專利名稱：檢測待測物的試劑及其方法
技術領域：
本公開提供了 一種用于檢測樣品中待測物的含有肝素的試劑以及制 備所述試劑的方法。本公開還提供了用所述試劑檢測待測物的方法。
背景技術：
傷寒是一種由傷寒沙門氏菌(^//mweZ/fli^pAO引起的地方性發熱疾 病。傷寒癥是一個公共健康的關注重點。所述生物體通常通過食用被污染 的食物或水進入體內并穿過腸壁。之后，它進行繁殖并在24-72小時內進 入血流，導致傷寒和菌血癥。潛伏10-14天之后，開始出現傷寒的早期癥 狀如頭痛、發熱、食欲減退、心動過緩、脾腫大等癥狀。傷寒在大多數情 況下不致死。發達國家一般采用抗生素如氨千西林、氯霉素、甲氧爺啶-磺胺甲噁唑和環丙沙星來治療傷寒。及時采用抗生素對所述疾病進行治療 將病死率降低到約1%。當不進行治療時，傷寒熱會持續三周到一個月。 不進行治療的病死率為10-30%。傷寒可通過血液培養或檢測其抗原或檢 測其在血液中的抗體診斷。
通過肥達試驗(widal test)診斷存在若干限制。肥達試驗不是特異 性的，因為其與其他發熱生物體和許多腸桿菌科的生物體都可發生交叉反 應。而且，因為傷寒是一種地方性疾病，因此，在其發病地區總存在一定 背景水平的抗體，這會^J巴達試驗得出錯誤結果。因此，必須為每個地區 確定閾值滴度以排除假陽性的可能性。而且，肥達試驗只能在開始發熱的 一或兩周后才能得到陽性結果。肥達試驗是對采樣間隔至少 一周的成對血 清樣品的試驗，因為單次肥達試驗是難以理解的和不確定的。
肥達試驗的另一限制是在感染早期階段給予抗生素會抑制抗體的出 現并會因此得到假陰性結果。肥達試驗的另一限制是，對于接種了 TAB 疫苗的正常健康人，由于人類系統中存在抗疫苗的循環抗體，因此會得出 假陽性反應結果。肥達試驗的另 一 限制是其給出的是傷寒感染的非直接證 據。肥達試驗的又一限制是所述試驗具有低靈敏度和低特異性。
4其他傷寒診斷的已知技術是基于病原體的分離和鑒定。此方法被稱為 黃金法則。在此技術中，通過顯微和生化試驗從血液中分離出傷寒沙門氏 菌并對其鑒定。然而，此技術具有4艮多限制。上述技術的限制之一是耗時，
因為其需要3-14天的長時間培育并需要完善的實驗室設備。上述技術的 另一限制是它的進行需要大量血液樣品(10 ml/患者)。上述技術的又一 限制是其需要大量培養基即100 ml (血液樣品的10倍)。上述技術的另 一限制是其低靈敏度(40-80%),因為循環中只存在低至1/ml的極少生物 體，itit成了假陰性結果。
上述方法的另一限制是培養細菌的生長被血液中的血清殺菌劑抑制， 這會導致假陰性結果。
血液培養的另一限制是感染早期的抗生素處理可能會抑制培養細菌 的生長，這也會導致假陰性結果。
WO2004047721專利提供了 一種制備用于快速檢測傷寒的凝集劑的 方法。WO2007034508提供了 一種檢測和/或定量樣品中的待測物的超靈 敏方法。
其他已知方法如放射性免疫測定(RIA)、酶聯免疫吸收試驗等基于對 體液中循環抗體的檢測，但這些技術具有許多限制。這些技術的限制之一 是它們需要復雜和完善的實驗室設備。RIA的另一限制是其需要危害健 康的放射性材料并需要技術人員來處理所M射性材料。上迷技術的另一 限制是試劑非常昂貴。這些技術的另 一 限制是進行這些試驗至少需要4-5 小時。大量基于乳膠顆粒的免疫試驗用于診斷。抗原的存在經常通過^皮其 抗體包被的顆粒的凝集確定。所述試驗對最高達有限濃度的抗原是可靠 的。抗原低于某一濃度時，凝集反應不會發生。所述凝集反應是一種以擴 散為主的過程，因此相當緩慢。為了加快凝集速度和提高試驗的靈敏度， 尤其是在皮摩爾和飛摩爾范圍的低濃度下，人們嘗試了許多技術，其中有 一些在下文有討論。
