段。另外，熒光團包括非固有熒光團(extrinsic fluorophore)和固有熒光團。非 固有熒光團是指結合于另一種物質的熒光團。固有熒光團是指自身是熒光團的物質。示例 性的熒光團包括但不限于在Molecular Probes Catalogue中列舉的那些，所述文獻被并入 本文作為參考。 代表性的熒光團包括但不限于Alexa Fluor⑧350、 DansylChloride (DNS-C1)、 5-(碘代乙酰胺基)熒光素(5-IAF)凍光素5-異硫氰酸酯(FITC)、四甲基羅丹明5-(和 6_)異硫氰酸酯(TRITC)、6-丙烯酰基-2-二甲氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-氧 雜-1， 3- 二唑-4-基氯化物(NBD-C1)、溴化乙錠、螢光黃、5-羧基羅丹明6G鹽酸鹽、麗絲胺 羅丹明B磺酰氯、Texas RecTM、磺酰氯、B0DIPYTM、萘磺酸類(包括但不限于1_苯胺萘_8_磺 酸(ANS)和6-(對甲苯胺基)萘-2-磺酸(TNS))、蒽基脂肪酸(Anthroyl fatty acid)、 DPH、十八碳四烯酸、TMA-Dra、芴基脂肪酸、熒光素-磷脂酰乙醇胺、德克薩斯紅-磷脂酰 乙醇胺、芘基_磷脂酰膽堿、芴基_磷脂酰膽堿、部花青540、1-(3-硫酸根合(sulfonate) 丙基)-4-[-e-[2[(二正丁基氨基)-6萘基]乙烯基]吡啶鎗甜菜堿(N即htylStyryl)、 3，3' 二丙基硫雜二碳花青((115-03-(5))、4-(對-二戊基氨基苯乙烯基)-1-甲基妣啶 鎗(di-5-ASP) 、 Cy-3碘乙酰胺、Cy-5-N-羥基琥珀酰亞胺、Cy_7_異硫氰酸酯、羅丹明800、 IR-125、噻唑橙、Azure B、尼羅藍、A1酞菁、0xaxine 1，4' ，6-二脒基-2-苯基n引哚(DAPI)、 Hoechst 33342、 T0T0、吖啶橙、乙菲啶同二聚體(Ethidium Homodimer) 、 N(乙氧羰基甲 基)-6_甲氧基喹啉(MQAE) 、Fura-2、鈣綠(Calcium Green) 、 CarboxySNARF-6、 BAPTA、香豆 素、phytof luors、六苯并苯和金屬-配體復合物。 代表性的固有熒光團包括但不限于具有芳族環結構的有機化合物，包括但不限于 NADH、 FAD、酪氨酸、色氨酸、嘌呤、嘧啶、脂質、脂肪酸、核酸、核苷酸、核苷、氨基酸、蛋白質、 肽、DNA、RNA、糖和維生素。另外的適合的熒光團包括酶-輔助因子；鑭系元素、綠色熒光蛋 白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、或其突變體和衍生物。 可以將提供化學反應的任何化學發光物質用于本發明，所述化學反應產生可檢測 的反應(被觀察到的發射)，其中引起被觀察到的發射的被激發的狀態包括但不限于以下 激發機理 R +R' — R-R+hv (單鍵形成(自由基_自由基反應))
.R. + .R.' — R = R+hv(雙鍵形成(自由基-自由基反應))
R02 — R +02 — R+hv
R++e— — R+hv (電子捕獲)。 適合的化學發光檢測劑分子的實例包括但不限于過氧化物酶、細菌熒光素 酶、熒光蟲熒光素酶、官能化的鐵卟啉衍生物、苯巴比妥、異氨基苯二酰一肼、吖啶鎗值 (acridinium esters)、磺酰胺以及其它。最近的化學發光標記物包括以次黃嘌呤作為底物 的黃嘌呤氧化酶。觸發試劑包含過硼酸鹽Fe-EDTA復合物和氨基苯二酰一肼。特定的化學
