使用微粒和獨特探針組篩選結合相互作用的方法

專利名稱：使用微粒和獨特探針組篩選結合相互作用的方法
技術領域：
本發明涉及使用多組微粒篩選結合相互作用的方法，其中所述組具有相同的可鑒 別特征并且其中多組中的一組包括微粒亞群，所述亞群呈現至少一種獨特的探針，該探針 用作生物樣品中靶分子的結合對象(partner)。具體來說，本發明提供使用這些多組微粒檢 測供體組織或受體組織中的組織分型抗原的方法。
背景技術：
一種此類組織分型抗原是人白細胞抗原(HLA)。個體可能在懷孕期間或通過輸血 或之前的器官移植而對HLA抗原敏感。測定對HLA等位基因敏感性的測試涉及組織和器官 移植，其中受體中存在抗供體HLA抗原的抗體(供體特異性交叉配血(crossmatch))是高 風險移植排斥的前兆。在移植領域中標準的實施方式是測試抗一系列經選擇代表人群的 HLA抗原的所有可能受體，并檢測血清反應性的HLA等位基因的百分比。在這個系列反應性 抗體(PRA)中，患者血清抗正常人群中存在的高百分比HLA等位基因的測試反應是高風險 移植排斥的前兆。HLA 基因座本質上是高度多態的。如 Nomenclature for Factors of theHLA System 2000 (Hum. Immunol. ；62(4) :419_68)，2001)中所公開，有 124 種 HLA-A 等位基因、 258種HLA-B等位基因、74種HLA-C等位基因、221種HLA-DRBl等位基因、19種DRB3等位 基因、89種DRB4等位基因、14種DRB5等位基因、19種DQAl等位基因和39種DQBl等位基 因，還不斷發現新的等位基因。作為這種快速過程的證實，世界衛生組織HLA因子命名委員 會(WHO nomenclature Committee for Factors of the HLASystem)(www. anthonynolan. com/HIG/) 2007年4月的修訂本中顯示有545種HLA-A等位基因、895種HLA-B等位基因、 307種HLA-C等位基因、8種HLA-E等位基因、12種HLA-H等位基因、9種HLA-J等位基因、 6種HLA-K等位基因、4種HLA-L等位基因、4種HLA-P等位基因、3種HLA-V等位基因、3種 DRA等位基因、494種DRBl等位基因、1種DRB2等位基因、44種DRB3等位基因、13種DRB4 等位基因、18種DRB5等位基因、3種DRB6等位基因、2種DRB7等位基因、10種DRB8等位基 因、1種DRB9等位基因、34種DQAl等位基因、83種DQBl等位基因、23種DPA1、126種DPBl 等位基因、4種DMA等位基因、7種DMB等位基因、12種DOA等位基因和9種DOB等位基因。所有的HLA-A、-B和-C等位基因都具有類似的序列。對于DRBl、DRB3、DRB4和DRB5 序列情況也相同。由于這些相似性，極為通常的情況是當引物對用于實施聚合酶鏈式反應 序列特異性引物(PCR SSP)時，將擴增兩種或更多種等位基因，或者在診斷性序列特異性寡 核苷酸探針檢測(SSO)體系中，兩種或多種等位基因將雜交。因此，對于各個等位基因，要 具有獨特的PCR-SSP或檢測-SSO模式，必須使用許多對引物或探針。此外，在HLA分型中 診斷雜交SSO探針的使用會被HLA等位基因所具有的高水平的同源性所混淆。因此，許多 現有的分型方法(如Bugawan等人，TissueAntigens 44 137-147 (1994)中的那些)缺乏HLA分型和其他應用所需的準確度。可以使用PCR來鑒定靶DNA模板上的序列。如果發生了擴增，則模板DNA含有與所 使用的引物相同的序列。如果擴增沒有發生，則模板DNA上的序列與引物序列不同。Newton 等人，美國專利5，595，890公開了用于分型的PCR診斷方法，包括使用PCR-SSP的HLA的分 子分型。根據這種方法，以多循環PCR的陽性或陰性反應模式為基礎來分配未知的等位基 因。然而，Newton所公開的方法對于HLA分型的效力有限，這是由于如上所述的HLA中的高 度多態性所致。結果，各自具有特定序列的兩個引物頻繁擴增很多HLA等位基因，從而增加 所需的PCR擴增數以分配未知的等位基因。由于類似的原因，在非PCR方法中正確的HLA分 型需要多種診斷探針。PCR需要一對引物與DNA模板上要擴增的區域側面相接。引物退火 至所需序列的能力取決于引物的長度和PCR熱循環程序中所設置的退火溫度。引物越長， 則需要越高的退火溫度來達到DNA序列的特異性擴增。PCR-SSP使用引物長度和退火溫度 之間的平衡來達成弓I物指導的序列擴增的特異性。在用于HLA分型的PCR-SSP系統的臨床應用中，需要使用有限數目的PCR反應來 ＝達成盡可能高的分辨率，從而降低引物對所擴增的等位基因數(即，增加引物或探針的特 異性)。本發明所關注的是共同擁有的美國專利6，207，379的公開內容(其公開內容以引 用方式并入本文)，它教導了診斷PCR引物的用途，其特征在于不連續(缺口)序列用于在 HLA分型中獲得相關等位基因之間的更大差異。在另一實施方式中，U. S. 6，207，379教導了 與靶核酸中的不連續序列雜交并通過聚合酶介導的引物延伸擴增該靶的診斷引物用途。盡 管U. S. 6，207，379方法成功地進行了靶HLA序列更特異地擴增，但仍然需要改良的方法來 檢測PCR和非PCR方法中的HLA序列。U. S. 6，207，379中所述的PCR發明解決了本領域內的下列需要改良 PCR-SSP-基分子分型方法，從而可增加分型的特異性以便減少每次分型所需要的PCR反 應數。然而，本領域內還需要在非PCR方法中探測特定序列的方法。由于基本的熱力學原 因，探針和模板(包括完全配對的那些)處于雜交和非雜交狀態之間的平衡狀態中。探針 在一個時刻與其靶模板相連，在另一時刻可能不相連。PCR中的聚合酶通過延長(引物延 伸)將引物鎖定在適當位置而發揮關鍵的作用。在非PCR方法中，缺乏關鍵的因子-聚合 酶(和隨后的延長)，并不必須預期得到靶標短探針的長期穩定的雜交雙鏈。由于這些原 因，通常認為雜交探針需要比相應的延伸引物更長以便確保穩定的雙鏈形成。以引用方式全文并入本文的美國專利公布US 2003-0165925A1提供了檢測HLA核 酸和T細胞受體核酸序列的改良方法，從而增加了診斷探針的特異性。這些方法中特異性 增加是因為至少一種探針能夠識別靶標的兩個或更多個區域并且這能夠在不增加靶核酸 序列的探針的退火溫度的條件下如此進行。探針組的特異性增加降低了所檢測的等位基因 數目，從而增加了該方法的分辨率，并且在較低的成本下達成。目前，基于DNA的(DNA-based)組織分型方法是昂貴且耗時的，因為這些方法需要 檢測許多不同的標簽以區分不同的SSO探針，如通過流式細胞術或來自照相機或顯微鏡的 目視圖像，如生物陣列(Bioarray)。盡管理論上可以制備無限數目的代表不同寡核苷酸探 針的獨特標記微粒，但是在使用諸如熒光標記的流式細胞術等單個分析期間可以區分和測 量的標簽數在實際上是有限的。因此，本領域內需要可以在單個分析中使用有限數目的獨 特標記微粒檢測最大量的寡核苷酸探針。

發明內容
本發明提供從有限的微粒組中獲得更多數據的方法。當前可用的微粒組具有有限數目的可鑒別特征(如，熒光標簽)。使用常規方法一次可以檢測的特征數有限。然而，需 要篩選的測試分子數則在持續增加。例如，對于基于DNA的組織分型，HLA抗原數目和多態 性在日益增加，供體樣品的完整HLA篩選需要數百種探針。使用常規方法，完整的初步HLA 篩選需要多個分析。本發明的改良方法使得能夠使用較少的不同標記的微粒來篩選更多的 靶分子，從而測量較少的特征，最終進行較少的分析運行。本發明的改良方法采用各自具有不同的可鑒別特征的多組微粒。本發明的改良 涉及使微粒組上呈現具有相同可鑒別特征的一種或多種不同探針，如各自經相同的熒光標 簽包埋的一組微粒。因此，該分析可以在檢測相同或更少的可鑒別特征時篩選更多的靶分 子。例如，可以使用100種不同標記的微粒來篩選多于100種的靶分子；或者，可以使用少 于100種的不同標簽來篩選100種靶分子。本發明方法的探針充當生物樣品內靶分子的結合對象。探針可以是任何結合對 象，包括核酸，如寡核苷酸、引物或與靶分子核酸互補的任何核酸。結合對象還可以是與靶 分子抗體結合的抗原，如肽抗原或蛋白；或與肽抗原或蛋白靶分子結合的抗體。此外，所述 結合對象可以是結合靶分子蛋白的任何蛋白，如受體和配體或復合的蛋白。結合相互作用