非空化駐波超聲可迫使抗體包被的顆粒進入壓力節點區域從而造成 顆粒碰撞的速度加快，因此已被用于增加不同乳膠凝集試驗的靈敏度 (Grundy et al， J of Immunological Methods, vol 165， p 47， (1993)和Ellis et al, J Med. Microbiol., vol 49, p 853， (2000))。小體積液流得到控制的微流 體系統是另 一加強抗原和抗體之間相互作用的方法(Verpoorte， Electrophoresis, vol. 23， p 677， (2002)和Kricka， Clinical Chemistry, vol 44p 2008, (1998))。
共面電場也已被用于形成膠粒鏈，從而加快乳膠凝集反應的速度 (Song et al， Analytical Chemistry, vol. 66， p. 778， (1994))。
所有上述現有^L術方法都有其內在的限制。例如，在共面場中，所述 顆粒形成了鏈。在一條鏈中，相鄰顆粒的最大數目為2。換言之，只可能 形成所述顆粒的陣列。因此，即4吏在所述抗體包凈皮顆粒上有更多的結合位 點的情況下，也不可能再進一步提高其特異性和靈敏度。微流體系統需要 許多不總是隨手可得的精細工程。因此，本領域中需要提供一種方法和系 統，藉此，所述試驗的靈敏度得到提高，并且樣品中的材料即使在4艮低的 濃度下也可被檢出。
然而，很清楚地，本文通過引用的方式納入的任何文獻都沒有教導或 公開本發明。
發明內容
本公開提供一種檢測樣品中待測物的試劑，所述試劑包含肝素和被待 測物配對物包被的基質，其中所述待測物配對物能夠與所述待測物結合。
本公開提供了 一種用于檢測樣品中待測物的方法，所述方法包括用所 述試劑接觸所述樣品。所述試劑包含肝素和被一種待測物配對物包被的基 質。所述待測物通過所述待測物和所述待測物配對物形成復合物來檢測， 所述復合物在下文中稱為待測物-待測物配對物復合物。
本公開提供了 一種用于檢測樣品中待測物的試劑盒，所述試劑盒包含 所述試劑和說明書。
;^&開提供一種用于制備所述試劑的方法，所述試劑包含肝素和祐L待 測物配對物包被的基質，其中所述待測物配對物能夠與所述待測物結合。 制備所述試劑的方法包括制備一種基質的懸浮液，用一種待測物配對物 包被所述基質并加入肝素。
圖1示出待測物被待測物配對物所附著的基質捕獲從而使它們凝集。 圖2示出一種用于實施本發明的實驗裝置。圖3示出在存在和不存在電場的情況下待測物(傷寒沙門氏菌抗原) 與被傷寒沙門氏菌特異性抗體包被的基質(乳膠顆粒)的凝集。 圖4示出像素強度偏差相對陽性對照濃度的變化。 圖5示出使用ELISA檢測樣品中待測物的本方法的改進方法的圖解。 圖6示出用于檢測和定量樣品中待測物的反應裝置。
具體實施例方式
本公開提供一種檢測樣品中待測物的試劑，所述試劑包含肝素和被所 述待測物配對物包被的基質，其中所述待測物配對物能夠與所述待測物結 合。
本公開提供一種用于制備所述試劑的方法，所述方法包括制備一種 基質的懸浮液；用一種待測物配對物包被所述基質；并加入肝素。
