專利名稱：用于表征有色生物組織的方法和系統的制作方法
用于表征有色生物組織的方法和系統 本發明涉及用于表征含色素的生物組織的方法。本方面還涉及執行該方法的系統。 更具體地，本發明涉及用于表征生物實體(例如漿果)的組織的方法和系統，所述 的生物實體包括僅具有輕微的熒光性或不具有熒光性的第一發色化合物(例如，花色素苷 或黃銅醇)和第二熒光發色化合物(例如，葉綠素)。該表征的目的在于確定生物組織中第 一化合物的含量。對生物組織的這種表征是非常重要的。例如在制酒領域，葡萄中花色素 苷的含量代表了與其成熟度和從葡萄釀造的酒的質量相關的信息。在營養領域，水果和蔬 菜的表皮中黃銅醇的含量是其營養價值的指標。 文獻FR 2 830 325公開了一種光學儀器，其能夠通過屏蔽效應測量包括第一非
熒光的發色化合物和第二熒光發色化合物的生物組織樣本的光吸收特性。該文獻中公開的
方法包括對通過用具有不同波長的第一和第二輻射照射生物組織樣本激勵第二化合物而
產生的熒光進行測量。所謂的參考輻射被第一化合物稍微吸收或完全不吸收，而所謂的測
量輻射則被相對較好地吸收。通過測量由兩個輻射產生的熒光并得到測得的熒光的比率，
該方法可測量樣本的光吸收特性，并從而可測量生物組織中第一化合物的含量。 然而，第一非熒光的發色化合物的發展(development)會使對由第一輻射產生的
熒光輻射的測量達到飽和。當組織中第一化合物的濃度增大時，第一化合物對測量輻射的
吸收也增大。測量輻射產生的熒光輻射越來越弱，并且不再能與測量噪聲區分開來。當組
織中第一化合物的濃度增大時，還可能會對參考輻射產生影響。在本發明中，將這些效果稱
為"飽和"。 當前已知的大多數方法和系統都僅限于在達到飽和之前表征生物組織。這些系統 包括基于比色法的系統，不僅存在飽和的問題，這些系統還遇到了與沉積相關的問題，沉積 可出現在生物組織上并可影響測量。還可能記載了基于紅外光譜學的系統，這些系統遇到 了與生物組織中水的存在相關的問題，并基于經驗的化學計量推導確定在第一化合物中的 用于表征生物組織的其它方法和系統通過實驗室中的稀釋操作來避免飽和。這些 方法和系統的缺陷在于其破壞性。 本發明的目的在于提出一種新穎的方法和系統，允許以非破壞性且非侵入性的方 式超飽和地表征生物組織。 本發明的另一 目的在于提出一種新的方法和系統，允許原地對生物組織進行超飽 和表征。 因此，本發明提出了用于確定生物實體的組織中稱為第一化合物的非熒光的發色 化合物的含量的方法，所述生物組織還包括稱為第二化合物的熒光發色化合物，所述方法 包括以下操作的至少一次迭代-由發射裝置向所述組織的方向發射稱為測量光學輻射的第一輻射和稱為參考光
學輻射的第二輻射，所述第一輻射和第二輻射中的每個都選擇為產生所述第二化合物的熒 光輻射，所述第一輻射和第二輻射中的每個都被所述第一化合物部分吸收；
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_由測量裝置測量所述第一輻射和第二輻射引發的所述熒光輻射；以及
-根據所述第一測量確定所述組織中所述第一化合物的含量。 根據本發明的方法的特征在于，還包括對測量飽和的至少一次補償，所述測量飽 和是由于所述第一化合物對所述測量輻射的太高吸收而產生的，所述補償包括為所述測 量輻射選擇對應于所述第一化合物的吸收光譜中的較低吸收的波長。 因而，通過將測量輻射的波長朝向第一化合物的吸收光譜中較低吸收的波長移 動，根據本發明的方法可在由第一化合物的含量過高(即，第一化合物對測量輻射的吸收 過高)而導致超飽和時執行對生物實體的生物組織的表征。此外，由于無需在實驗室內操 作，根據本發明的方法是非破壞性且非侵入性的，并可原地執行。 有利地，根據本發明的方法還包括由發射裝置向所述生物組織的方向發射稱為補 充光學輻射的第三光學輻射，所述第三光學輻射被選擇為引發所述第二化合物的熒光輻 射。在這種情況下，根據本發明的方法包括測量由所述補充輻射引發的所述熒光輻射。該 測量用于確定所述參考輻射是否受到所述第一化合物的影響。事實上，根據參考輻射和補 充輻射這兩個輻射所引發的熒光輻射的比率以及該比率的變化，可確定參考輻射是否受到 了第一化合物的影響。當探測到參考輻射被第一化合物影響時，必須執行飽和補償，例如通 過將測量比率反轉。 根據本發明的第一方面，當組織中第一化合物的含量增大從而使第一化合物影響 參考輻射時，在飽和后為所述測量輻射選擇的波長對應于飽和前所述參考輻射的波長附近 的波長。根據本發明的第一方面，當出現飽和時，為所述參考輻射選擇新的波長。為測量輻 射選擇的所述新的波長可為飽和前參考輻射的波長。當所述生物組織和所述發射裝置及所 述測量裝置之間的距離固定時，不必使用參考輻射。然而，即使在飽和時，第一測量也能用 在測量比率中。 當所述生物組織和所述發射裝置及所述測量裝置之間的距離不固定時，在飽和后 為所述參考輻射選擇的所述新的波長可對應于僅略微受到或者根本不受第一化合物的含 量影響的波長。更特別地，飽和后參考輻射的波長可對應于補充輻射的波長。