8發光標記物的選擇取決于若干因素，包括制備被標記成員的成本、用于與檢測劑分子共價 連接的方法、檢測劑分子和/或化學發光標記物的大小。相應地，化學發光觸發試劑的選擇 取決于所用的特定的化學發光標記物。 化學發光反應已經得到充分研究，并且在文獻中有充分記載。例如，過氧化物酶最 適合用于連接于用作化學發光的檢測劑分子。在第一反應中有效誘導光發射的觸發試劑包 括過氧化氫和氨基苯二酰一肼。也可以用于在過氧化物酶的存在下誘導光響應的其它觸發 試劑包括異丁醛和氧氣。用過氧化物酶標記檢測劑分子(例如抗體或抗原)的方法為本領 域中已知的。例如，為了制備用過氧化物酶標記的抗體或抗原，分別使過氧化物酶和抗原或 抗體各自與N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基硫)丙酸酯(以下稱為SPDP)反應。然后使被 SPDP標記的過氧化物酶、或被SPDP標記的抗原或抗體與二硫蘇糖醇反應，以產生被硫醇標 記的過氧化物酶、或被硫醇標記的抗原或抗體。然后使硫醇衍生物與被SPDP標記的抗原或 抗體、或被SPDP標記的過氧化物酶偶聯。 通常，可以將光學成像系統和基于微波的技術的任何組合用于本發明中。如圖1 中所示，所述系統包括用于放置樣品的微波腔和用于產生電磁能量的源，所述電磁能量的 波長和頻率處于微波范圍或射頻范圍內，更優選處于微波范圍內。 施加低水平的微波能量來加熱樣品可用于加速系統內的任何生物學/生物化學 動力學。值得注意的是，低水平的微波不使蛋白質、DNA、或RNA破壞或變性，而是將樣品加 熱到足以加速動力學，例如結合、雜交或化學相互作用。 微波(約0. 3到約300GHz)位于紅外線和射頻電磁輻射之間。普遍認為微波通過 加熱作用加速化學和生物化學反應，其中所述加熱基本上遵循微波介電損耗的原理。極性 分子通過偶極旋轉吸收微波輻射，并由此被加熱，而非極性分子由于介電常數較低而不吸 收微波輻射，并因此不被加熱。極性分子在外部施加的場的作用下自身對準。在本項工作 中所使用的常規的微波爐腔中，輻射頻率(2450MHz)每秒改變符號2.45X10"欠。隨著極 性分子來回旋轉、隨著變化的場連續地重新排列的扭轉作用(tortional effect)而發生加 熱，其中分子旋轉慢于電場變化。作為分子被電場極化的能力的介電常數是指介質被微波 加熱的能力。因此，諸如水、甲醇和二甲基甲酰胺的溶劑容易被加熱，而微波實際上可穿透 己烷、甲苯和二乙醚。 在本發明中，微波輻射可以由頻率介于0. 3-10GHz、更優選約lGHz-5GHz、更優選 2GZ-3GZ，功率大小為約10毫瓦特-700瓦特、優選30毫瓦特-約500瓦特、更優選約50瓦 特-300瓦特的電磁源來提供。可以使用本領域技術人員已知的任何源，例如到能夠發射在 微波范圍內的能量的激光器。根據需要，微波輻射可以連續或間歇(脈沖)發射。
在可供選擇的方案中，微波能量可以通過用于輸送來自適當的磁控管的微波能量 的空腔波導管來提供。優選微波能量經過調節，以引起金屬材料內的熱增加，而不對試驗系 統中的任何生物材料造成損害。 在一個實施方案中，樣品板通過附著金屬表面而進行改性，所述金屬表面被制造 為用于形成諸如三角形、正方形、長橢圓形、橢圓形、矩形、或提供至少一個金屬表面頂端區 域的任何形狀的幾何形狀。另外的多種金屬幾何形狀可以附著于所述圖案形式的表面，來 提供處于頂端區域之間的至少一個反應性區域。可以預見，所述頂端區域不僅包括尖頂區 域，而且包括具有圓邊的區域，例如在長橢圓形或橢圓形中所見的。優選頂端區域設置為使