本公開提供了 一種用于檢測樣品中待測物的方法，所述方法包括用所 述試劑接觸所述樣品。所述試劑包含肝素和被一種待測物配對物包被的基 質。所述待測物通過所述待測物和所述待測物配對物形成復合物來檢測， 所述復合物在下文中稱為待測物-待測物配對物復合物。
本公開提供了一種用于檢測樣品中待測物的試劑盒，所述試劑盒包含 所述試劑和i兌明書。
抗原(抗體自其生成)即免疫原是一種有時會激發免疫反應的分子。 抗原通常是蛋白或多糖。這包括細菌、病毒和其他微生物的某些部分(外 殼、莢膜、細胞壁、鞭毛、菌毛和毒素)。脂質和核酸只有在與蛋白和多 糖結合時才具有抗原性。非微生物外源(非自身的)抗原可包括花粉、蛋 清以及來自移植組織和器官的蛋白或輸入血細胞表面上的蛋白。
在本公開中，術語待測物包括微生物、酶、蛋白、糖、毒素、半抗原 以及其他外來顆粒。因此，術語待測物也包括抗原。本文所用術語"待測 物"可包括給定樣品中希望被檢測的任何物質。它可以是抗原、抗體、糖、 半抗原、毒素或任何其他類似物質。在本公開中，術語待測物以抗原傷寒 沙門氏菌抗原為例。
在本公開中，除上下文另有清楚說明的以外，單數形式的"一"、"一 種，，和"該"都包括復數指代對象。因此，例如，提及"一種基質"時包括多 種這樣的基質，提及"一種抗體"時指一種或多種抗體或其為本領域技術人員所知的等同物。類似的語法規則也適用于其他例子，如待測物、顆粒、 免疫球蛋白、待測物配對物和分子。
用于檢測待測物的"樣品，，包括尿液、唾液、血液、滑液、腦脊液和任 何其他天然或合成的生物材料。
所得結果可通過任何可檢測信號讀取或檢測，并采用諸如化學發光、 比色法、放射、反射、熒尤復光、雙折射、(在特定波長或波段處的)光 密度變化、透射光吸收度的測量(比濁法)、在前向小角度處的散射光的 測量(稱為散射比濁法)、掃描激光顯微技術、目測和數字成像等技術觀 察。
抗體，也稱為免疫球蛋白，是存在于脊推動物的血液或其他體液中的 蛋白，其被免疫系統使用以識別和中和外來物，如稱為抗原的細菌和病毒。 在本公開中，術語抗體和免疫球蛋白在下文可交換使用。術語"待測物配 對物"用于代表任何能夠識別所述待測物的材料。例如，如杲所述待測物 是一個抗原，則所述待測物配對物可以是一個抗體。"結合伴侶"即基質是 所述待測物配對物通過共價鍵或非共價鍵附著的任何顆粒或材料。它包括 乳膠、聚苯乙烯、金、銀、鈀或任何其他可供所述待測物配對物附著的聚 合或纖維顆粒。
本公開的一個實施方案提供一種檢測樣品中待測物的試劑，所述試劑 包含被待測物配對物包被的基質，和肝素，其中所述待測物配對物能夠與 所述待測物結合。本公開采用肝素來將樣品例如血清和血漿樣品中的非特 異性反應最小化。
^^開的一個實施方案提供了 一種用于制備所述試劑的方法，所述方
法包括制備一種基質的懸液，用一種待測物配對物包被所述基質，并加 入肝素。
在本公開的另一個實施方案中，所述試劑選自尿液、唾液、血液、滑 液、腦脊液和其他生物材料。
在本公開的另一個實施方案中，所述基質選自乳膠顆粒、金屬顆粒、 聚合物顆粒、碳顆粒和硅顆粒。
此外，在本公開的一個實施方案中，所述乳膠顆粒是羧化乳膠顆粒。
在本公開的一個實施方案中，所述乳膠顆粒是大小為0.88-0.卯jim的 羧化乳膠顆粒。
在本公開的另一實施方案中，所述待測物是一種生物大分子。在本公開的另 一實施方案中所提供的所述待測物是一種抗原。 本公開的另一實施方案所提供的所述抗原是傷寒沙門氏菌抗原。 本公開的另 一 實施方案所提供的所述待測物配對物是一種抗體。 本公開的另一實施方案所提供的所述抗原選自微生物、酶、蛋白、糖、
毒素、半抗原和其他外來顆粒。