是任何蛋白結合對象之間的結合事件或核酸與SSO探針或引物或任何其他互補核酸的雜 、-父。這些方法優選使用呈現探針的微粒進行，所述探針與生物樣品內的靶分子結合， 這種結合相互作用會產生可檢測的信號。根據本發明的優選方面，所述探針可以是與DNA 樣品雜交(結合)的序列特異性寡核苷酸(SSO)探針。或者，所述探針可以是與生物樣品 中的抗體或另一種蛋白結合的肽、抗體或蛋白抗原。本發明的靶分子可以是生物樣品中所關注的任何分子。本發明的方法是篩選靶分 子。在一個實施方式中，本發明的方法用于篩選組織分型等位基因。此方法可以使用任何 組織分型等位基因進行。整個說明書都描述HLA組織分型等位基因，但這些方法可以使用 任何組織分型抗原進行。本發明提供使用與具有獨特可鑒別特征的微粒(如微球或珠子)結合的探針進行 組織分型的改良方法。本發明的方法用有限數目的可檢測標記的且不同的可鑒別微粒組產 生更多的組織分型信息，這通過使用一組或多組具有相同可檢測標簽的微粒達成，但是其 中相同標記的微粒組包括具有不同探針的多個微粒亞組。例如，一組可以包括均用相同的熒光染料標記的10個微粒亞組，其中所述微粒亞 組具有不同的探針固定到其表面。使用這種方法，可以使用有限數目的不同標記的微粒篩 選更多種不同的組織分型抗原。在一個示例性實施方式中，本發明的改良方法可以通過將1000種不同的探針固 定在大量珠子(微粒)上而篩選1000種不同的組織分型。所標記的珠子被分為100組以 便各組由具有10種獨特探針但用相同的熒光染料或熒光染料的獨特組合標記的10個亞組 珠子構成。因此，許多相同標記的珠子(發射相同信號)將呈現不同的探針。因此，在示例 性篩選中，檢測了 100種不同的熒光信號或信號的組合，但檢測了 1000種不同的探針。
相反，可以使用許多較少的獨特標記來篩選相同數目的靶分子。因此，此方法使得能夠篩選許多組織分型抗原等位基因而僅使用更有限數目的標記珠子。此外，本發明的改 良方法更有效且需要較少的人力。改良方法需要較少的人力是因為對較高分辨率測試之前 進行低分辨率測試的需求較低。隨后，在促進結合相互作用的條件下，如促進抗體/抗原結合的條件或促進核酸雜交的條件，使生物樣品接觸多組微粒。可以檢測生物樣品內靶分子之間的結合相互作用， 最優選的是通過產生代表結合的信號的信號體系進行并檢測表明生物樣品對于靶分子是 陽性的信號。盡管本發明方法的實施通過給定數量的獨特標記的珠子增加了所分析的獨特靶分子的數量，但是該方法對假陰性報告更敏感，這與現有技術方法的相反，在現有技術方法 中所有給定的珠子組都是特定靶分子特異性的。例如，在基于DNA的HLA測試中，通常的情 況是很少的SSO在DNA樣品中具有雜交對象。因此，對于任何給定組的寡核苷酸探針，少 至一個亞組的探針會報告與樣品呈陽性反應，如果有的話(if at all)。在這種情況下，在 給定探針組中的剩余亞組將不報告陽性反應并且所有給定組的微粒所提供的整體信號，以 及平均值和中值信號將會很低。因此，存在報告假陰性的可能(即，沒有報告真正的陽性反 應)。盡管本發明提供篩選更多數量的靶分子的能力，這些假陰性的可能性將在諸如組織移 植領域等領域導致破壞性的后果。根據本發明的另一方面，假陰性的風險通過選擇選定比例的產生陽性信號的組用 于進一步評定來降低。此步驟稱為“過濾步驟”。所選比例是產生最大強度的代表靶分子結 合的信號的一些比例。因為此方法排除了一些真陰性比例，所以真陽性的存在可以更可靠 地測定。在一個實施方式中，本發明提供篩選結合相互作用的方法，該方法包括下列步驟 a)制備多組獨特可鑒別微粒，其中在一組中的所述微粒具有相同的獨特可鑒別特征，并且 其中一組或多個組包括兩個或多個微粒亞組，所述亞組呈現至少一種獨特的探針，該探針 用作生物樣品中靶分子的結合對象；b)在生物樣品中的靶分子與探針結合的條件下使所 述多組微粒與生物樣品接觸；c)通過產生代表靶分子和探針之間結合相互作用的信號來 檢測生物樣品內靶分子與所述微粒上的探針的結合；d)測量代表所述微粒的結合相互作 用的信號；e)測定所述獨特可鑒別微粒組代表結合相互作用的信號是否大于所選的閾值， 該閾值代表所述生物樣品中存在一種或多種靶分子；以及e)測定代表結合相互作用的獨 特可鑒別微粒組的數目。在一個方面，本發明提供的方法中，在至少一個獨特可鑒別微粒組中的至少一個 微粒亞組以非1 1的固定數量比存在。示例性的比率為約1 2、約1 3、約1 4、約 1 5、約 2 3、約 3 4、約 4 5、約 7 8、約 8 9、約 1 10、約 1 25、約 1 50、 約1 100。該比例可以是整數比或非整數比。在本發明的一個實施方式中，探針為SSO探針，靶分子為核酸，生物樣品為樣品 DNA，結合相互作用為樣品DNA中的核酸與SSO探針的雜交。在本發明的一個方面，SSO探 針是如下組織分型抗原等位基因特異性的HLA、HNA、血型、KIL或TCR。所述樣品DNA可以 自任何來源獲得，如得自頰拭子或血液。在本發明的另一個實施方式中，所述探針是肽或蛋白抗原，靶分子是抗體，結合相互作用是抗體與肽或蛋白抗原的結合。在本發明的一個方面，所述靶分子是對HLA、HNA、血 型抗原、TCR或KIL特異性的抗體。篩選結合相互作用的方法還可以包括下列步驟選擇小于100%的展示最大信號 的微粒的比例，所述信號代表一組或多組獨特可鑒別微粒的相互作用；測定對于所選比例， 所述可獨特鑒別微粒組代表結合相互作用的信號是否大于所選的閾值，該閾值代表所述生 物樣品中存在一種或多種靶分子。可以這樣實施這些方法其中至少一組獨特可鑒別微粒中的至少兩個微粒亞組以 非約1 1的固定數值比率存在，并且其中該比率決定了該組微粒的所選比例。示例性的 比率為約1 2、約1 3、約1 4、約1 5、約2 3、約3 4、約4 5、約7 8、約 8 9、約1 10、約1 25、約1 50、約1 100。比率可以為整數比或非整數比。微粒組的所選比例可以為小于50%、小于30%、小于20%或小于10%。在優選的 實施方式中，微粒組的所選比例為小于或等于呈現所述珠子組的獨特探針的微粒亞組的數 目的倒數。在又一實施方式中，本發明提供基于DNA的組織分型方法，該方法包括下列步驟 a)制備多組獨特可鑒別微粒，其中在一組內的所述微粒具有相同的獨特可鑒別特征，并且 其中一組或多個組包括微粒亞組，所述亞組呈現至少一種經選擇與組織分型抗原等位基因 雜交的獨特的序列特異性寡核苷酸(SSO) ；b)在雜交條件下使所述多組微粒與樣品DNA接 觸；c)通過產生代表樣品DNA與SSO雜交的信號來檢測在樣品DNA與所述微粒上的SSO的 雜交；d)測量代表樣品DNA與所述微粒的SSO雜交的信號；e)檢測所述獨特可鑒別微粒組 是否有代表樣品DNA/SS0雜交的信號。在另一實施方式中，本發明提供基于DNA的組織分型方法，該方法包括下列步驟 a)制備多組獨特可鑒別微粒，其中在一組內的所述微粒具有相同的獨特可鑒別特征，并且 其中所述組包括微粒亞組，所述亞組呈現至少一種經選擇與組織分型抗原等位基因雜交的 獨特的序列特異性寡核苷酸(SSO) ；b)在雜交條件下使所述多組微粒與樣品DNA接觸；c) 通過產生代表樣品DNA與SSO雜交的信號來檢測樣品DNA與所述微粒上的SSO的雜交；d) 測量代表樣品DNA與所述微粒的SSO雜交的信號；e)選擇小于100%的顯示最大信號的微 粒比例，所述信號表示至少一組獨特可鑒別微粒的樣品DNA/SS0雜交；f)測定所述獨特可 鑒別探針組代表樣品DNA/SS0雜交的信號對于所選比例是否大于所選的閾值，該閾值表示 在所述樣品中存在一種或多種組織分型抗原等位基因；以及g)測定顯示DNA/SS0雜交的可 獨特鑒別微粒組的數目。