9得一個頂端區域與另一個頂端區域相對或對準，以便使反應性區域被設置于其間。頂端區 域之間的距離可以為0. 01mm-5mm，更優選為2mm-約3mm，取決于所需的反應性區域的大小。 金屬幾何形狀的厚度為25nm-約1000nm，更優選為約45nm_約250nm。
所述幾何形狀可以通過本領域技術人員已知的任何手段形成在表面襯底上，包括 掩蔽表面襯底并隨后沉積金屬材料、將預先形成的金屬幾何形狀直接固定在襯底表面上、 或用金屬材料灌注表面襯底中的幾何形狀凹陷并在襯底上形成連續的平坦表面。另外，所 述幾何形狀可以包括多種材料，包括介電材料。例如，可以將一層金屬材料淀積在襯底表面 上，在其上面淀積一層SiOp 在另一個實施方案中，本發明使用金屬化的橢圓形、球形、三角形或桿形式的島來 提供增強的發射。另外，金屬材料可以是多孔性三維基質的形式。所述三維基質可以是納 米孔性的三維基質。所述金屬材料可以包括金屬膠體粒子和/或被嵌入到大分子聚合物基 質的玻璃表面中的成形粒子。 如圖1中進一步所示，所述系統包括電磁能量源，其通信連接于微波腔，用于向樣 品和檢測劑材料傳遞輻射能量，從而誘導化學激發、電激發、或單光子或多光子激發，以便 在檢測劑材料中產生特征性熒光。值得注意的是，用于施加電磁能量的所述源可以包括施 加必需的頻率或波長的任何裝置，例如弧光燈，包括水銀或氙；能夠以連續或脈沖模式產生 單光子或多光子的激光二極管和LED光源，其中所述電磁能量的強度與所述檢測劑分子或 可檢測反應的吸收和隨后的熒光相對應。通常使用的激光器是高強度單色光源，然而，需要 指出的是，還考慮了多點激光器。 在另一個實施方案中，使用在700-1000nm的2-光子激發以及使用短脈沖寬度 (< 50pi)、高重復率(l-80MHz)、激光二極管和LED(lns， l-10MHz)源提供與1-光子激發相 比被加強的敏感性。如果熒光團同時吸收兩個光子，其會吸收足夠的能量來提升到激發態。 然后所述熒光團會發射具有一定波長的單光子，所述波長取決于所用的熒光團并且典型地 處于可見光譜內。 本發明的光學成像/微波系統不僅包括本文中上述討論的光源，而且包括用于觀 察所發射的激發信號(例如熒光)的光學器件。光源發光，所述光可能在紫外范圍內，并且 擊中反射一定范圍的波長并允許另一范圍透過的二向色鏡。所述二向色鏡將光反射到樣品 用于激發樣品和/或檢測劑分子中的分子內熒光。物鏡收集所產生的熒光波長的光。這個 熒光透過二向色鏡，并且優選透過消除波長與熒光不同的波長，并使熒光通往成像設備。優 選地，熒光顯微鏡使用落射熒光設置，其中物鏡即用于將輻射光聚焦在樣品/檢測劑分子 上，又用于收集從樣品/檢測劑分子發射的熒光。 包括微波腔的結構構建為用于與光學成像系統連通，其中在微波腔中制作一個開 口，用于將聚焦的光引導到樣品上，以及用于所發射的熒光波長的光離開。光源產生光束， 所述光束被引導到物鏡中，優選所述光束通過光束擴束鏡而使光束充分擴展以提供經過擴 展的激發光的光束，其進入微波腔用于聚焦在樣品上。 可以使用光檢測器檢測離開微波腔并通過物鏡的激發發射。可以使用多種光檢測 器，例如光電二極管、電荷耦合器件(CCD)、光電倍增管(PMT)、或光子計數檢測器，其中各 自具有不同的靈敏度。PMT和光子計數檢測器可以實現高達10e-108的電子放大因子。常 規的PMT需要 lkV電源，但是新的小型化檢測器僅需要5V。大部分化學發光發射波長處于可見區內。可以使用窄帶濾光器來確保檢測熒光波長。所述系統可以另外包括微驅動器(microactuator)、檢測器、微處理器、電子設備、顯示器、和轉化平臺。檢測器的輸出可以連接于模_數轉換器和微處理器，以便計算被分析物濃度。 另外，本發明的系統可以包括在xy和z方向上可以移動的樣品平臺。