本公開的另一個實施方案所提供的所述待測物配對物選自蛋白和碳
水化合物。
本公開的另 一個實施方案提供一種檢測樣品中待測物的方法，所述方 法包括用所述試劑接觸所迷樣品，并檢測待測物和所迷待測物配對物之間 復合物的形成，以下所述復合物稱為待測物-待測物配對物復合物。所述 試劑包括被一種待測物配對物包被的基質，和肝素，其中所述待測物配對 物能夠與所述待測物結合。
此外，本公開的另一實施方案提供通過檢測待測物-待測物配對物復 合物的形成來檢測樣品中待測物的方法。檢測所述待測物-待測物配對物 復合物所采用的檢測技術選自化學發光、比色法、放射、反射、熒光發光、 雙折射、光密度變化、比濁法、散射比濁法、掃描激光顯微技術、目測和 數字成像。
本公開的另 一 實施方案提供了檢測樣品中待測物的方法，所述方法利 用在與插入所述樣品中的電極平面垂直的方向上施加電場。
在本公開的另 一個實施方案中，可檢測存在于所述樣品中的最低達皮 摩爾濃度的待測物。
本公開的另一實施方案提供了一種用于檢測樣品中待測物的試劑盒， 所述試劑盒包括試劑和說明書。所述試劑包括肝素和凈皮所述待測物配對物 包被的基質，其中所述待測物配對物能夠與所述待測物結合。
本公開的另 一實施方案所提供的試劑盒被用于檢測待測物，所述待測 物以傷寒沙門氏菌為例。
本公開的另 一實施方案所提供的試劑盒還包括電極、在垂直方向上對 所述樣品施加電能的工具和用于檢測讀出信號的工具。
本公開的另 一 實施方案涉及檢測樣品中待測物傷寒沙門氏菌抗原的 方法。本公開還提供一種檢測樣品中目的待測物的高度特異和靈敏的方
法。表5提供了用于檢測樣品中待測物的凝集反應。
本公開還在Z方向上施加電場以檢測樣品 待測物。所述電場加強了用于檢測待測物(本文以沙門氏菌抗原為例)的凝集反應的靈敏度。
本公開中檢測待測物例如傷寒沙門氏菌的方法包括用本公開的試劑 接觸待測樣品的步驟。所述試劑包括被抗目標待測物的抗體包被的基質， 例如乳膠顆粒。所述試劑還包括肝素。用所述試劑接觸所述樣品一段充分 的時間以使所述待測物配對物與待測物結合。樣品中的待測物與所述待測 物配對物的結合導致待測物-待測物配對物復合物的形成。該復合物導致 反應混合物中形成簇，所述簇隨后可被檢測到。此外，檢測所述待測物-待測物配對物復合物所采用的檢測技術選自化學發光、比色法、放射、反 射、熒光發光、雙折射、光密度變化、比濁法、散射比濁法、掃描激光顯 微技術、目測和數字成像。
本公開中檢測待測物例如傷寒沙門氏菌的方法任選地利用在與所述 樣品的平面垂直的方向上施加電場以產生可檢測信號。施加電場導致可檢 測到樣品中微量的、不施加電場就檢測不到的待測物。施加電場導致可檢 測到最低達皮摩爾量的待測物。
本^^開提供一種檢測樣品中待測物例如傷寒沙門氏菌抗原的高度特 異的方法。樣品，例如從臨床傷寒疑似患者收集的血清樣品，在試驗中表 現出非特異性的凝集反應。將肝素加入被待測物配合物包被的乳膠顆粒使 這種非特異性相互作用最小化并使特異性增加數倍。
本公開提供了一種方法，藉此，可檢測樣品中乃至最少量待測物的存
在。在z方向上(與所述樣品的平面垂直)施加電場時，所述待測物和
待測物配對物在電場范圍內趨向形成較大的簇，從而可檢測出給定樣品中 乃至最小量的待測物。
在本公開中，在垂直電場的影響下，所述待測物配對物所附著的基質 發生凝集，因此所述待測物被捕獲于所述基質之間。圖l顯示了所述作用 機理的圖解。因為在一個簇中，相鄰顆粒的數量更多，因此該方法可更好 地促進待測物與待測物配對物鍵的形成并因此得到優異的和很高的靈敏 度。