根據本發明的第二方面，當參考波長未受組織中第一化合物的含量的影響時，為 所述測量輻射選擇的波長比限制波長對應于對所述第一化合物的更小吸收，對于所述限制 波長，在所述生物組織中所述第一化合物的期望最大含量的情況下將產生潛在的飽和。在 測量系列中，可確定第一化合物的潛在最大含量。根據該潛在最大值和第一化合物的吸收 光譜，可計算出可能獲得的最大吸收。確定測量輻射的限制波長，其對應于最大吸收的飽 和。因而，如果為測量輻射選擇的波長比限制波長對應于更小的吸收，在測量系列中則不會 產生測量輻射的飽和。限制波長可根據飽和峰值確定。在這種情況下，相對于飽和峰值選 擇測量波長。這樣，根據本發明的方法可包括確定相對于飽和峰值的偏移以避免飽和或獲 得以更線性的方式發展的第一化合物的含量值。 根據本發明的第三方面，當參考波長不受組織中第一化合物的含量的影響時，可 在組織中的第一化合物引起測量飽和時執行飽和補償，該補償在每次飽和時重復執行。在 用具有例如對應于飽和峰值的第一波長的測量輻射執行了測量系列之后，當達到第一次飽 和時，可將測量輻射的波長朝向比第一波長對應于更低吸收的第二波長移動，以使第二波 長不產生測量飽和。然后可進行第二測量系列，直到達到新的飽和。然后，可將測量輻射的波長朝向比第二波長對應于更低吸收的第三波長移動，以此類推。在選擇了新的波長后，可 考慮吸收差來計算組織中第一化合物的含量。該吸收差可通過研究第一化合物的吸收光譜 而獲得，該吸收光譜提供用于所選的不同波長的校準值。
有利地，可將上述本發明的三個方面相結合。 有利地，根據本發明的方法可包括根據對所述第一化合物的吸收光譜和/或對所 述第二化合物的熒光光譜具有影響的物理化學特征，修改所述測量輻射和/或所述參考輻 射的波長。 這些物理化學特征是選自以下列表的特征
-所述生物組織的pH值；-所述生物組織中影響所述第一化合物的輔色效應；以及-所述生物組織中所述第二化合物的支持結構中的至少一個變化的效應。 還可根據生物組織中新化合物的出現(例如通過共價變化)修改測量輻射和/或
參考輻射的波長，修改第一化合物的吸收光譜或第二化合物的熒光光譜。 有利地，測量輻射(或參考輻射)可以預定強度發出，而參考輻射(或測量輻射)
則以可變強度發出，以使所述參考輻射和所述測量輻射中的每個引發的熒光輻射具有相等
的強度。 可根據控制信號調整所述第一輻射的強度，所述控制信號與由所述測量輻射和所 述參考輻射引發的熒光輻射相關。 此外，可通過相移以預定頻率(例如可為lkHz)交替改變所述測量輻射和所述參 考輻射的強度。 有利地，根據本發明的方法可包括通過相位調制將發射裝置發射的輻射同步。
每個測量輻射都可以脈沖形式發出。 確定所述第一化合物的含量可包括計算(由所述參考輻射引發的熒光)除以(由 所述測量輻射引發的熒光)得到的比率。 根據本發明的方法的有利特征，對所述熒光輻射的測量
_在采自生物實體的組織樣本上執行；-或以非破壞性且非侵入性的方式，S卩，不采取樣本，直接在所述生物實體上執行。
根據本發明的方法可有利地包括確定所述生物組織中所述第一化合物的含量隨 時間的發展。該發展可根據時間單元(可為天)確定。例如，可表示為顯示化合物含量隨 所選時間單元的發展的圖示。 在根據本發明的方法的第一方面的非限制性實施方式中，所述生物組織是葡萄果 皮；所述第一化合物是花色素苷；所述第二化合物是葉綠素。當組織和發射裝置及測量裝 置之間的距離固定時-飽和前所述測量輻射的波長為530nm ;
-飽和前所述參考輻射的波長為650nm ;
-所述補充輻射的波長為450nm ;
-飽和后所述測量輻射的波長為650nm ;
-飽和后無需參考輻射。 仍然在此實施例的情況下，當組織和發射裝置及測量裝置之間的距離不固定時
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-飽和前所述測量輻射的波長為530nm ;
-飽和前所述參考輻射的波長為650nm ;
-所述補充輻射的波長為450nm ;
-飽和后所述測量輻射的波長為650nm ;
-飽和后參考輻射的波長為450nm。 在這種情況下，葡萄果皮中花色素苷的含量可根據以下關系確定
ANTH船n前二 logFER_ANTH_GREEN-logFER_CHLG
ANTH船脂二 C+logFER_ANTH_RED-logFER_CHLK
其中， 1. logFER_ANTH_GREEN = log (FRF紅/FRF綠)
2. logFER_ANTH_RED = log (FRF藍/FRF紅)
3. logFER_CHLG = log (FRF紅/FRF綠)
4. logFER_CHLK = log (FRF藍/FRF紅)