另外，考慮了使用多點激光器來產生點激發陣列，其被引導到物鏡以便聚焦在樣品上，從而產生多個聚焦斑點的陣列。另外，所述系統可以包括用于調節系統中的透鏡的設備，以選擇樣品內不同深度的聚焦點，以便入射在物體平面處的檢測劑分子或可檢測反應上。值得注意的是，所述系統可以包括用于遞送同時或順序的、空間上和/或暫時受控的電磁輻射的多組件的組合，用于控制生物學或化學反應的活性，所述生物學或化學反應與任何小生物分子、化學分子、由任何介電材料(包括任何納米粒子或碳納米管)組成的粒子的任何大小或粒子集合、原核生物體、真核生物體和/或其組合直接或間接有關。 另外，本發明的組合的光學成像和微波系統可以包括如下的光學成像系統，包括但不限于熒光、發光、寬場、共聚焦反射的、共聚焦的、雙光子、多光子、寬場、旋轉圓盤、Nipkow旋轉圓盤、4-pi共聚焦的、用于將分子間相互作用成像的熒光共振能量轉移(FRET)、用于將分子與表面的相互作用成像的全內反射熒光顯微術(TIRFM)、多聚焦、多聚焦多光子、近場、單分子、光譜成像、壽命成像(lifetime imaging)、熒光成像、熒光相關光譜學、光柵成像相關光譜學(RICS)、和圖像相關光譜學(ICS)。
實施例 方法和材料優質的APS-涂層玻璃載片(75X25mm)得自Sigma-Aldrich。具有粘合劑的CoverWell成像室墊圈(2. 5mm直徑，2mm深和5mm直徑，2mm深，用于溫度測量)得自Molecular Probes (Eugene, OR) 。 Ru (by) 2C12鹽得自Sigma-Aldrich。市售的化學發光材料購自Unique Industries, Inc。
在微波腔中的寬場顯微鏡的光學設置 在微波腔(0. 7立方英尺，GE Compact Microwave型號JES735BF，最大功率700W)的底部鉆1英寸的孔，并將隨后暴露的金屬表面用白色瓷漆覆蓋，以防止產生火花和電弧。使用擴束器，將473nm激光源的斑點尺寸擴展到約l英寸并且使用在物鏡的后光圈處的175mm透鏡聚焦成斑點。用二向色鏡(z479/532rpc， Chroma, Brattleboro， VT)將入射的激發光束反射到無限遠校正的明視野物鏡(LWD Plan Achromat物鏡-LPL10 x物鏡/NA =0.25)中。通過以落射熒光模式工作的寬場激發所產生的熒光發射強度通過無限遠校正的光學器件收集并且成像到CCD攝像機上，使用488nm的峰口 (razor edge)和570LP濾波器來阻擋激發光的任何滲透，如圖l所示。化學發光強度圖像通過無限遠校正的光學器件成像并在沒有任何光學過濾器的存在下成像在CCD攝像機上。用基于4X4面元劃分的Retiga-SRV CCD Camera (Qlmaging， Burnaby， B.C.)以10fps拍取CCD圖像。使用連接于NA為0. 22的Ocean OpticslOOO ii m直徑纖維(Dunedin， FL)的Ocean Optics光譜儀SD2000型(Dunedin，FL)收集發射光譜。準直儀連接于纖維的末端并定位為使熒光發射進入光譜儀的偶聯最大化。以100毫秒的積分時間收集Ru(by)2Cl2時間依賴性發射光譜。物鏡和適配的光學器件的所有暴露的金屬表面都用白色反射性涂漆覆蓋，以防止在施加微波脈沖過程中產生火花和電弧。 在APS覆層的玻璃襯底上形成連續的金屬薄膜 由'蝶形領結'結構改性的玻璃載片的制備以前已有描述[23]。簡而言之，由粘合劑掩模制成不相交的'蝶形領結'等邊2. 5mm三角形模板(stencil)。由兩個5mm倒三角形形成不相交的'蝶形領結'結構，使得頂端之間的距離或間隙尺寸為約2-3mm，如圖2中所示。將三角形膠帶掩模附著于普通玻璃載片并通過使用EMF Corp. (Ithaca， NY)汽相淀積儀器氣相淀積75nm的Au薄膜產生用Ag三角形結構改性的玻璃載片。在淀積工藝過程中使用Edwards FTM6膜厚監測儀監測薄膜厚度。