樣品中待測物的檢測方法可通過若干不同的實施方案實施，例如在z 方向上施加電場。所述電場可通過使用 一種專門針對待測物制備的待測物 配對物來檢測出樣品中乃至最少量的所述待測物。例如，如果所述待測物 是一個抗原，則制備該抗原的抗體并備用。此后，制備被所述待測物配對
物包被的基質例如聚合材料或乳膠體，然后制備一種包括所述包被材料和樣品中待測物的混合物。如此制備的混合物是一種膠體分散液，將其置于
固態表面上(所述表面被一種導體材料預先包被)并對其(在z方向上) 施加一個電場，從而待測物配對物與所述待測物結合，再通過一種合適的 讀出信號檢測結果。
任選地，未結合的乳膠體和反應溶液可在一段時間后被清洗掉，從而 只留下固定的復合物以觀察讀出信號。
另 一改進方法可以是ELISA (酶聯試驗)，其中第一待測物配對物附
著于第一基質。并且提供附著于第二基質的第二待測物配對物和酶。將所 述第一待測物配對物加入樣品中， 一段時間后再加入第二待測物配對物，
然后施加充分時間的垂直于所述樣品平面的電場以引起所述第一待測物 配對物和第二待測物配對物(帶有酶)凝集并產生一個可檢測的讀出信號。 圖5和6顯示所述ELISA改進方法的圖解。
在一個改進方法中，可將患者的樣品收集在小管中，再將附著于所述 基質上的待測物配對物加入該小管中。然后將兩個電極浸入所述小瓶中， 使其能有效形成待測物配對物和待測物復合物并給出讀出信號。
在前述實施方案中，所施加的電場可以由交流電、直流電或電池供電。
在另一個實施方案中，^^開提供一種可用于檢測樣品中待測物存在 的裝置，所述裝置包括一個導電電極和一個電源，還包括一種將電能在垂 直于所述電極的方向上施加到所述電極的工具。圖2和6顯示所述反應裝 置的圖解。抗體包被的基質和含有所述待測物的樣品夾在兩塊被導電銦錫 氧化物(ITO) 18包被的玻璃板17之間。所述兩板由75 nm厚的絕緣隔離 片隔開，并且此小室被密封以防止所述懸浮液蒸發和流出。 一個與電位計 連接的信號函氣t生器25可用于調節所施加的正弦電壓的強度，所述電 壓可在萬用表16上被讀出。與CCD攝像機40連接的偏振光顯微鏡30 (透射模式)可用于拍攝所述顆粒。觀察結果被記錄在錄^^L45上。所 述裝置還具有計算機50，其可以每秒25幀的速度將圖像數字化。可通過 分析捕獲的圖像來定量凝集程度。
在另 一實施方案中，本公開提供用于檢測樣品中待測物存在的試劑 盒。所述試劑盒會才艮據采用的試驗類型而有所變化。然而，通常，所述試 劑盒可包括導電表面以用作電極；用于在垂直于待測物配對物和待測物復 合物的方向上向所述樣品施加電能的電源和工具；能夠識別樣品中與待測 物配對物結合的待測物的待測物配對物，其中所述待測物復合物被包被在基質如乳膠顆粒上；用于檢測讀出信號的工具；和說明書。
本公開的一個實施方案在實施例1中提供用于檢測待測物傷寒沙門氏菌的試劑的制備方法。
在實施例l和2中，本公開的另一實施方案提供在使用和不使用肝素的情況下對樣品中待測物即傷寒沙門氏菌抗原的檢測。實施例1和2還說明，在檢測待測物即傷寒沙門氏菌抗原中對新鮮和存放的試驗樣品所觀察到的凝集不同。實施例2還說明施加垂直于插入所述樣品中的電極平面的電場時檢測靈敏度加強。在Z方向上施加電場時的凝集反應的強度比不施加電場時要大。
本公開的另一實施方案說明肝素以外的抗凝血劑不會防止導致假陽性信號的非特異性相互作用。實施例3說明，使用肝素以外的抗凝血劑如EDTA和檸檬酸鈉檢測樣品中的待測物時不能防止非特異性相互作用。