在這些表達式中， 參FRF紅對應于由以650nm發射的輻射(即，飽和前的參考輻射和飽和后的測量輻 射)引發的葉綠素的熒光輻射； 參FRF綠對應于由以530nm發射的輻射(g卩，飽和前的測量輻射)引發的葉綠素的 熒光輻射； 參FRF^g對應于由以450nm發射的輻射(即，飽和前的補充輻射和飽和后的參考輻 射)引發的葉綠素的熒光輻射； 參表達式3和式4對應于在葡萄果皮中出現花色素苷之前執行的至少一次測量。
用作在出現花色素苷之后執行的測量的參考；以及 參C是使飽和時刻的ANTH飽和后等于ANTH船。前的常量。 在根據本發明第三方面的另一非限制性實施例中，所述生物組織是葡萄果皮；所
述第一化合物是黃酮醇；所述第二化合物是葉綠素-飽和前所述測量輻射的波長約為375nm ;-飽和前所述參考輻射的波長約為650nm ;-飽和后所述測量輻射的波長約為450nm ;以及-飽和后參考輻射的波長保持約為650nm。 根據本發明的另一方面，提出了實現根據本發明的方法的系統。 根據以下附圖和對非限制性實施方式的詳細描述，本發明的其它特征和有益效果
將顯而易見。
圖1是根據本發明的系統的第一實施方式的圖示；
圖2是根據本發明的系統的第二實施方式的圖示；
圖3是根據本發明的第一實施方式中的測量原理的圖示；
圖4是根據本發明的第二實施方式中的測量原理的圖示；
圖5、6和7是根據本發明第二實施方式的系統的圖示； 圖8是根據本發明的方法的第一方面的葉綠素熒光光譜、花色素苷吸收光譜、黃 銅醇吸收光譜、以及使用的不同輻射和濾波器的表示；
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圖9是根據本發明的方法的第一方面、在測量葡萄果皮中的花色素苷含量時獲得 的結果的表示； 圖10是根據本發明的方法的第二方面的葉綠素熒光光譜、花色素苷吸收光譜、以 及使用的不同輻射和濾波器的表示； 圖11是根據本發明的方法的第二方面、在測量葡萄果皮中的花色素苷含量時獲 得的結果的表示； 圖12是根據本發明的方法的第一和第二方面的結合、在測量葡萄果皮中的花色 素苷含量時獲得的結果的表示； 圖13是花色素苷的吸收光譜的變體以及pH的函數的實例表示。 以下將描述的非限制性的實施方式涉及用于測量生物實體的組織中屬于多酚族
的第一非熒光的發色化合物的含量的系統，該生物實體的組織還包括為葉綠素的熒光發色
化合物。對多酚的測量通過文獻FR2 830 325中描述的葉綠素熒光法實現。 圖1和圖2是根據本發明的系統的兩個實施方式的圖示。在這兩個實施方式中，
系統表現為兩部分的形式發射部10和接收部20。在圖1所示的第一實施方式中，發射部
10和接收部20分別設置在植物組織樣本30的兩側，而在圖2所示的第二實施方式中，發射
部10和接收部20設置在生物組織樣本30的同一側。 在任一實施方式中，發射部10包括照射生物樣本30的前表面的三個輻射源11、 12和13。如圖l和圖2所示，源11至13中的每個與脈沖電源14至16中的一個相關聯， 并由同步信號Ss控制。源11至13用于引發葉綠素的熒光。發射部lO還可包括位于源ll 至13與樣本30之間的光學濾波器(未示出)，以將朝向樣本30發射的輻射11至13中的 不期望成分過濾。 根據本發明的系統的接收部20包括與光學濾波器F2相關聯的探測器21，即根據 探測到的熒光輻射提供電信號的硅光電二極管，光學濾波器F2位于樣本30與探測器21之 間。濾波器F2的功能是-阻止來自激勵源11至13的輻射通過探測器21 ;-部分地或完全地傳送由源11至13發射的光學輻射引發的葉綠素熒光發射。
根據本發明的系統的接收部20還包括部件22，其包括控制及計算裝置，一方面可 通過同步信號Ss執行電源14至14的同步，并可根據探測器21提供的測量信號Sm的函數 確定組織樣本30中第一化合物的含量。 圖3和圖4分別是第一和第二實施方式中不同輻射的測量原理和光路的圖示。參 照圖3和圖4，源11至13優選地為發光二極管(LED)并照射樣本30的同一面31。源11 至13分別發射三個輻射111U21和131，旨在引發葉綠素33的熒光并分別引發三個熒光輻 射H2、122和132。在第一實施方式中，系統的接收部20相對于發射部IO位于葉或漿果 的相反側，由葉綠素發射的熒光輻射朝向與源11至13相反的一側并由探測器21探測。事 實上，在第一實施方式中，探測器21用來探測朝向樣本的后表面35發射的熒光以測量多酚 34的含量。 圖4示出了由輻射Hl、121和131引發并由葉綠素朝向源11、12和13發射的熒 光輻射H2、122和132。在第二實施方式中，系統的接收部20和發射部IO位于葉或漿果的 相同側，由葉綠素發射的熒光輻射朝向源11至13并由探測器21探測。事實上，在第二實施方式中，探測器21用來探測朝向葉的前表面31發射的熒光以測量多酚34的含量。