樣品制備 將經過改性或者未經改性的'蝶形領結'金屬結構的玻璃襯底切成lOXlOmm樣品大小。將成像孔置于兩個淀積的75nm厚的Au三角形之間或'蝶形領結'間隙處和未改性的普通玻璃襯底上。隨后為樣品填充20 ill的10 M Ru(by)2Cl2溶液或6 y 1的化學發光材料(圖2)。 化學發光試劑(化學反應試驗) 市售的輝光條(glow stick)包含苯基草酸酯、熒光探針和包含活性劑(過氧化氫)的玻璃包膜。通過將被密封的包含過氧化物的玻璃包膜破壞、隨后將化學品混合以開始化學發光反應來實現化學品的活化。過氧化氫將苯基草酸酯氧化為過氧酸酯和苯酚[24]。不穩定的過氧酸酯分解為過氧化合物和苯酚，這是一個化學上誘導電子受激發狀態的過程[24]。 Ru(by)2Cl2溫度測量 預先地，已經使用氯化釕水溶液來校準具有CCD傳感器的溫度成像系統[25]。已知的是，這種溶液的發射強度隨溫度而降低。氯化釕水溶液的光物理學和光化學性質的溫度依賴性已經在其它地方有所詳述[26，27]。隨后，使用帶有溫度控制器的Cary Eclipse熒光分光計記錄10 ii M的Ru (by)2Cl2水溶液的預先校準的強度_溫度曲線。校準溫度為10、20、30、40、50、60和70°C ，所述溫度處于相對熒光與溫度之間的線性關系范圍內，如圖3中所示[25]。 對于微波成像實驗，在有和沒有薄的連續金屬膜三角形幾何結構(75nm厚)的存在下測量在玻璃襯底上的10 ii M的Ru(by)2Cl2水溶液的熒光發射強度。Ru(by)2Cl2水溶液用473nm激光源激發。在施加5秒的低功率2. 45GHz微波脈沖(10%功率)之前和過程中，使用圖1的纖維檢測和光譜儀光學構型以100毫秒時間間隔記錄Ru(by)^l2水溶液的光譜發射歷時20秒。將在施加微波脈沖之前和施加過程中在玻璃襯底和'蝶形領結'改性襯底上記錄的Ru(by)2Cl2水溶液的熒光光譜強度歸一化，如圖3中所示。 將經過歸一化的光譜疊加，以確定微波場是否誘導Ru(by)2Cl2發射的任何光譜變化，如圖4中所示。將CCD時間依賴性強度相對于最大發射強度(時間=0)歸一化。歸一化強度比計算為在暴露于短微波脈沖過程中的時間依賴性發射強度與暴露于短微波脈沖之前的最大發射強度的比值。隨后，將這些比值乘以0.9的系數(圖3，RT)，以反映在室溫下的lOyM Ru(by)^l2水溶液的經過歸一化的強度比值(圖4)。隨后，可以從相同濃度的Ru(by)2Cl2樣品的經過預先校準的強度-溫度曲線估算在玻璃襯底和在具有蝶形領結幾何結構的襯底上的經過微波加熱的溶液的相應溫度值(圖3，箭頭和虛線)。
12
使用CCD攝像機以10Hz的幀頻捕獲Ru(by)2Cl2水溶液和化學發光樣品的總發射強度圖像(圖6-10)。為了獲得對于所有測量是相同的初始化學發光發射，將大約6iU的化學發光溶液置于成像室內。數據收集在施加五秒微波脈沖之前io秒開始并且持續到微波暴露之后的20秒。