DNA組織分型的方法還包括下列步驟選擇小于100%的顯示最大信號的微粒的 比例，所述信號表示至少一組獨特可鑒別微粒的DNA/SS0雜交；以及測定所述獨特可鑒別 微粒組代表DNA/SS0雜交的信號對于所選比例是否大于所選的閾值，該閾值表示在生物樣 品中存在一種或多種組織分型等位基因。 可以進行這些基于DNA的組織分型方法，其中在至少一組獨特可鑒別微粒中的至 少兩個微粒亞組以非約1 1的固定數值比率存在。示例性的比率為約1 2、約1 3、 約 1 4、約 1 5、約 2 3、約 3 4、約 4 5、約 7 8、約 8 9、約 1 10、約 1 25、 約1 50、約1 100。該比率可以為整數比或非整數比。微粒組的所選比例可以小于50%、小于30%、小于20%或小于10%。在一個優選實施方式中，微粒組的所選比例小于或等于呈現所述微粒組的獨特SSO探針的微粒亞組數 目的倒數。在本發明的一個方面中，所述SSO探針是諸如HLA、HNA、血型、KIL或TCR等組織分 型抗原等位基因特異性的。所述樣品DNA可以得自任何來源，如頰拭子或血液。本發明的這些方法還可以包括報告陽性雜交信號的步驟。這些方法還可以包括為 各可鑒別探針組選擇具有最強信號的微粒比例的步驟。在又一實施方式中，本發明提供基于DNA的組 織分型方法，該方法包括下列步驟 a)使呈現獨特的序列特異性寡核苷酸(SSO)的大量不同微粒組與樣品DNA接觸以鑒別由樣 品DNA編碼的組織分型抗原等位基因，其中獨特地鑒別所述微粒組，并且測定存在于所述 可鑒別微粒組的SSO是否與樣品DNA內的等位基因雜交；b)改進包括制備多組具有相同 的獨特可鑒別特征的獨特可鑒別微粒，其中所述組包括微粒亞組，各亞組呈現至少一種經 選擇與HLA等位基因雜交的獨特的序列特異性寡核苷酸(SSO) ；c)在雜交條件下使所述多 組微粒與樣品DNA接觸；d)通過產生代表樣品DNA與SSO雜交的信號來檢測樣品DNA與所 述微粒上的SSO的雜交；e)測量代表樣品DNA與所述微粒的SSO雜交的信號；f)測定所述 獨特可鑒別微粒組代表樣品DNA/SS0雜交的信號是否大于所選的閾值，該閾值表示在所述 樣品中存在一種或多種HLA等位基因；以及g)測定顯示DNA/SS0雜交的獨特可鑒別微粒組 的數量。在又一實施方式中，本發明提供用于實施測量結合相互作用的方法的試劑盒，該 試劑盒包括具有相同獨特可鑒別特征的多組獨特可鑒別微粒，其中所述組包括微粒亞組， 所述亞組呈現至少一種獨特探針，該探針與生物樣品內的靶分子結合。試劑盒的靶分子可 以是HLA等位基因、HLA等位基因、HNA抗原、HNA等位基因、血型抗原、TCR或KIL。在一個 方面，試劑盒的探針為SSO或引物。在另一方面，試劑盒的探針為肽或蛋白抗原。在另一實施方式中，本發明提供用于實施基于DNA的組織分型方法的試劑盒，該 試劑盒包括具有相同獨特可鑒別特征的多組獨特可鑒別微粒，其中所述組包括微粒亞組， 所述亞組呈現至少一種經選擇與組織分型抗原等位基因雜交的獨特的序列特異性寡核苷 酸(SSO)。所述試劑盒的組織分型抗原可以是HLA、HNA、血型抗原、TCR或KIL。實施方式本發明涉及用于組織分型移植供體和受體的方法，該方法使用結合至具有獨特 可鑒別特征的微粒或珠子的探針進行。該方法涉及用具有相同可鑒別特征的一組珠子 進行篩選，其中不同探針固定在所述珠子上。這些方法包括基于DNA的和基于蛋白的 (protein-based)組織分型。該方法涉及制備多組珠子，其中各組具有獨特可鑒別特征。在優選的實施方式中， 獨特可鑒別特征是一些多種嵌入的可檢測標簽(如熒光染料)的組合。在一組內的各個珠 子呈現至少一種與組織分型抗原(如樣品DNA中的HLA)結合的探針。對于基于DNA的組 織分型，所述探針是與樣品DNA雜交的序列特異性寡核苷酸(SSO)。對于基于蛋白的組織分 型，所述探針是與生物樣品內的抗體或另一種蛋白結合的肽或蛋白抗原。對于基于DNA的組織分型，樣品DNA可以自來自移植供體或移植受體的生物樣品 或組織獲得，編碼所關注組織分型抗原的基因或含有該組織分型抗原的等位基因或多態性 的區域通過PCR來擴增。在諸如中度嚴格的雜交條件或高度嚴格的雜交條件等雜交條件下使擴增的樣品DNA(或PCR產物)接觸所述多組珠子。樣品DNA和珠子上SSO探針的雜交 產生代表雜交的信號，用本領域內的標準方法來檢測和測量該信號，如流式細胞術或顯微 鏡和/或照相機產生的視覺圖像。在優選的實施方式中，所述信號由如下方法產生用諸如 藻紅蛋白(PE)或異氰酸熒光素(FITC)之類的熒光染料和諸如生物素之類的標簽標記樣品 DNA，其中相應的鏈霉親和素與熒光染料結合。也可以將與六聚組氨酸結合的熒光染料與用 鎳標記的樣品DNA組合使用。陽性事件是其中SSO探針與樣品DNA雜交的事件。所述信號 還可以使用固定的SSP引物產生以用標記的核苷酸檢測延長事件。選擇陽性珠子亞組的比例。優選地，所選的比例顯示最大的信號，該信號代表靶分 子和各獨特可鑒別珠子組的探針的特異性結合相互作用，如樣品DNA/SS0雜交或抗體/抗 原結合。對所選比例的陽性珠子所發射的信號進行統計分析以測定可檢測標簽所發射的信 號強度的平均值或中值(或任何其他統計量，如峰值、修剪均數、修剪峰值等)。陽性珠子 亞組的比例優選地通過篩選分析中所用的不同的探針數和不同的標記珠子數來確定。陽性 珠子是發射的信號大于所選閾值的那些，其中所述閾值代表樣品DNA中存在一種或多種組 織分型抗原等位基因。用于分析使用流式細胞術的信號的示例性軟件得自Luminex，Inc. (Austin，TX)和 BD Biosciences (San Jose，CA )。其他軟件的實例包括 WinMDI (Windows Multiple Document Interface for FlowCytometry) > FCS Express(De Novo Software, Thornhill, ON Canada)、FlowJO(Tree Star，Inc.)。陽性珠子亞組將表明樣品 DNA 或生物 樣品中可能存在的組織分型抗原的數目。可以使用本領域內的標準分析可檢測標簽強度的 軟件來分析數據。檢測陽性珠子(在過濾步驟之后)的所選閾值對于任何單獨的探針都是相同的。 所選閾值通常通過分析已知的陽性樣品組和已知的陰性樣品組并鑒別兩者之間的差異來 確定。然后在該差異內設定閾值。本發明提供利用在珠子上具有相同可鑒別特征的多種探針來進行基于DNA的組 織分型或基于蛋白的組織分型的改良方法。使用固定在珠子上的一個亞組的具有相同可 鑒別特征的多種探針使得能夠檢測來自陽性珠子的更強的信號，因為僅檢測一個特征或信 號。此外，使用本發明的改良方法檢測的信號接近由特異性結合相互作用(如DNA/SS0雜 交或抗體/抗原結合)產生的實際信號強度的真實值。信號強度的真實值是使用常規方法 測量的值，該常規方法使用各自具有不同可鑒別特征的珠子，這些珠子各自具有不同的熒 光標記和獨特的SSO探針或肽探針。因此使用改良的方法檢測的信號與使用常規方法檢測 的信號類似。這種基于DNA的組織分型或基于蛋白的組織分型的改良方法的一個優點是初步 組織分型篩選提供很多關于樣品DNA或生物樣品中不存在的組織分型抗原的信息。然而， 由于體系固有的模糊性，關于樣品DNA或生物樣品中一定存在的抗原的信息可能稍欠精 確。降低系統模糊性的方法在下文描述。這種方法不太昂貴，因為其涉及了較少的不同的 可鑒別珠子，并且明顯縮小了樣品DNA或生物樣品中的可能的陽性抗原總數。而且，該方法 降低了人力成本，因為需要較少的測試循環。此外，該方法由于可以使用較多數目的探針的 同時使用較少數量的珠子而使得能夠測試更多數目的組織分型抗原基因序列。此外，該改 良的方法使得能夠在較短的時間內具有較高的分型分辨率，由于組織要盡快移植，因而這 是有利的。