無論在哪個實施方式中，源11至13中的每個的波長都根據待測量化合物的吸收 帶、其技術特征(例如光譜純度和功率)、其商用性和成本、以及與探測器21相關的濾波器 F2的商用性和成本而選擇。 當熒光為各向同性時，第一和第二實施方式基本等同。第二實施方式是優選實施 方式，并可原地和遠離待表征的生物組織使用根據本發明的系統。此外，在第二實施方式 中，根據本發明的系統能以非破壞性且非侵入性的方式直接用于生物實體，即，無需采取生 物組織的樣本。 圖5至7示出了根據本發明的系統的第二實施方式制造的裝置50的不同視圖，第 二實施方式是根據本發明的系統的優選實施方式。圖5示出了裝置50的前視截面圖，圖6 示出了其等距視圖，圖7示出了從側面觀察的另一截面圖。裝置50允許在包括多個漿果70 的葡萄串60上直接測量。 將稱為MULTIPLEX⑧的實施方式基于由電池5121供電的便攜盒510，電池 5121可遠離手柄或集成在手柄中，盒510具有測量表面514和用戶界面，用戶界面包括屏幕 5152以及例如按鈕或按鍵5101和5102的控制元件。該盒可由形成手柄512的部件支持， 手柄512包括可更換電池5121或遠程便攜電池的連接器。 盒510還包括圓柱形部件513，其朝向與界面相反的側延伸并在其端部承載測量 表面。測量表面514由防護件5130圍繞，防護件5130或多或少為不透明的并可能是可拆 卸的，從而可減少來自環境光的干擾，并在光學測量距離方面提供相對于測量表面514的 參考點。 測量表面514包括覆蓋了待測量的熒光波長的一組探測器540。在本文描述的實 施方式中，探測器組540包括三個探測器541、542和543，三個探測器541、542和543相互 相鄰且共同聚集在測量表面514中心處的等邊三角形中。這三個探測器定向為關于探測軸 線5140相互平行，或關于探測軸線5140輕微收斂。探測器541、542和543中的每一個均 包括探測元件(這里是大約2cmX2cm的硅光電二極管5420)并分別探測確定的藍綠、紅光 和遠紅波常帶內的光。探測帶寬通過濾色器或高通濾波器以及干涉濾波器而獲得。這兩類 濾波器的組合允許了更好的過濾，這尤其是防止探測器接收激勵源發射的輻射所需要的。
應該注意到，探測器直接接收待測量的熒光，而不使用用于會聚、收斂或準直的光 學器件。每個探測器都僅需要單一的探測元件，光電二極管5420(圖7)，其選擇為足夠大以 便獲得良好的靈敏度，從而可省去會聚光學器件。這樣，探測元件可接收從激勵發射器照射 的全部目標區域591發出的輻射549。 這種配置使得可用相對較小的探測元件，并且無需會聚光學器件。除了節省光學 器件的成本之外，還避免了尺寸需求、調整和景深約束。 測量表面514具有支撐幾組發射器的凹圓錐外圍表面，幾組發射器可發射不同波 長的激勵光并分布在探測器組540周圍的圓上。 這些發射器包括紫外發射器組520，其包括六個UV發射器521至526，在繞探測器 組540的圓上分布為兩個相鄰的發射器為一組、每組間隔120°的三組發射器。
這些源中的每個均包括位于拋物線反射體5281中的源(這里是紫外LED 527)， 形成大約3(T的光束。反射體安裝在基座5282上，基座5282確定其光束相對于探測軸線
105140的位置。可選地，UV發射器還可使用折射器件和反射折射器件來改進發射束的會聚。
發射器還包括可見光發射器組530，包括三個發射器531、532和533，其繞探測器 組540在與UV發射器組520相同的圓上分布為間隔120°并插入在UV發射器之間。每個 可見光發射器都包括這樣的源，其包括紅色LED、綠色LED和藍色LED間隔設置的陣列，集成 在側邊測量近似為4. 5cm且功率為3 X 15W的公共組件534中，并由形成會聚微透鏡陣列的 透明塑料板覆蓋。該公共組件534安裝在形成輻射體的塊536上，其形狀確定源相對于探 測軸線5140的朝向。發射器還包括寬通帶的帶通濾色器，從而可限制用于熒光探測的波長 內的發射，尤其是朝向遠紅的發射。 作為本文描述的RGB (紅-綠-藍)源的一種替代，可使用單色激勵源，例如，連續 發射200W等級的功率的大功率單色LED陣列形式的琥珀色源。 激勵發射器定向為即使在異質對象和/或三維的情況下也能對目標區域591實現 均勻照射。 在例如使用UV激勵的短距離應用的實施方式中，發射器的射束定向為朝向探測 器541、542和543的軸線A541、A542和A543會聚。更具體地，激勵射束的軸線A541、A542 和A543相互交叉并與探測軸線5140會聚于最佳測量距離處的同一點P5140。在所述的實 施方式中，會聚點P5140與探測器組540相距10到20cm，例如大約15cm。