4^>開的另 一實施方案說明，由于非特異性相互作用而在新鮮試驗樣品中觀察到的凝集反應導致假陽性結果。因此，要精確檢測樣品中的待測物，必須防止導致凝集反應的非特異性相互作用以消除假陽性信號。防止非特異性相互作用可通過向被針對目標待測物的待測物配對物包被的基質例如乳膠顆粒中加入肝素來實現。通過使用肝素防止樣品中的非特異性相互作用是本公開一個意外的結果。
盡管本發明各個實施方案和/或各個特征已經被說明和描述，但是本領域技術人員明顯可知在不偏離本發明精神和范圍的情況下還可進行各種其他改變和改動。技術人員還明顯可知，前述公開教導的實施方案和特征的全部結合都是可能的，并可產生本公開優選的實施方案。
實施例
給出下面的實施例是為了向本領域普通技術人員就如何制造和使用本發明提供完整的公開和描述，而不是意圖限制發明者認定的本發明的范圍，也不意圖表示以下實驗是進行的所有的和唯一的實驗。
實施例l:傷寒沙門氏菌抗原的檢測A.傷寒沙門氏菌抗原的抗體的制備
對傷寒沙門氏菌特異的鞭毛蛋白的基因序列使用基因特異引物通過多聚^式反應(PCR)擴增。擴增的PCR產物在有6個組氨酸標簽的載體中被克隆并稍后被表達。所表達的蛋白通過Ni-NTA親和柱色鐠純化。所純化產物的蛋白含量通過Bradford法測定。在兔中培育此蛋白的超免疫血清。^Jt疫血清的免疫球蛋白部分通過硫酸銨沉淀被分離。所沉淀的免疫球蛋白被懸浮于1.0 ml PB (50 mM， pH 7.2)中，對其進行透析并測定其蛋白含量。
B. 含有乳膠顆粒的懸浮液的制備
取1.0 ml的1%羧化乳膠顆粒和1.0 ml的40 mM MES緩沖液(pH5.8-6.3)置于2.0 ml微量離心管中并在震蕩混合器上混合60秒再在4°C下以10000 rpm離心10-12分鐘。再將所述乳膠顆粒在2.0 ml 20 mM MES緩沖液(pH 6.1)中通過在震蕩混合器上混合60秒再在4。C下以10000 rpm離心10-12分鐘洗滌兩次。最后一次洗滌后，將所述乳膠顆粒懸浮于1.0 mlMES緩沖液(20 mM， pH 6.1)中并用末端超聲機在5瓦特下超聲處理60-120秒。稍后逐滴加入1.0 ml新鮮制備的0.1 M 1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)的MES緩沖液(20 mM， pH 6.1)溶液，同時緩慢震蕩該溶液。使所述離心管在20-25。C下以頭尾相覆的形式緩慢轉動3小時，然后用MES緩沖液(20 mM， pH 6.1)通過在4。C下以10000rpm離心10-12分^l中洗滌3次。然后將所述乳膠顆粒重懸浮于0.7 ml MES緩沖液(20 mM， pH 6.1)中并用末端超聲機在5瓦特下超聲處理60-120秒。
C. 乳膠試劑的制備
乳膠試劑包含包被有對待測物(在本申請中為傷寒沙門氏菌)特異的抗體的乳膠顆粒和肝素。
將0.6 mg的免疫球蛋白加入到如上制備的此乳膠顆粒懸浮液中并將體積用MES緩沖液(20 mM， pH 6.1)補足到1 mL。然后將此混合物在20-25。C下以頭尾相覆的形式緩慢轉動18-20小時，以用所述抗體包被所述乳膠顆粒。然后通過加入0.06 ml的1M氨基乙酸(pH ll.O)終止所述包被反應。所述轉動在20-25-C下持續30分鐘。所述包,皮有抗體的乳膠顆粒通過在4'C下以10000 rpm離心而形成沉淀。