結果和討論 因為公認的是Ru(by)^l2溶液的發射強度與溫度成反比，所以在一定的溫度范圍內記錄Ru(by)2Cl2的發射光譜[28]。從這些光譜，對于10°C _701:之間的10 y M的Ru(by)2Cl2溶液，觀察到在發射強度和溫度之間存在線性關系，這與以前發表的結果一致[23]。使用光學方案的纖維檢測構造(圖1)，以100毫秒的時間間隔記錄Ru(by)2Cl2水溶液的熒光強度，持續大約60秒。在60秒記錄過程中，施加了五秒的2. 45GHz脈沖微波脈沖。將相同濃度的Ru(by)^l2樣品的經過歸一化的強度-溫度曲線擬合到線性函數(數據未示出)。分別用箭頭和虛線標記近似的由微波誘導的對玻璃和'蝶形領結'樣品幾何結構上的溶液產生的最大溫度升高，如圖3中所示。 盡管在二向色鏡的存在下僅一部分Ru(by)2Cl2光譜被透射，但是在施加微波脈沖之前的疊加的經過歸一化的Ru(by)2Cl2強度譜表示在圖4中。典型地，發色團發射的光譜移動歸因于電子躍遷能量的電子分布變化[29]。因為在施加微波脈沖(圖4，黑線)之前的Ru(by)2Cl2溶液的經過歸一化的強度譜在施加低功率微波脈沖過程中(圖4，點劃線)沒有改變，推斷微波加熱沒有引起Ru(by)2Cl2溶液的光物理學性質產生任何值得注意的變化[29]。 使用CCD成像構造，在有和沒有'蝶形領結'結構的情況下以10Hz的幀頻記錄在微波腔中的玻璃襯底上的Ru(by)2Cl2水溶液的熒光強度圖像，持續10秒(圖5)。
在圖像收集過程中，樣品暴露于五秒的微波脈沖。在100像素2區域上求取微波處理前的熒光強度的平均值，所述區域選自圖像中心(圖5，插圖，方框輪廓)。將在不相交的'蝶形領結'接合點處和在普通玻璃載片(對照)上的10iiM Ru(by)^l2溶液的CCD圖像的平均強度_時間數據相對于微波處理前的最大熒光強度歸一化(圖5)并且按比例縮放為預經過先校準的室溫下的歸一化強度(圖3和9，室溫)。在暴露于微波脈沖過程中，觀察到玻璃襯底上的10y M Ru(by)2Cl2的熒光強度略有降低，對應于約5-8t:的溫度升高(圖5-右上插圖)。另一方面，在暴露于微波脈沖過程中觀察到在'蝶形領結'幾何結構的間隙中10iiMRu(by)2Cl2溶液的熒光強度有顯著降低(圖5-右下插圖)，使人想到發射與溫度成反比。 相對于10iiM Ru(by)^l2溶液強度-溫度的校準曲線，玻璃襯底上的溶液溫度升高，略高于室溫(圖3，玻璃)，而在'蝶形領結'幾何結構的間隙中的10iiM Ru(by)^^溶液的強度變化符合溫度-強度曲線的線性范圍以外的顯著的溫度下降(圖3，虛線)。本文中顯示了這些溶液在暴露于低功率微波脈沖過程中的熒光強度降低的實時電影記錄，以證明微波腔中的熒光顯微鏡的功能性，如圖6A， B中所示。 除了溫度依賴性的Ru(by)2Cl2溶液的實時成像之外，化學發光溶液的局部'觸發'也被成像，以便進一步驗證顯微鏡在微波原理中的有效性。將6iU的藍色化學發光溶液置于被附著到普通玻璃襯底的成像孔中以及位于連續的金薄膜'蝶形領結'幾何結構的2mm間隙中[23,30]。以10Hz的幀頻記錄化學發光發射歷時10秒(圖7)。在10秒的時間間隔期間，樣品暴露于五秒的微波脈沖下，這誘導'被觸發的'發射或最大光子通量的顯著增 加，如圖7中所示。 在圖7中標記離散的時間點，對應于a)穩態發射、b)在初始暴露于微波脈沖時的 發射、c)在微波脈沖開始過程中和d)在脈沖過程中的最大'觸發'發射、e)最終的微波發 射。在記錄不相交的'蝶形領結'幾何結構強度圖像過程中，以約4. 5的系數降低CCD攝像 機增益，以防止飽和。隨后，相應地將得到的'蝶形領結'幾何結構的CCD像素強度等級，以 得到與從玻璃襯底記錄的化學發光強度的絕對對比。示出了在這些離散的時間點的對于普 通玻璃襯底(圖8)以及在不相交的'蝶形領結'接合點處(圖9)的化學發光發射的CCD圖 像。 玻璃和'蝶形領結'圖像二者的像素強度等級是相等的，以便精確地反映得自化學 發光反應的'按需'光子通量的顯著增加。