發射的光束不會聚且顯示一定的打開或發散可限制影響測量距離的約束。事實 上，當目標(這里是葡萄串60)位于發射器的射束529和539內時，其朝向探測器組540的 不同表面被均勻照射。這樣，朝向探測器發射的熒光549則足夠穩定和均勻以提供對測量 區域591的真實測量。 這樣，盡管在大約15cm處用UV發射器進行測量，但可在更大距離處(甚至高達大 約lm處)執行僅使用可見光發射器的測量，例如用于測量花色素苷。 在其它實施方式中，發射器的射束可定向為平行于探測軸線，例如用于大距離測 量的應用。 圖7更具體地示出了本發明的這一實施方式中的裝置的結構。盒的圓柱形部件 513包含基本為環形的電子卡5131，其包括激勵源的供電電路、激勵源的管理電路和產生 電流發生器的電路。 探測器以及附隨的電子器件共同聚合在圓筒形探測模塊5400中，置于測量表面 514上由激勵發射器形成的圓的中心處，并向待分析的目標的方向延伸。該圓筒的外表面載 有三個探測器541 、542和543。 這種配置使得可將探測器放置在與發射器的端部基本相同的水平面上，以使其具 有寬的接收范圍并從而可與目標接近。 探測模塊5400包括基本類似的三個小電子卡5141、5142和5143，這三個小電子卡 基本為圓形且沿其縱向軸線堆疊，并由小柱體5144固定和隔開。 第一小電子卡5141位于探測模塊5400的外表面側，承載探測元件(這里是硅光 電二極管)。對于每個探測器，硅光電二極管5420接收穿過濾色器或高通濾波器5421和 干涉濾波器5422的待探測的光，上述濾波器由保持螺母可拆卸地固定，該保持螺母位于 25. 4mm圓柱形開口中并從而可容納標準的1英寸或25毫米濾波器。 從測量表面514移開的第二小電子卡5142攜帶電路和放大器通過負反饋環路消除環境光。 第三小電子卡5143攜帶尤其包含在跟蹤保持單元中的電路和組件。 探測模塊5400構成緊湊的裝配件，其可從盒510移除，例如用于維護，或由相機模
塊或包括一個或多個光學波導的模塊替代。 該探測模塊通過大電子卡5131中的開口連接于處理模塊5151，處理模塊5151位
于界面側并包括處理裝置的全部或一部分，尤其是采集單元和計算裝置。 處理模塊包括在盒上攜帶屏幕5152的部件515中，該部件可傾斜以便于閱讀，并
可縮回到盒510中的隔室5105內。該處理模塊可包括可拆卸的連接件，以允許其容易地更
換，例如用于更新或改變功能。 這樣，連接于激勵的電子器件5131、連接于探測器的電子器件5141至5143、和處 理模塊5151設置在不同的分開的電子模塊中，允許簡化的維護。這些模塊還間隔一定距 離，在這里是2cm和例如至少1.5cm，從而允許更好的散熱并限制了這些模塊中包括的電路 之間的干擾的風險。 在本文描述的實施方式中，探測與激勵發射器發射的激勵同步。具有520毫秒脈
沖的頻率為lkHz的激勵已成功使用，并允許在需要時實時處理且覆蓋位置。在測量周期
內，交替進行建立含量或編程的索引所需的不同熒光測量。 因而，管理和處理裝置被設置為-通過脈沖發射用于控制發射器的控制信號；-探測這些脈沖生成的熒光峰值，探測器內的放大使得通過負反饋環路拒絕環境 光；-通過例如相同的控制信號，控制對探測到的熒光峰值的處理，例如通過跟蹤保持 單元而實現；以及-將熒光測量的模擬測量提供至采集單元。 在其它實施方式中，利用激勵和探測之間的相位調制提供同步探測。這樣，管理和 處理單元被設置為-根據包括相位調制的頻率控制發射器；-在相位解調中處理熒光探測信號并提供熒光測量。 現在將根據本發明第一方面以可變的距離描述對葡萄果皮中的花色素苷(ANTH) 含量的確定。 圖8以消光系數單位示出了 50%酸化甲醇中錦葵色素苷(葡萄中的主要花色素 苷)的吸收光譜82、葉綠素的發射光譜83、以及濾波器F2 (Schott RG9濾波器)的透射光 譜84。 源11是發射綠色(GREEN)輻射111的源，其波長處于花色素苷的吸收帶內，該輻 射引發葉綠素33的熒光并引起熒光輻射112的發射。源111的波長例如可大約為530nm。 圖8給出了輻射11的光譜86。 GREEN源的實例為Roithner Lasertechnik的NS530L 二極管。 源12發射花色素苷略微吸收或完全不吸收的紅色(RED)輻射121，其引發葉綠素 33的熒光并引起熒光輻射122的發射，其用作測量花色素苷含量的參考。這一源的波長優 選地為650nm。圖8給出了輻射121的光譜85。
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此外，源13發射花色素苷略微吸收或完全不吸收的藍色(BLUE)輻射131，其引發 葉綠素33的熒光并引起熒光輻射132的發射，其用作測量花色素苷含量的補充參考。這一 源的波長優選地為450nm。圖8給出了輻射12的光譜87。 源11、 12和13分別通過發射輻射111、 121和131接連照射組織30。根據花色素 苷含量34，輻射111被果皮的表皮以可變量吸收，而紅光輻射121和藍光輻射131則不被吸 收或僅略微吸收。輻射111U21和131都引發葉綠素33的熒光，然后分別發射紅光或近紅 外的熒光輻射112U22和132，其強度與葉綠素接收的輻射Hl、121和131的強度成比例。 測量源11和源12激發的熒光發射的比率可確定葡萄果皮中花色素苷的含量。此外，測量 源12和源13激發的熒光發射的比率可確定參考輻射12是否受到了含量隨時間增大的花 色素苷的影響。當葡萄的花色素苷含量增大時，輻射lll被過度吸收并開始飽和。此外，花 色素苷還開始影響參考輻射。在這種情況下，為了在由過高濃度的花色素苷引起的超飽和 情況下進行測量，在飽和前作為參考輻射的輻射121在飽和后變為測量輻射，而在飽和前 作為補充輻射的輻射131在飽和后變為參考輻射。輻射lll不再用于測量。這樣則可在超 飽和情況下執行花色素苷的含量測量。