用2.0 ml洗'條緩沖液(50mM氨基乙酸，pH 8.5， 0.03% triton X-100和0.05%疊氮化鈉)在4'C下以10000 rpm離心10-12分鐘將所述沉淀洗滌三次。將包,皮有抗體的經洗滌的乳膠顆粒重懸浮于儲存緩沖液中(50 mM氨基乙酸，pH 8.5, 0.03%tritonX-100和0.1。/o疊氮化鈉)以獲得終濃度為1%的被抗體包被的乳膠，然后將其用末端超聲機在5瓦特下超聲處理60秒并儲存于4°C。將肝素加入到上述儲存緩沖液中，使濃度為每ml儲存緩沖液50單位。
D. 在所述乳膠試劑中加入測試樣品
將20-40 jil (l-2滴)新鮮測試樣品、儲存測試樣品、陽性對照和陰 性對照置于一張玻片上的不同位置。
新鮮測試樣品是從受試者獲得的并立即對待測物(傷寒沙門氏菌抗 原)的存在進行檢測的樣品。
儲存測試樣品是長時間(7天以上)儲存在約4°C或更低的低溫下的 樣品。
將10-20 pl (1-2小滴)所述乳膠試劑加入所述新鮮測試樣品和儲存 測試樣品、陽性和陰性對照中。用不同的木棒將所述反應物小心混合以避 免置于玻片上不同位置的反應物的任何混雜。通過轉動玻片l-2分鐘使所 述>^應物進一步混合。
E. 特異性測定
用不含肝素的乳膠試劑對上述樣品中的抗原進行檢測。所有樣品都顯 示1+級凝集反應。然而，當使用含有肝素的乳膠試劑時，在所有樣品中 都未觀察到凝集(非特異性反應)。
使用傳統傷寒檢測方法確認所述結果時，發現新鮮和儲存測試樣品中 都不含有傷寒沙門氏菌抗原。因此，結論是在新鮮測試樣品和陰性對照中 觀察到的凝集反應是由于非特異性反應所致。因此，要精確檢測樣品中的 待測物，必須防止導致凝集反應的非特異性相互作用以消除假陽性信號。 防止非特異性相互作用可通過向被抗傷寒沙門氏菌抗原的抗體包被的乳 膠顆粒的懸浮液中加入肝素來實現。
實施例2:在Z方向上施加電場檢測傷寒沙門氏菌抗原 制備傷寒沙門氏菌抗原的抗體、制M有乳膠顆粒的懸浮液、制備乳
膠試劑和向所述乳膠試劑中加入測試樣品的步驟如實施例1中所討論的
進行，
對于在Z方向上施加電場， 一個實驗裝置的實例示于表2。所述乳膠 顆粒的懸浮液和所述待測物測試樣品的混合物夾在兩塊被導電銦錫氧化 物(ITO)18包被的玻璃板17之間。所述兩板由75 pm厚的絕緣隔離片隔 開，并且此小室被密封以防止所述懸浮液蒸發和流出。 一個與電位計連接 的信號函IUL生器25可用于調節所施加的正弦電壓的強度，所述電壓可在萬用表16上被讀出。與CCD攝像機40連接的偏振光顯微鏡30 (透射模式)可用于拍攝所述顆粒。觀察結果被記錄在錄像機45上。所述裝置還包括帶有黑白影像采集卡PCI-1411 (National Instruments, USA)的計算機50,其可以每秒25幀的速度將圖像數字化。可通過分析用此卡捕獲的圖像來定量凝集程度。為研究電場的影響，將一體積(3 nL)被抗體包,皮的乳膠顆粒與一體積(3 nL)不同稀釋度的待測物混合物混合，并將此混合物夾在兩塊被導電銦錫氧化物(ITO)包被的由75 jim厚的隔離片隔開的玻璃板之間。所述小室用蠟密封以防止水分蒸發。 一個與電位計連接的信號函數發生器用于調節所施加的電場的強度。首先測定在不存在任何抗原時顆粒凝集的電場閾值。在存在抗原時，施加強度為所述電場的大約0.85倍的電場來進行本實驗。對施加電場的這一選擇可使假陽性信號(沒有抗原的情況下發生凝集)最小化，同時使識別的敏感度和速度最大化。本發明人發現最佳電壓為1.5 V。為了比較存在和不存在所述電場時的影響，還在不施加任何電場的情況下在相同的條件下進行了實驗。