此外，本文中顯示了在暴露于低功率微波脈沖過 程中由化學發光溶液產生的'光子通量'增加的實時電影記錄，以便證明熒光顯微鏡在微波 中的功能性，如圖IOA， B中所示。 本文中已經證明了在微波腔中構建熒光顯微鏡的可行性。使用這種光學構造，在 普通玻璃襯底上以及在接近離散的平坦構造幾何結構附近觀察到10 ii M Ru(by、Cl2溶液的 由微波誘導的實時溫度降低。化學發光發射結果顯示'蝶形領結'幾何結構的化學發光發射 有大約100倍的增加。關于化學發光反應的'觸發'，所述'觸發'的發射從由磁控管產生的 入射微波場最近的一側開始。化學發光溶液的CCD圖像描述了化學發光反應由于化學發光 溶液的微波加熱或介電損耗而得以促進。因為圖像(圖9B)的右側定向為最靠近磁控管， 可以看到'觸發'的發射從最靠近微波源的一側開始。在隨后的圖像(圖9C)中，觀察到由 微波腔的遠側壁反射的波引起的觸發發射(注釋在微波腔中產生駐波)。重要的是，'蝶 形領結'端部略加偏移，以便于觀察微波腔中的由反射波引起的'觸發'發射。
使用本文中所述的微波聚焦和觸發技術，證明了捕獲由微波誘導的溶液加熱和被 加速的化學發光反應的實時圖像的可行性。
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權利要求
微波/光學成像系統，包括a)被封閉的容器，其包括微波腔并且在其中具有至少一個開口；b)設置于微波腔中用于保持至少一個樣品的樣品板，其中樣品包括檢測劑分子或進行能夠被檢測的反應的組分；c)通信連接于微波腔用于將微波能量遞送進微波腔中并朝向樣品引導的微波能量產生源；和d)通信連接于微波腔的光學成像裝置，其設置為用于將來自電磁能量產生源的激發光引導到樣品并且捕獲由樣品發射的發光發射。
2. 權利要求l的系統，其中所述微波腔包括用于保持樣品板的平臺。
3. 權利要求l的系統，其中所述檢測劑分子是熒光團。
4. 權利要求1的系統，其中被遞送的微波能量具有2GZ-3GZ的頻率和約10毫瓦特-700 瓦特的功率水平。
5. 權利要求1的系統，其中樣品包括至少一種生物分子，其中所述生物分子選自核酸、 芳香碳環結構、NADH、 FAD、氨基酸、蛋白質、肽、碳水化合物、甾族化合物、核黃素、DNA、 RNA、 寡核苷酸、核酸、脂肪酸、肌紅蛋白、糖類例如葡萄糖等、維生素、輔助因子、嘌呤、嘧啶、間型 霉素、脂質、植物光敏色素、phytofluor、肽、脂質、抗體和藻膽蛋白。
6. 權利要求1的系統，其中所述光學成像裝置包括 用于以一定頻率產生能量來激發樣品的電磁能量產生源； 設置用于將電磁能量聚焦在樣品上的物鏡；設置在激光器和物鏡之間的二向色鏡，用于將來自能量源的電磁能量反射到物鏡以及 用于引導來自受激發的樣品的發射信號；設置在二向色鏡后面的管透鏡，用于收集來自樣品的發射并將其引導到檢測器裝置。
7. 權利要求6的系統，其中所述物鏡捕獲由受激發的樣品發射的信號。
8. 權利要求l的系統，其中所述樣品板包括沉積在樣品板表面上的至少一層金屬材 料，其中所述金屬材料包括銀、金、銅、鋅、鋁或鉑。
9. 權利要求8的系統，其中所述金屬材料形成為帶圖案的形狀。
10. 權利要求9的系統，其中所述帶圖案的形狀包括具有至少一個頂端的幾何形狀并 且其中多個頂端彼此相鄰或相對從而在其之間產生反應性區域。
11. 權利要求10的系統，其中所述幾何形狀選自三角形、正方形、矩形、梯形、多邊形、 拋物線形、橢圓形、圓的扇形，及其組合。
12. 權利要求10的系統，其中將至少一個樣品置于反應性區域中并接觸微波能量且受 激發能量輻射。