然后，根據以下表達式計算花色素苷含量
ANTH船n前二 logFER_ANTH_GREEN-logFER_CHLG
ANTH船。后二 C+logFER_ANTH_RED-logFER_CHLK
其中， 1. logFER_ANTH_GREEN = log (FRF紅/FRF綠)
2. logFER_ANTH_RED = log (FRF藍/FRF紅)
3. logFER_CHLG = log (FRF紅/FRF綠)
4. logFER_CHLK = log (FRF藍/FRF紅) 在這些表達式中，logFER_CHLG = log (FRF紅/FRF綠)，logFER_CHLK = log (FRF藍/ FRF紅)，logFEILCHLG和logFER_CHLK的量是在葡萄表皮中出現花色素苷之前測量的，ANTH 是以納摩爾/平方厘米為單位的葡萄果皮中的花色素苷含量，FRFg、FRF"和FRF^分別是由 輻射111、 121和131引發的熒光輻射H2、122和132的強度，C是使得在飽和時刻ANTH飽和 后等于ANTH飽和前的常量。 圖9示出了根據本發明的第一方面確定的、葡萄果皮中測量的花色素苷含量的發 展的示意圖。軸線91表示開始執行飽和補償的時間。曲線92示出了根據本發明的飽和補 償，即，將飽和前的參考輻射在飽和后作為測量輻射并將飽和前的補充輻射在飽和后作為 參考輻射，獲得的結果。曲線93示出了不執行飽和補償獲得的結果。因此，應該注意到，在 不執行飽和補償的情況下，獲得的曲線93在飽和后減小，而花色素苷含量繼續增大。通過 補償，實際獲得增大的曲線92，表明了葡萄果皮中花色素苷含量的增大。
現在將根據本發明第二方面以可變的距離描述對葡萄果皮中的花色素苷含量的 確定。根據第二方面，輻射121的波長為650nm保持不變。另一方面，輻射111的波長選擇 為590nm。與根據本發明的第一方面選擇的波長530nm對應于花色素苷的吸收峰值相比，這 一波長對應于花色素苷的較低吸收。圖10示出了在本發明第二方面中使用的50%酸化甲 醇中錦葵色素苷(期望確定含量的花色素苷)的吸收光譜82、葉綠素的發射光譜83、以及 濾波器F2的透射光譜84、輻射121的光譜85和輻射111的光譜88。
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本發明第二方面的測量原理與本發明第一方面的測量原理基本類似。源11和12 分別通過發射輻射111和121接連照射組織30。根據花色素苷含量34，輻射111被果皮的 表皮以可變量吸收，而紅光輻射121則不被吸收。輻射111和121引發葉綠素33的熒光， 然后分別發射被測量的熒光輻射112和122。然而，由于為輻射121選擇的590nm的波長 對應的吸收低于上文所述在本發明第一方面中為輻射121選擇的530nm的波長所對應的吸 收，因此，不會由于葡萄果皮中花色素苷含量的增加而導致飽和。圖11示出了
參第一曲線1111，其示出了用波長530nm的輻射121執行的測量隨葡萄果皮中的 花色素苷含量的變化；以及 參第二曲線1112，其示出了用波長590nm的輻射121執行的測量隨葡萄果皮中的 花色素苷含量的變化。波長590nm比波長530nm對應于對花色素苷更低的吸收。應該注意到，對于530nm 的波長(曲線llll)，很快就達到飽和，而對于590nm的波長(曲線1112)，則不出現飽和。 此外，在曲線1112的情況下獲得的結果比曲線1111的情況下獲得的結果更加線性。
有利地，可將本發明的第一和第二方面結合。事實上，上述的補充輻射131可用于 確定參考輻射121是否受到花色素苷的影響。當花色素苷的濃度或含量使得即使在輻射 111的波長相對于吸收峰值(例如590nm)偏移的情況下也出現飽和時，可將飽和前為參考 輻射的輻射121在飽和后作為測量輻射，并將飽和前為補充輻射的輻射131在飽和后作為 參考輻射。圖12示出了將本發明的第一和第二方面結合而獲得的結果。曲線1201對應于 用以下輻射進行測量的結果
-530nm的輻射111，
-650nm的輻射121，以及
-450nm的輻射131 ; 曲線1201對應于用以下輻射進行測量的結果
-590nm的輻射111，
-630nm的輻射121，以及