分析在一組具有相同可鑒別特征的微粒中的多個微粒亞組會導致假陰性數目增 力口。具體地，如果DNA樣品僅與一組中的少量微粒(如一個微粒亞組)雜交，則雜交產生 的信號強度將會很低，可能被認為是陰性事件，即假陰性事件。為解決假陰性問題，選擇一 個產生陽性信號的所選比例用于進一步評定。這個所選比例將小于所有(100%)的陽性 組。優選地，陽性組的所選比例小于90%、小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小 于40%、小于30%、小于20%或小于10%的陽性微粒組。所選擇的比例可以依據組織分型 篩選中所用的SSO探針數和總微粒數而定。此外，該比例可以通過檢測信號的減少來選擇， 艮口，分析曲線的斜率。其中相同標記的蛋白能夠與多種不同靶標結合的體系的固有模糊性可以通過在 不同的微粒組和亞組中探針的適當排列來降低。微粒上SSO或基于蛋白的探針的選擇使得 能夠檢測特定的等位基因或特定的抗原。例如可以將一組內的SSO類型或不同組之間的類 型設計成容許選擇性地消除某些等位基因或選擇少數等位基因。這些探針類型可以在一組 微粒中具有多拷貝的相同探針或者在不同組微粒中具有多拷貝的相同探針。相同探針的數 目和不同探針比率的變化使得能夠通過較少的分析產生額外的數據。本發明具體提供在一組微粒中的探針亞組，其中一組的所述微粒具有相同的可鑒 別特征，并且探針數目在不同亞組之間不同。亞組之間的探針比率使得能夠進行生物樣品 內靶分子(如HLA等位基因)存在的復雜分析。單個微粒組內亞組之間探針比率的變化使 得能夠選擇較大比例的陽性事件用于進一步的統計分析，或換句話講，在過濾步驟中將選 擇較大比例的事件，而降低假陰性事件的可能。在另一實施方式中，單個組內亞組之間探針比率的變化可以降低體系內的模糊 性，這通過容許根據產生某些信號的微粒的百分比鑒別靶分子來達成。計算機算法的使用將容許陽性探針類型分析或探針比率變化分析以測定特定組 織分型或測定罕見等位基因的存在對常見等位基因的存在。更有效的是使用SSO類型或具 有相同可鑒別特征的一組微粒的亞組之間不同比例的SS0，而不是使用各自含有不同SSO 和不同可鑒別特征的一組100種微粒來進行復雜分析。本發明的優選實施方式使用呈現用于基于DNA的組織分型的SSO的微粒。然而，本 發明還提供使用呈現用于檢測生物樣品中的抗體的組織分型抗原的微粒的組織分型方法。 改良的發明關于基于DNA的組織分型的優點對于基于蛋白的分析(抗原/抗體反應)也是 有利的。例如，珠子亞組可以用HLA * A * 0201抗原、HLA * A * 0202抗原和/或HLA * A女0203抗原標記以檢測生物樣品中結合這些抗原的抗體的存在。本發明的方法可以用任何材料的微粒、微珠、珠子或微球進行，所述材料如二 氧化硅、金、乳膠、聚合物，如聚苯乙烯、聚砜和聚乙基或水凝膠。其他的示例性微粒用 染料編碼，將寡核苷酸固定在編碼的微粒上。用于本發明方法的微粒購自諸如Luminex Inc.，Invitrogen (Carlsbad, CA)、Polysciences Inc. (Warrington, PA)禾口 Bangs Laboratories (Fishers, IN)等來源。 本發明的微粒可以包含可檢測標簽或其他的鑒別特征。所述微粒可包含單種熒 光染料或多種熒光染料。在一個實施方式中，所述微粒用熒光染料進行內部標記并且含有 與生物分子共價連接的表面羧基基團。在另一個實施方式中，所述微粒用熒光染料進行內 部標記并且含有親和素表面層以便接近生物素和生物素化配體的共價結合。在另一個實施方式中，所述微粒可以包含不同染料的組合，如熒光和非熒光染料。例如所述微粒可以用E)-5-[2_(甲氧基羰基)乙烯基]胞苷標記，其為一種非熒光分子，在經受紫外線(UV)照射 時產生單一產物3-0-D-呋核亞硝脲-2，7-二氧代吡啶并[2，3-d]嘧啶，顯示強的熒光信 號。在另一個實施方式中，所述微粒可以包含條形碼作為可鑒別特征，如美國專利公布US 20070037195 中所述。在另一個實施方式中，所述微粒可以是納米晶體或量子點。這些納米晶體是 吸收光的光子，然后重新發射不同波長的光子(熒光團)的物質。此外，可以將另外的 熒光標簽或第二抗體結合至納米晶體。這些納米晶體購自諸如Invitrogen和Evident Technologies (Troy, NY)等來源。微粒的可鑒別特征可以是任何納米粒子基于DNA的檢測方法或任何納米粒子基 于蛋白的檢測方法。一個實例是生物條形碼，這是一種使用由DNA編碼的納米粒子探針 檢測蛋白的超敏感方法，所述DNA對生物樣品中的蛋白靶標是獨特的(Nam等人，Science 301，1884-1886,2003)。納米粒子基于DNA的檢測的實例包括基于巰基烷基寡核苷酸改 性的金納米粒子的比色多核苷酸檢測方法(Elghanian等人，Science 277，1078-1080， 1997)、依賴于光散射或銀染的芯片基檢測方法(Taton等人Science 289，1757-1760， 2000 ；Taton 等人，.J. Am. Chem. Soc.，123，5164-5165，2001)、用于 DNA 的電檢測方法，其中 使用夾心分析將靶DNA捕獲在兩個電極的間隙中(Park等人，Science 295，1503-1506， 2002)和使用同時在多個激光波長詢問的化學反應性衍射柵進行的DNA檢測(Cao等人， J. Am. Chem. Soc. 2003)。本發明可以用檢測可鑒別特征或標簽的任何體系來進行，如FLOW。熒光 標簽的檢測也可以使用能讀出微粒上圖像的顯微鏡或照相機來進行，如Bioarray BeadChip (Bioarray Solutions, Ltd. , Warren, NJ) BeadChip 形式結合了微粒(“珠子，，) 化學與半導體晶片工藝，其中使用光學顯微鏡和照相機記錄與微粒的結合。本發明方法中所用的樣品DNA由人移植或輸血的供體或人移植或輸血的受 體的生物樣品分離或提取。所述樣品DNA可以使用本領域內的任何常規方法制備， 如 Sambrook 等人’ Molecular Cloning :A Laboratory Manual, cold Springs Harbor Laboratories (New York, 1989)中所教導的那些。所關注的組織分型基因(如HLA)使用本 領域內標準的PCR技術擴增。 生物樣品包括全血、血液衍生物、紅細胞濃縮物、血漿、血清、新鮮的冷凍血漿、全 血衍生的血小板濃縮物、機采血小板、混合血小板、靜脈內球蛋白、冷沉淀物、腦脊液、 組織和細胞，如上皮細胞(如自口腔收集的那些)、干細胞、白細胞、中性粒細胞和粒細胞。 所述生物樣品可以自要用于移植的組織或細胞的人供體或要用于輸血的血液或血液衍生 物的人供體獲得。所述生物樣品可以自健康的骨髓供體或親子測試的受試者獲得。所述生 物樣品還可以自是預期的移植或輸血受體的人受試者或捐獻要用于移植或輸血的組織或 器官的人受試者獲得。或者，所述生物樣品可以從要用于在人受體中移植的組織或細胞直 接獲得。此外，所述生物樣品可以自要用于在人受體中輸血的血液或血液衍生物獲得。SS0 探針為了實施本發明的方法，將SS0探針結合至熒光標記的珠子。所述SS0探針還 可以含有標簽，如生物素，鏈霉親和素、鎳、六聚組氨酸、地高辛(DIG)、DNP，或熒光標簽，如FITC、PE、6-TAMRA、CR6G、DEAC、德克薩斯紅(Texas Red)、Cy3、Cy3. 5、CY5、Cy5. 5、Cy7、羅 丹明綠(Rhodamine Green)X。