13. 權利要求12的系統，其中所述樣品板包括多個孔，其中所述反應性區域位于所述 孔內并且暴露于微波能量下增強其中的反應。
14. 權利要求12的系統，其中所述反應性區域具有的在相鄰和相對頂端之間的距離為 2mm到約3mm。
15. 權利要求1的系統，其中所述樣品板由玻璃或聚合材料制成。
16. 使由微波誘導的生物分子的反應或相互作用實時數據成像的方法，所述方法包括a) 提供包括至少一種生物分子和檢測劑分子的樣品，其中將所述樣品設置在樣品板上；b) 將樣品置于微波腔中，其中所述微波腔通信連接于微波產生源并且還通信連接于光學成像系統，其中所述光學成像系統包括用于以一定頻率產生能量來激發樣品的電磁能量產生源；設置用于從所述電磁能量產生源接受激發電磁能量并將其聚焦在樣品上的物鏡；設置在激光器和物鏡之間的二向色鏡，用于將來自能量源的電磁能量反射到物鏡以及用于引導來自樣品的發射信號；設置在二向色鏡后面的管透鏡，用于收集來自樣品的發射并將其引導到檢測器裝置；c) 用一定量的低功率微波能量輻射樣品以增加樣品中的相互作用或反應；禾口d) 用步驟b)的光學成像系統將檢測劑分子的發射信號成像。
17. 權利要求16的方法，其中生物分子的相互作用包括在表面處、在溶液中以及在活生物體中的蛋白質_蛋白質、DNA-蛋白質、RNA-蛋白質、DNA-RNA、化學品_蛋白質、化學品-DNA相互作用。
18. 權利要求16的方法，其中所述反應包括產生化學發光信號的化學反應。
19. 權利要求16的方法，其中所述微波腔包括用于保持樣品板的平臺。
20. 權利要求16的方法，其中所述低功率微波能量具有2GZ-3GZ的頻率和約10毫瓦特-700瓦特的功率水平。
21. 權利要求16的方法，其中所述樣品包括至少一種生物分子，其中所述生物分子選自核酸、芳香碳環結構、NADH、 FAD、氨基酸、蛋白質、肽、碳水化合物、甾族化合物、核黃素、DNA、 RNA、寡核苷酸、核酸、脂肪酸、肌紅蛋白、糖類例如葡萄糖等、維生素、輔助因子、嘌呤、嘧啶、間型霉素、脂質、植物光敏色素、phytofluor、肽、脂質、抗體和藻膽蛋白。
22. 權利要求16的方法，其中所述樣品板包括沉積在樣品板表面上的至少一層金屬材料，其中所述金屬材料包括銀、金、銅、鋅、鋁或鉑。
23. 權利要求22的方法，其中所述金屬材料形成為帶圖案的形狀。
24. 權利要求23的方法，其中所述帶圖案的形狀包括具有至少一個頂端的幾何形狀并且其中多個頂端彼此相鄰或相對從而在其之間產生反應性區域。
25. 權利要求24的方法，其中所述幾何形狀選自三角形、正方形、矩形、梯形、多邊形、拋物線形、橢圓形、圓的扇形及其組合。
26. 權利要求24的方法，其中將至少一個樣品置于反應性區域中并接觸微波能量且受激發能量輻射。
27. 權利要求26的方法，其中所述樣品板包括多個孔，其中所述反應性區域位于所述孔內并且暴露于微波能量下增強其中的反應。
28. 權利要求26的方法，其中所述反應性區域具有的在相鄰和相對頂端之間的距離為2mm到約3mm。
29. 權利要求16的方法，其中所述樣品板由玻璃或聚合材料制成。
全文摘要
本發明涉及通信連接于微波能量產生源的光學成像系統，其中該組合提供化學反應時間的提高以及實時監測反應的能力，并且具有足夠的分辨率以便在施加微波場的過程中觀察活細胞和組織中的用熒光分子標記的細胞內組分的位置以及與其它生物分子之間的相互作用和對局部化環境變化的響應。
文檔編號G01N21/64GK101743467SQ200880024921
公開日2010年6月16日 申請日期2008年6月4日 優先權日2007年6月4日
發明者克里斯·D·格迪斯, 邁克爾·J·R·普雷維特 申請人:馬里蘭大學生物技術研究所