-450nm的輻射131。 軸線1203表示根據本發明的第一方面開始執行飽和補償的時間。
此外，輻射111U21和131的波長可根據期望表征的生物組織的pH值的變化而修 改。圖13示出了 pH = 1時花色素苷的吸收光譜1301以及pH = 8時花色素苷的吸收光譜 1302。應該注意到，當pH值增大時，吸收峰值向更高波長偏移。不論執行本發明的哪一方 面，在飽和補償中都可考慮吸收光譜的這種變化。 現在將簡單描述根據本發明第三方面對葡萄果皮中的黃酮醇(FLAV)含量的測 量。在這種情況下，源11是發射紫外線(UV)輻射111的源，該輻射的波長處于黃酮醇的吸 收帶內，其引發葉綠素33的熒光并引起熒光輻射112的發射。源11的波長例如可為375nm 左右。源12可發射650nm的參考輻射121，該波長對應于不被黃酮醇吸收的波長。當果皮中 的黃酮醇含量使測量輻射111飽和時，可使用對應于黃酮醇吸收光譜中較低吸收的450nm 的測量輻射。450nm的這一輻射例如可由源13發射。參考輻射不修改，而是保持為650nm。
本發明還可用于測量發色且具有輕微熒光性或不具有熒光性的其它化合物的含 量，例如番茄中的番茄紅素。
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本發明不限于以上描述的實施例，并可用于表征任何類型的生物組織。
權利要求
用于確定生物實體的組織(30)中稱為第一化合物的非熒光的發色化合物(34)的含量的方法，所述生物組織(30)還包括稱為第二化合物的熒光發色化合物(33)，所述方法包括以下操作的至少一次迭代-由發射裝置(11，12)向所述組織(30)的方向發射稱為測量光學輻射的第一輻射(111)和稱為參考光學輻射的第二輻射(121)，所述第一輻射和第二輻射(111，121)中的每個都選擇為產生所述第二化合物(33)的熒光輻射，所述第一輻射和第二輻射(111，121)中的每個都被所述第一化合物(34)部分吸收；-由測量裝置(21，22)測量所述第一輻射和第二輻射(111，121)引發的所述熒光輻射(112、122)；以及-根據所述第一測量確定所述組織(30)中的所述第一化合物(34)的含量，其特征在于，所述方法還包括對測量飽和的至少一次補償，所述測量飽和是由于所述第一化合物(34)對所述測量輻射(111)的太高吸收而產生的，所述補償包括為所述測量輻射選擇對應于所述第一化合物(34)的吸收光譜中的較低吸收的波長。
2. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，還包括由發射裝置(13)向所述生物組織 (30)的方向發射稱為補充光學輻射的第三光學輻射(131)，所述第三光學輻射被選擇為引 發所述第二化合物(33)的熒光輻射(132)，所述方法還包括測量由所述補充輻射(131)引 發的所述熒光輻射(132)，所述測量用于確定所述參考輻射(121)是否受到所述第一化合 物(34)的影響。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，當所述第一化合物(34)中所述生物組織 (30)的含量影響所述參考輻射(121)時，在飽和后為所述測量輻射(111)選擇的波長對應 于飽和前所述參考輻射(121)的波長附近的波長。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，還包括當所述生物組織(30)和所述發射 裝置(11， 12， 13)及所述測量裝置(21)之間的距離不固定時，在飽和后為所述參考輻射選 擇新的波長，所述新的波長較少地受到所述第一化合物的含量的影響。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，當所述生物組織(30)和所述發射裝置(11， 12,13)及所述測量裝置(21)之間的距離不固定時，在飽和后為所述參考輻射選擇的所述 新的波長對應于所述補充輻射(131)的波長附近的波長。
6. 如前述任一項權利要求所述的方法，其特征在于，當所述參考波長(121)未受到所 述生物組織(30)中所述第一化合物(34)的含量的影響時，為所述測量輻射(111)選擇的 波長比限制波長對應于所述第一化合物(34)的更小吸收，對于所述限制波長，在所述生物 組織(30)中所述第一化合物(34)的期望最大含量的情況下將產生潛在的飽和。
7. 如前述任一項權利要求所述的方法，其特征在于，還包括根據對所述第一化合物 (34)的吸收光譜和/或對所述第二化合物(33)的熒光光譜具有影響的物理化學特征，修改 所述測量輻射(111)和/或所述參考輻射(121)的波長。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述物理化學特征是選自以下列表的特征 _所述生物組織(30)的pH值；-所述生物組織(30)中影響所述第一化合物(34)的輔色效應；以及 -所述生物組織(30)中所述第二化合物(33)的支持結構中的至少一個變化的效應。