如本文所用的術語“核苷酸”是指存在于DNA或RNA中的核 苷酸，因此包括含有作為堿基的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶、以及作為脫氧 核糖或核糖的糖部分的核苷酸。然而，應了解，本發明所采用的診斷探針中可以使用能夠與 常規堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和鳥嘧啶之一進行堿基配對的其他經修飾的堿 基。此類經修飾的堿基包括例如，8-氮雜鳥嘌呤和次黃嘌呤。如本文所用的術語“寡核苷 酸”是指為200個核苷酸或更少的分子，優選的寡核苷酸為100個核苷酸或更少、50個核苷 酸或更少或25個核苷酸或更少。本文在涉及核苷酸時所用的術語“互補”是指核苷酸與另一特定核苷酸堿基配對。 因此腺苷一磷酸與尿苷一磷酸或胸苷一磷酸互補，鳥苷一磷酸與胞苷一磷酸互補。應了解 盡管胸苷一磷酸與鳥苷一磷酸在某些情況下可能堿基配對，但它們用于本說明書的目的時 不認為是互補的。也應了解盡管胞苷一磷酸與腺苷一磷酸在某些情況下可能堿基配對，但 它們用于本說明書的目的時不認為是互補的。對于胞苷一磷酸與尿苷一磷酸也同樣適用。選擇用于本文方法的SS0探針“基本上”與待檢測的各個特異性序列的不同鏈互 補。這意味著SS0探針必須足以與它們各自的樣品DNA鏈互補雜交。因此，所述SS0探針序 列不需要反映樣品DNA序列的準確序列。因此，探針序列沒有必要與靶樣品DNA序列嚴格 互補。因此，并非所有探針都會產生與陰性等位基因的陰性對照類似的完全陰性信號。依 據錯配數和錯配類型(G-T錯配有時產生與G-C配對大約相同的信號)，1個堿基對錯配的 等位基因的熒光信號可能產生實質上高于陰性對照的信號。然而，只要真陽性等位基因的 信號顯著高于那些可能交叉反應的等位基因(通常高10-20% )，便可以設定閾值或臨界值 以區分陽性和陰性反應。通常在探針序列中間可以接受少量的錯配，并容許雜交。一般來說，所接受的錯配 程度取決于SS0探針區域長度，這繼而影響去飽和溫度和雜交條件所選的退火溫度。如果 探針的去飽和溫度接近或高于退火溫度(略不嚴格)，則盡管有少量(通常1個或2個或最 多3個)錯配，但探針仍與靶序列連接。探針區域在序列中間可能能夠接受更多的錯配，但 是其這種能力依賴于探針區域的去飽和溫度和所選雜交和檢測條件的退火溫度。本文所用的術語“嚴格的”是指本領域內通常理解為嚴格的條件。雜交嚴格性主 要取決于溫度、離子強度、變性劑(如甲酰胺)的濃度。用于雜交和洗滌的嚴格條件的實例 為65-68°C下0. 015M氯化鈉、0. 0015M檸檬酸鈉；或在42°C下0. 015M氯化鈉、0. 0015M檸 檬酸鈉和 50% 甲酰胺。參見 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 第二版，ColdSpring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N. Y. 1989)。還可以使用更嚴格的條件(如較高的溫度、較低的離子強度、較高的甲酰胺、或其 他變性劑)，然而，雜交速率會受影響。在其中涉及脫氧寡核苷酸雜交的情況下，另外的示例 性嚴格雜交條件包括在37°C (對于14個寡核苷酸堿基)、48°C (對于17個寡核苷酸堿基)、 55°C (對于20個寡核苷酸堿基)和60°C (對于23個寡核苷酸堿基)下在6XSSC 0. 05% 焦磷酸鈉中洗滌。為了降低非特異性和/或背景雜交的目的，雜交和洗滌緩沖液中可以包括其他試 劑。實例為0.牛血清白蛋白、0. 聚乙烯-吡咯烷酮、0. 焦磷酸鈉、0. 十二烷 基磺酸鈉、NaDodS04、(SDS)、聚蔗糖、鄧哈特溶液(Denhardt，s solution)、超聲處理的鮭
15魚精液DNA(或其他非互補DNA)和硫酸葡聚糖，然而也可以使用其他合適的試劑。在基本 上不影響雜交條件的嚴格性的條件下，可以改變這些添加劑的濃度和類型。雜交實驗通常 在pH6. 8-7. 4下進行，然而，在通常的離子強度條件下，雜交速率幾乎不依賴于pH值。參見 Anderson 等人，Nucleic Acid Hybridisation :A PracticalApproach,第 4 章，IRL Press Limited (Oxford, England)。本領域的技術人員可以調節雜交條件以適應這些變量并容許 不同序列親緣性(relatedness)的DNA形成雜交體。診斷序列特異性寡核苷酸探針檢測(SSO)體系是一種使用診斷探針來分析特定 靶核酸序列存在的體系或裝置。在此類體系或裝置中，可以使用本領域內熟知的連接子將 診斷探針連接至支撐體，所述連接子包括多碳和多核苷酸連接子。或者，可以將靶序列固定 于諸如硝酸纖維素膜等固體支撐體上，并且診斷探針在溶液中。SSO中的診斷探針包括至少 一個探針區域。術語“探針區域”是指診斷探針上的與靶核苷酸序列的一部分基本互補的 核苷酸序列。標記可以在固定于珠子上的探針上或者在擴增的樣品DNA上。可以使用直接熒光 化合物、生物素、FITC或地高辛(Dig)作為標簽。對于間接檢測來說，可以將結合親和素/ 鏈霉親和素的熒光或酶(用于生物素)、抗FITC抗體(用于FITC)、抗Dig抗體(用于Dig) 用于檢測目的。根據一個實施方式，可以使用經羧基基團修飾的乳膠珠子來固定探針。珠 子上的羧基基團首先被1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化，然 后EDC-活化的羧基與寡核苷酸探針5’末端的氨基反應。也可以實施使用化學物質連接胺 與胺、硫化物與胺和其他化學物質的另一些實施例。組織分型抗原本發明提供用于人白細胞抗原(HLA)組織分型篩選的方法。HLA在機體內存在 于幾乎每個細胞的細胞表面，這些抗原在白細胞上是高濃度的。HLA抗原是免疫系統用于 識別和區分自我與非自我的主要決定子之一。如2007年4月，世界衛生組織HLA系統因 子命名委員會(WHO nomencIatureCommittee for Factors of the HLA System) (www. anthonynolan. com/HIG/)，有 545 種 HLA-A 等位基因、895 種 HLA-B 等位基因、307 種 HLA-C 等位基因、8種HLA-E等位基因、12種HLA-H等位基因、9種HLA-J等位基因、6種HLA-K等位 基因、4種HLA-L等位基因、4種HLA-P等位基因、3種HLA-V等位基因、3種DRA等位基因、 494種DRBl等位基因、1種DRB2等位基因、44種DRB3等位基因、13種DRB4等位基因、18種 DRB5等位基因、3種DRB6等位基因、2種DRB7等位基因、10種DRB8等位基因、1種DRB9等 位基因、34種DQAl等位基因、83種DQBl等位基因、23種DPA1、126種DPBl等位基因、4種 DMA等位基因、7種DMB等位基因、12種DOA等位基因和9種DOB等位基因。本發明不限于包括HLA抗原篩選的組織分型方法。本發明的方法可用于篩選用于 組織或血液分型的任何抗原。例如，該方法可篩選殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、人中 性粒細胞抗原(HNA)、T細胞受體(TCR)以及它們的片段和血型，如ABO、RH因子。殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)
殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)是在淋巴細胞亞群中發現的一組調節分子的 成員。KIR分子參與了降低患有急性髓系白血病(AML)而接受了錯配KIR配體的造血性移 植的患者復發的風險。KIR配體不相容性定義為在受體中缺乏供體的I類等位基因，已知I 類等位基因為抑制性KIR的配體(3DL1、2DL2/3、2DL1和3DL2)。已知供體-對-受體NK細胞同種異體活性能夠消除白血病復發和移植排斥，并且還保護患者防止移植體-對-宿主 疾病。KIR cDNA的序列分析顯示大多數KIR基因含有可變的位點，而且一些是相當多態 的。等位基因多態性提供了額外的多樣性，其程度是兩種KIR單倍型都相同的不相關個體 不可能被觀察到。KIR序列的變化可以在編碼影響與I類HLA相互作用的殘基的位置處 發生。變化往往發生在整個基因，而不像在HLA I和II類基因中所觀察到的類型，該類型 中核苷酸變化主要限制在一個或兩個外顯子中。KIR分子參與了降低患有急性髓系白血病 (AML)而接受了錯配KIR配體的造血性移植的患者復發的風險。KIR配體不相容性定義為 在受體中缺乏供體的I類等位基因，已知I類等位基因為抑制性KIR的配體(3DLl、2DL2/3、 2DL1和3DL2)。所述數據表明供體-對-受體NK細胞同種異體活性能夠消除白血病復發 和移植排斥，并且還保護患者防止移植體-對-宿主疾病。KIR基因分型可以是基因座或等位基因特異性的。僅基因座分型檢測各基因在給 定個體中的存在或不存在，因此提供KIR整體特征(KIR特征)。KIR分型的序列特異性引 物PCR(PCR-SSP)方法已經更新至能解決新發現的基因座和先前未檢測的等位基因。還開 發了 PCR序列特異性寡核苷酸探針(PCR-SS0P)方法。實驗室的相互協作有助于鑒別KIR基 因座(100)的分子基因分型分析。迄今為止已經發現了 100余種不同的KIR基因型特征。已經描述了用于2DL1、2DL3、3DL1和3DL2(25，55)的中至高分辨率等位基因特異 性反應(PCR-SSP)；以及用于基因型2DL4的單鏈構象多態性(SSCP)分析。需要開發用于 2DL5的精密分析以分辨兩種高度同源的基因座2DL5A和2DL5B。基于PCR-SSP的反轉錄酶 PCR(RT-PCR)是選擇用于同種異型NK細胞克隆的方法，其在很大程度上仍未改變之前所述 的方法。為此目的可以使用多種單克隆抗體，但是特異性受KIR同種型之間的高度同源性 限制。血型目前，有很多血型鑒定體系。輸入的紅細胞上不熟悉的抗原的存在或供體血漿中 抗體的存在可能引起有害的免疫反應，這種免疫反應會襲擊供體血細胞，引起供體紅細胞 破裂。這還可能引起嚴重的癥狀，包括腎衰竭和休克。抗原還在其他血液組分上出現，包括 白細胞、血小板和血漿蛋白。目前血型分型體系鑒定的一個實例是AB0體系，其中血液根據紅細胞上下列抗原 的存在來分型A抗原(AA，AO)、B抗原(BB或BO)、A和B兩種抗原(AB)或A和B均無(0)。 紅細胞上的其他抗原包括MNS體系(抗原M、N、S和s)、P體系(抗原PI)、Lutheran體系 (Lu (a)和 Lu(b)、Kell 體系(K(Kell)和 k(塞拉諾因子(cellano))、和 Kpa 和 Kpb)、Lewis 體系(Le a 和 Le b)、Duffy 體系(Fy a 和 Fy b)和 Kidd(JK)體系(Jka 和 Jkb)。除了上述所列的那些，血液還使用RH(恒河猴(Rhesus))體系分型。三個基因組 成了恒河猴抗原1號染色體上發現的C、D和E。各基因座上有兩種可能的等位基因c或 C ;d或D ;e或E。一種由c/C、d/D、e/E構成的單體型分別遺傳自父母，所得的個體恒河猴 類型取決于它們繼承的基因型。給定單體型如下的編碼CDe稱為Rl、cDE稱為R2、CDE稱 為Rz、cDe稱為Ro、Cde稱為r，、cdE稱為R”、CdE稱為Ry并且cde稱為r。人中性粒細胞抗原據顯示人中性粒細胞特異性抗原(HNA)的抗體會在輸血后引起臨床并發癥，如肺部輸血反應和一些情況下輸血相關的急性肺損傷(TRALI)或引起新生兒同種免疫中性白 細胞減少(NAIN) (Bux等人.Transfus. Med. 2 (2) 143-9，1992)。因此，HNA特異性抗原或抗 體的檢測具有重要的臨床應用。 人中性粒細胞抗原還稱為中性粒細胞特異性抗原或HNA。目前有5中HNA抗原體 系ΗΝΑ-1、ΗΝΑ-2、ΗΝΑ-3、ΗΝΑ-4和HNA-5。已鑒別了 HNA_1、2、4和5的等位基因并鑒定了相 應的糖蛋白；然而，HNA-3的等位基因仍然未知(Stroncek的綜述，ASHI Quarterly 2004)。 有三種HNA-I抗原(HNA-la、HNA-Ib和ΗΝΑ-lc)僅在中性粒細胞上表達，并位于低親和力 Fc-Y受體IIIb上。HNA-2體系具有一種已充分確定的抗原(HNA_2a)。HNA-2僅在中性 粒細胞和中性粒細胞前體上表達，其位于糖蛋白⑶177 (NBl gp)上。HNA-3具有一個抗原 HNA-3a，也稱為5b。HNA-3在中性粒細胞、淋巴細胞、血小板、內皮細胞、腎、脾和胎盤細胞上 表達，已知它位于70至95kD中性粒細胞糖蛋白上。HNA-4和HNA-5位于β 2整聯蛋白上。 ΗΝΑ-4在粒細胞、單核細胞和淋巴細胞上表達。(參見Stroncek，ASHI Quarterly 2004)。T細胞警體主要組織相容性復合體(MHC)細胞表面糖蛋白呈遞的抗原肽由T細胞通過T細胞 受體(TCR)復合體識別，T細胞受體復合體是由T細胞受體和CD3鏈構成的多亞基跨膜表 面復合體。TCR直接結合肽/MHC復合體，并通過與⑶3和TCR的其他組分的相互作用激活 T細胞。因此，TCR參與了自我和外來組織識別，并分析組織的TCR表達，該表達可能有助于 組織分型移植供體和受體。試劑盒本發明還提供實施本發明方法的試劑盒。具體來說，本發明提供用于實施基于DNA 的組織分型方法的試劑盒，該試劑盒包括a)具有可鑒別特征的多組微粒，其中在各組中， 每個微粒具有相同的鑒別特征；和b)SS0探針，其中不同SSO探針固定在一組內的微粒上。本發明的其他方面和優點將通過參考下列示例性實施例來理解。實施例1常規方法與本發明方法的比較珠子、探針和樣品DNA制備使用LABTYPE SSO DRBl Locus (One Lambda Inc.，Canoga Park, CA)進行下述 DNA組織分型分析。LuminexXMAP微球(Austin，TX)具有兩種熒光染料包埋在其中。使用 具有不同濃度的各種包埋熒光染料的各種微球(或珠子)。用胺標記SSO探針，將其結合到珠子上。HLA DRBl外顯子2由使用生物素化引物 的PCR從分離自生物或組織樣品的DNA擴增。在5’端用生物素標記所得PCR產物(本文 稱為“樣品DNA”)。使樣品DNA接觸珠子，樣品DNA與固定于珠子上的SSO探針的雜交在用 結合有熒光染料藻紅蛋白(PE)的鏈霉親和素孵育后產生代表樣品DNA和SSO探針雜交的 熒光信號。用流式細胞術檢測并測量該熒光信號。(DNA可以來自任何來源，優選血液或頰 試子)。在樣品DNA內擴增的HLA基因和固定于微粒上的SSO探針之間的DNA雜交反應如 下進行。使用預優化的熱循環程序設定標準基因擴增反應物，該擴增反應物包含約Ing/ μ 1基因組DNA和10微摩爾相應的序列特異性生物素化引物。將5微升的含有擴增的DRBl 女0814的所得混合物變性、中和并與結合所需探針的微粒(1000個微粒/探針/測試)在1M NaCl和70mM磷酸鈉緩沖液中混合。將雜交反應物在60°C下孵育15分鐘。然后將2體 積的50nM NaCl溶液(在60°C預熱)添加到混合物中，離心試管5分鐘。在不打亂沉淀微 粒的情況下移除上清液。將此洗滌步驟重復多于兩次。然后通過添加3體積的5微克/微升的藻紅蛋白_鏈霉親和素結合物標記雜交的 DNA。將標記混合物在60°C下孵育5分鐘，如上所述洗滌。用50nMNaCl將洗滌的微粒重懸 至80微升體積。使用Luminex 100流式分析儀激發、檢測和記錄注入儀器的各個微粒在 580nm處的熒光信號來檢測雜交信號。每次測試分析約500個微粒用來分析計算各探針的 修剪均數熒光強度(MFI)。然后使用用于測試的各探針的所得MFI和來自適當陽性對照探 針的MFI來計算相對雜交信號。陽性對照探針是識別可以由特異性引物組擴增的所有等位基因的非多態性區域 的探針。用于本發明的靶核酸鏈包括已經使用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增的等位基因區 域。使用陽性對照探針來提供參考信號以便可以估計擴增DNA(擴增子)量的變化。使用陽 性對照信號來計算所有診斷探針的相對信號，診斷探針信號表示為陽性對照信號百分比。常規分析對于常規基于DNA的組織分型方法，如上所述將100種不同熒光標記的珠子各自 與不同的HLA特異性探針結合。使珠子接觸樣品DNA。使用Luminex 100流式分析儀測量 樣品DNA與任何珠子的雜交。使用Luminex 100流式分析儀軟件統計分析流式細胞術數據。所關注珠子(珠子 37)的熒光強度的修剪均值為1707。修剪均值是當去除某一百分比的高和低例外值時計算 的平均值。使用本發明方法的分析使用本發明的基于DNA的組織分型方法，將一些珠子37 (750種珠子)與表1中所 列的5種HLA特異性SS0探針中的一種結合。使珠子與樣品DNA接觸。使用Luminex 100 流式分析儀測量樣品DNA與任何珠子的雜交。由于測試了 5種探針，所以進一步分析20% 的陽性珠子。
表1 表1
珠子ID探針ID探針特異性37OLR4916DRBP081437DR245DRB1*011337DR250DRB1*121337DR260DRB1*0309, DRB丨1*032337DR228DRB 1*0703 使用Luminex 100流式分析儀軟件統計分析流式細胞術數據。這種分析包括測定 所分析珠子的大小、包埋在珠子中的各熒光染料的熒光強度、以及熒光強度是否在所需范 圍內的測定。分析各染料的熒光強度以測定RPI。RPI代表樣品DNA與珠子雜交所產生的 熒光強度。在此實施例中，RP1代表樣品DNA上標記的PE的真實熒光強度。這個值表示樣品DNA已與結合到珠子37的SS0探針雜交。對于珠子37，574個事件的RPI小于216，它們被認為是陰性，即樣品DNA不與SS0探針雜交。此外，有151個陽性事件(R0I> 5650)，陽性事件表示樣品DNA與SS0探針雜 交。陽性與陰性事件的比率為151 574，其約為1 4。因此五分之一的探針對于樣品 DNA是陽性的。陽性珠子的平均RPI為8152。這個值是較強的信號并且是大于用常規方法 計算的平均RPI (1707)的真實值的增強信號。已知此實驗中所用的DNA樣品僅對于DRB1 ± 0814 (與探針0LR4916雜交，參見表 1)為陽性的。僅20%的陽性事件的分析表明珠子37是陽性的，所檢測的平均信號(8152) 強度與通過實施常規方法產生的強度類似(1個珠子/I種探針)。此實驗證明了本發明方 法的選擇步驟增強了陽性信號。此外，此實施例證明了可以使用相同或較少數目的珠子篩 選較多的靶標，并且所產生的信號與使用常規方法產生的信號類似。實施例2常規方法與本發明方法的另外比較用于HLA等位基因抗原的基于DNA的組織分型的常規方法與本發明改良方法的另 外比較如實施例1所述進行。這些方法中所用的樣品DNA含有擴增的HLA抗原等位基因 DRB1 * 0416。使用實施例1中所述的Luminex 100流式分析儀檢測雜交信號。使用用于測試的 各探針的所得MFI和來自適當陽性對照探針的MFI來計算相對雜交信號。同樣使用識別可 以由特異性引物組擴增的所有等位基因上的非多態性區域的陽性對照探針。常規方法對于常規基于DNA的組織分型方法，如上所述將100個不同熒光標記的珠子各自 與不同的HLA特異性SS0探針結合。使珠子與樣品DNA接觸。使用Luminex 100流式分析 儀測量樣品DNA與任一珠子的雜交。使用Luminex 100流式分析儀軟件統計分析流式細胞術數據。所關注珠子(珠子 73)的熒光強度的修剪均值為400。使用本發明方法的分析使用本發明的基于DNA的組織分型方法，使一些珠子73 (838個珠子)與表2中所 列的5種HLA特異性SS0探針中的一種結合。使珠子與樣品DNA接觸。使用Luminex 100 流式分析儀測量樣品DNA與任一珠子的雜交。由于測試了 5種探針，所以進一步分析20% 的陽性珠子。表2表2珠子
ID探針ID探針特異性
73DR148DRB1*0416
73DR263DRB1A1522
DRB1A1133, DRB1*1135
73DR252DRB1A1205, DRB1*1215,
73DR278DRB1M364，DRB1M441
73DR275DRB1*1351如實施例1所述使用Luminex 100流式分析儀軟件統計分析流式細胞術數據。對于珠子73，672個事件的RPI小于48(平均值=16)，它們被認為是陰性，即樣品DNA不與 SSO探針雜交。此外，有166個陽性事件(R0I > 1457)，陽性事件表示樣品DNA與SSO探針 雜交。陽性與陰性事件的比率為166 672，其約為1 4。因此五分之一的探針對于樣品 DNA是陽性的。陽性珠子的平均RPI為2510。這個值是較強的信號并且是用常規方法計算 的平均RPI的更真實值(400)。已知此實驗中所用的DNA樣品僅對于DRBl * 0416 (與探針DR148雜交，參見表2) 為陽性的。僅20%的陽性事件的分析表明珠子73是陽性的，所檢測的平均信號(2510)強 度與通過實施常規方法產生的強度類似(對于常規方法平均值為400)。此實驗證實了實施 例1中所述的分析。本領域的那些技術人員參考本發明所列的優選實施方式可以預期本發明實施中 的多種修改和變化。因此，對本發明范圍的僅有的限制是所附權利要求中所出現的那些。
權利要求
一種用于篩選結合相互作用的方法，所述方法包括下列步驟制備多組獨特可鑒別微粒，其中在一組中的所述微粒具有相同的獨特可鑒別特征，并且其中一個或多個組包括微粒亞組，所述亞組呈現至少一種用作生物樣品中靶分子的結合對象的獨特探針；在生物樣品中的靶分子與探針結合的條件下使所述多組微粒與生物樣品接觸；通過產生代表靶分子與探針之間結合相互作用的信號檢測生物樣品中的靶分子與所述微粒上的探針的結合；檢測代表所述微粒的結合相互作用的信號；測定所述獨特可鑒別微粒組代表結合相互作用的信號是否大于所選的閾值，所述閾值代表在所述生物樣品中存在一種或多種靶分子；以及測定代表結合相互作用的獨特可鑒別微粒組的數目。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述探針是序列特異性寡核苷酸(SS0)探針或引物。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述生物樣品為樣品DNA，所述結合相互作用是樣 品DNA與SS0探針的雜交。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述樣品DNA自頰試子或血液獲得。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述探針為肽或蛋白抗原。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述與探針結合的在生物樣品中的靶分子為抗體。
7.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述探針是選自下列的組織分型抗 原HLA抗原、HNA抗原、血型抗原、TCR抗原和KIL抗原。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中在獨特可鑒別微粒組的至少一組中 的至少兩個微粒亞組以非約11的固定數值比率存在。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，還包括下列步驟選擇小于100%的顯示 最大信號的微粒比例，所述信號代表一組或多組獨特可鑒別微粒的結合相互作用；以及測定所述獨特可鑒別微粒組所選比例的代表結合相互作用的信號是否大于所選閾值， 該閾值代表在所述生物樣品中存在一種或多種靶分子。