9. 如前述任一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述參考輻射(121)和所述測量輻射(111)中的至少之一以預定強度發出，而另一輻射以可變強度發出，從而使所述參考 輻射(121)和所述測量輻射(111)中的每個引發的熒光輻射具有相等的強度。
10. 如權利要求9所述的方法，其特征在于，根據控制信號調整所述測量輻射的強度， 所述控制信號與由所述測量輻射和所述參考輻射引發的熒光輻射相關。
11. 如前述任一項權利要求所述的方法，其特征在于，通過相移以預定頻率交替改變所 述測量輻射(111)和所述參考輻射(121)的強度。
12. 如前述任一項權利要求所述的方法，其特征在于，還包括通過相位調制將所述輻射 (111,121,131)同步。
13. 如前述任一項權利要求所述的方法，其特征在于，所述測量輻射(111)和所述參考 輻射(121)中的每個都以脈沖形式發出。
14. 如前述任一項權利要求所述的方法，其特征在于，確定所述第一化合物(34)的含 量包括計算以下比率由所述參考輻射(121)引發的熒光由所述測量輻射(111 )引發的熒光 。
15. 如前述任一項權利要求所述的方法，其特征在于，還包括確定所述生物組織(30)中所述第一化合物(34)的含量隨時間的發展。
16. 如前述任一項權利要求所述的方法，其特征在于，對所述熒光輻射(112,122)的測-在采自生物實體的組織樣本(30)上執行； _或直接在所述生物實體上執行。
17. 如權利要求4至16中任一項所述的方法，其特征在于， -所述生物組織是葡萄果皮；_所述第一化合物是花色素苷； -所述第二化合物是葉綠素；-飽和前所述測量輻射的波長在500至600nm之間； -飽和前所述參考輻射的波長在600至700nm之間； _所述補充輻射的波長在400至500nm之間； -飽和后所述測量輻射的波長在600至700nm之間； -飽和后所述參考輻射的波長在400至500nm之間。
18. 如權利要求4至16中任一項所述的方法，其特征在于， -所述生物組織是葡萄果皮； -所述第一化合物是黃酮醇； -所述第二化合物是葉綠素；-飽和前所述測量輻射的波長在300至400nm之間； -飽和前所述參考輻射的波長在600至700nm之間； -飽和后所述測量輻射的波長在400至500nm之間； -飽和后所述參考輻射的波長在600至700nm之間。
19. 用于確定生物實體的組織(30)中稱為第一化合物的非熒光的發色化合物(34)的 含量的系統，所述生物組織(30)還包括稱為第二化合物的熒光發色化合物(33)，所述系統包括-發射裝置(11， 12)，向所述組織(30)的方向發射稱為測量光學輻射的第一輻射(111) 和稱為參考光學輻射的第二輻射(121)，所述第一輻射和第二輻射(111,121)中的每個都 選擇為產生所述第二化合物(33)的熒光輻射，所述第一輻射和第二輻射(111,121)中的每 個都被所述第一化合物(34)部分吸收；-測量裝置(21，22)，測量所述第一輻射和第二輻射(111,121)引發的所述熒光輻射 (112U22);以及-計算裝置，根據所述測量確定所述組織(30)中所述第一化合物(34)的含量， 其特征在于，所述系統還包括探測裝置，根據所述熒光輻射測量探測由所述第一化合物(34)對所述測量輻射(111) 的過度吸收而產生的至少一次飽和；以及對所述飽和進行補償的裝置，所述補償包括為所述測量輻射選擇對應于所述第一化合 物(34)的吸收光譜中的較低吸收的波長。
全文摘要
用于確定生物實體的組織(30)中稱為第一化合物的非熒光的發色化合物的含量的方法，所述生物組織(30)還包括稱為第二化合物的熒光發色化合物(33)，所述方法包括以下操作的至少一次迭代向所述組織(30)的方向發射稱為測量光學輻射的第一輻射和稱為參考光學輻射的第二輻射，所述第一輻射和第二輻射中的每個都選擇為產生所述第二化合物的熒光輻射，所述第一輻射和第二輻射中的每個都被所述第一化合物部分吸收；測量所述第一輻射和第二輻射引發的所述熒光輻射；以及根據所述第一測量確定所述組織中所述第一化合物的含量，其特征在于，所述方法還包括對測量飽和的至少一次補償，所述測量飽和是由于所述第一化合物對所述測量輻射的太高吸收而產生的，所述補償包括為所述測量輻射選擇對應于所述第一化合物的吸收光譜中的較低吸收的波長。
文檔編號G01N21/64GK101784884SQ200880018379
公開日2010年7月21日 申請日期2008年5月27日 優先權日2007年6月1日
發明者佐瀾·克洛維可, 尼克拉·莫伊斯, 格溫達爾·拉托徹, 耶維斯·茍拉斯 申請人:弗斯-A公司;國家科研中心;巴黎南大