10.根據權利要求9所述的方法，其中在至少一組獨特可鑒別微粒中的至少兩個微粒 亞組以非約11的固定數值比率存在。
11.根據權利要求9所述的方法，其中微粒組的所選比例小于50%。
12.根據權利要求9所述的方法，其中微粒組的所選比例小于30%。
13.根據權利要求9所述的方法，其中微粒組的所選比例小于20%。
14.根據權利要求9所述的方法，其中微粒組的所選比例小于10%。
15.根據權利要求9所述的方法，其中微粒組的所選比例小于或等于呈現所述微粒組 的獨特探針的微粒亞組數目的倒數。
16.一種基于DNA的組織分型方法，包括下列步驟制備多組獨特可鑒別微粒，其中在一組中的所述微粒具有相同的獨特可鑒別特征，并 且其中一個或多個組包括微粒亞組，所述亞組呈現至少一種經選擇與組織分型抗原等位基 因雜交的獨特的序列特異性寡核苷酸(SS0)；在雜交條件下使所述多組微粒與樣品DNA接觸；通過產生代表樣品DNA與SSO雜交的信號檢測樣品DNA與所述微粒上的SSO的雜交；測量代表樣品DNA與所述微粒的SSO雜交的信號；測定所述獨特可鑒別微粒組代表樣品DNA/SS0雜交的信號是否大于所選的閾值，所述 閾值代表在所述樣品中存在一種或多種組織分型抗原等位基因；以及測定代表DNA/SS0雜交的獨特可鑒別微粒組的數目。
17.根據權利要求16所述的方法，其中在獨特可鑒別微粒組的至少一組中的至少兩個 微粒亞組以非約11的固定數值比率存在。
18.根據權利要求Bl或B2所述的方法，還包括下列步驟選擇小于100%的顯示最大 信號的微粒比例，所述信號代表至少一組獨特可鑒別微粒的DNA/SS0雜交；以及測定所述獨特可鑒別微粒組所選比例的代表DNA/SS0雜交的信號是否大于所選閾值， 該閾值代表在所述生物樣品中存在一種或多種組織分型抗原。
19.根據權利要求18所述的方法，其中在至少一組獨特可鑒別微粒中的至少兩個微粒 亞組以非約1 1的固定數值比率存在，并且其中所述比率將決定所述微粒組的所選比例。
20.根據權利要求18所述的方法，其中微粒組的所選比例小于50%。
21.根據權利要求18所述的方法，其中微粒組的所選比例小于30%。
22.根據權利要求18所述的方法，其中微粒組的所選比例小于20%。
23.根據權利要求18所述的方法，其中微粒組的所選比例小于10%。
24.根據權利要求18所述的方法，其中微粒組的所選比例小于或等于呈現所述微粒組 的獨特SSO的微粒亞組數目的倒數。
25.根據權利要求16至24中任一項所述的方法，其中所述組織分型抗原選自HLA抗 原、HNA抗原、血型抗原、KIL抗原和TCR抗原。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述組織分型抗原為HLA抗原。
27. 一種基于DNA的組織分型方法，包括下列步驟制備多組獨特可鑒別微粒，其中在一組內的所述微粒具有相同的獨特可鑒別特征，并 且其中一個或多個組包括微粒亞組，所述亞組呈現至少一種經選擇與組織分型抗原等位基 因雜交的獨特的序列特異性寡核苷酸(SSO)；在雜交條件下使所述多組微粒與樣品DNA接觸；通過產生代表樣品DNA與SSO雜交的信號來檢測樣品DNA與在所述微粒上的SSO的雜、-父；測量代表樣品DNA與所述微粒的SSO雜交的信號；選擇小于100%的顯示最大信號的微粒比例，所述信號代表所述獨特可鑒別微粒組的 樣品DNA/SS0雜交；測定所述獨特可鑒別探針組所選比例的代表樣品DNA/SS0雜交的信號是否大于所選 閾值，該閾值代表在所述樣品中存在一種或多種組織分型抗原等位基因；以及測定顯示DNA/SS0雜交的獨特可鑒別微粒組的數目。
28.根據權利要求27所述的方法，其中在獨特可鑒別微粒組的至少一組中的至少兩個 微粒亞組以非約1 1的固定數值比率存在，并且其中所述比率將決定所述微粒組的所選 比例。
29.根據權利要求26或27所述的方法，其中所述微粒組的所選比例小于50%。
30.根據權利要求29的方法，其中所述微粒組的所選比例小于30%。
31.根據權利要求29所述的方法，其中所述微粒組的所選比例小于20%。
32.根據權利要求29所述的方法，其中所述微粒組的所選比例小于10%。
33.根據權利要求27至32中任一項所述的方法，其中微粒組的所選比例小于或等于呈 現所述微粒組的獨特SSO的微粒亞組數目的倒數。
34.根據權利要求27至32中任一項所述的方法，其中所述組織分型抗原選自HLA抗 原、HNA抗原、血型抗原、KIL抗原和TCR抗原。
35.一種基于DNA的組織分型方法，包括下列步驟使呈現獨特的序列特異性寡核苷酸(SSO)的大量不同微粒組與樣品DNA接觸以鑒別由 樣品DNA編碼的組織分型抗原等位基因，其中獨特地鑒別所述微粒組，并且測定存在于所 述可鑒別微粒組的SSO是否與樣品DNA內的等位基因雜交；改進包括制備多組具有相同的獨特可鑒別特征的獨特可鑒別微粒，其中所述組包括 微粒亞組，所述亞組呈現至少一種經選擇與HLA等位基因雜交的獨特的序列特異性寡核苷 酸(SSO)；在雜交條件下使所述多組微粒與樣品DNA接觸；通過產生代表樣品DNA與SSO雜交的信號來檢測樣品DNA與在所述微粒上的SSO的雜交。測量代表樣品DNA與所述微粒的SSO雜交的信號；測定所述獨特可鑒別微粒組代表樣品DNA/SS0雜交的信號是否大于所選閾值，該閾值 代表在所述樣品中存在一種或多種HLA等位基因；以及 測定顯示DNA/SS0雜交的獨特可鑒別微粒組的數目。
36.根據權利要求35所述的方法，還包括報告陽性雜交信號的步驟。
37.根據權利要求35或36所述的方法，還包括為所述可鑒別探針組選擇具有最強信號 的微粒比例的步驟。
38.根據權利要求35或36中任意一項所述的方法，其中微粒組的所選比例小于50%。
39.根據權利要求38所述的方法，其中微粒組的所選比例小于30%。
40.根據權利要求38所述的方法，其中微粒組的所選比例小于20%。
41.根據權利要求38所述的方法，其中微粒組的所選比例小于10%。
42.根據權利要求35至40中任意一項所述的方法，其中微粒組的所選比例小于或等于 呈現所述微粒組的獨特SSO的微粒亞組數目的倒數。
43.一種用于實施測量結合相互作用的方法的試劑盒，包括具有相同獨特可鑒別特征的多組獨特可鑒別微粒，其中所述組包括微粒亞組，所述亞 組呈現至少一種獨特探針，該探針與生物樣品內的靶分子結合。
44.根據權利要求43所述的試劑盒，其中所述靶分子選自HLA抗原、HLA等位基因、 HNA抗原、HNA等位基因血型抗原、TCR或KIL。
45.根據權利要求43或44所述的試劑盒，其中所述探針是序列特異性寡核苷酸或引物。
46.根據權利要求43或44所述的試劑盒，其中所述探針為肽或蛋白抗原。
47.一種用于實施基于DNA的組織分型方法的試劑盒，包括具有相同獨特可鑒別特征的多組獨特可鑒別微粒，其中所述組包括微粒亞組，所述 亞組呈現至少一種經選擇與組織分型抗原等位基因雜交的獨特的序列特異性寡核苷酸 (SSO)。
48.根據權利要求47所述的試劑盒，其中所述組織分型抗原選自HLA、HNA、血型抗原、 TCR 或 KIL。
全文摘要
本發明涉及使用多組微粒篩選結合相互作用的方法，其中所述組具有相同的可鑒別特征，并且其中多組中的一組包括微粒亞組，所述亞組呈現至少一種作為生物樣品中靶分子結合對象的獨特探針。具體來說，本發明提供使用這些多組微粒在供體組織或受體組織中檢測組織分型抗原的方法。
文檔編號G01N33/53GK101802217SQ200880022471
公開日2010年8月11日 申請日期2008年5月1日 優先權日2007年5月3日
發明者J·-H·李, T·農, T·陳 申請人:一蘭姆達公司