用與CCD攝像機和影像釆集卡連接的偏振光顯微鏡(透射模式，物鏡為40 x )對所述顆粒成像。用免費軟件ImageJ處理這樣獲得的影像。應用合適的濾光片，然后調整所述閾值，之后，所述影傳3皮轉變為二元影4象，其中所述顆粒/蔟為黑色而背景為白色。然后，使用ImageJ的工具中的創建來計算每簇的平均面積。進行用于檢測樣品中待測物的凝集反應的反應裝置示于圖6。圖6顯示了用兩個電極浸在含有所述測試樣品的小瓶中，能夠有效地進行凝集(傷寒沙門氏菌抗原-抗體復合物的簇形成)反應。然后通過4吏用讀出信號工具對所述待測物進行檢測和定量。
在對所述反應混合物(測試樣品和含有肝素的乳膠顆粒懸浮液)施加電場時，在所述樣品中觀察到凝集反應。在Z方向上施加電場時凝集的強度比不施加電場時要大。存在和不存在電場時的陽性對照的凝集示于圖3。在圖3中，左圖為不存在電場的情況，右圖為存在電場的情況。顯示了陽性對照在兩個不同濃度下的凝集反應。
此外，通過每簇平均面積的方法對傷寒沙門氏菌抗原的存在進行定量。每簇平均面積相對陽性對照濃度的變化圖示于圖4。
用不含肝素的乳膠試劑進行上述樣品中的抗原檢領'J。所有樣品都顯示1+級凝集反應。然而，在使用含有肝素的乳膠試劑時，在所有的樣品中均未觀察到凝集反應(非特異性反應)。使用傳統傷寒檢測方法確認所述結果時，發現新鮮和儲存測試樣品中 都不含有傷寒沙門氏菌抗原。因此，結論是在新鮮和儲存測試樣品和陰性
對照中觀察到的凝集反應是由于非特異性反應所致。因此，要精確檢測樣 品中的待測物，必須防止導致凝集反應的非特異性相互作用以消除假陽性 信號。防止非特異性相互作用可通過向被傷寒沙門氏菌抗原包被的乳膠顆 粒的懸浮液中加入肝素來實現。
實施例3:在存在Z方向電場和其他抗凝血劑時新鮮測試樣品和儲存 測試樣品中傷寒沙門氏菌抗原的檢測
重復實施例2中提到的步驟。然而，用EDTA代替肝素。用不含肝 素的乳膠試劑在新鮮和儲存樣品，陽性和陰性對照中進行抗原檢測。所有 樣品都顯示1+級凝集反應。當在用于檢測傷寒沙門氏菌抗原的乳膠試劑 中加入EDTA時，在所有樣品中都觀察到了凝集反應(非特異性反應)。
使用傳統傷寒檢測方法確認這一結果時，發現新鮮和儲存測試樣品中 都不含有傷寒沙門氏菌抗原。因此，結論是在新鮮和儲存測試樣品和陰性 對照中觀察到的凝集反應是由于非特異性反應所致。因此，EDTA不能象 肝素一樣防止導致凝集的非特異性相互作用。
使用檸檬酸鈉代替EDTA進行相同的檢測方法。相同的結果表明檸 檬酸鈉不能象肝素一樣防止導致凝集的非特異性相互作用和假陽性信號。
權利要求
1.一種檢測樣品中待測物的試劑，所述試劑包含肝素和被待測物配對物包被的基質，其中所述待測物配對物能夠與所述待測物結合。
2. 如權利要求l要求的試劑，其中所述樣品選自尿液、唾液、血液、滑液、腦脊液和其他生物材料。
3. 如權利要求l要求的試劑，其中所述基質選自乳膠顆粒、金屬顆粒、聚合物顆粒、碳顆粒和珪顆粒。
4. 如權利要求3要求的試劑，其中所述乳膠顆粒是大小為0.88-0.90 fim的羧化乳膠顆粒。
5. 如權利要求l要求的試劑，其中所述待測物是一種生物大分子。
6. 如權利要求l要求的試劑，其中所述待測物是一種抗原。
7. 如權利要求6要求的試劑，其中所述抗原是傷寒沙門氏菌(妙A/)抗原o
8. 如權利要求l要求的試劑，其中所述待測物配對物是一種抗體。
9. 如權利要求6要求的試劑，其中所述抗原選自微生物、酶、蛋白、糖、毒素、半抗原和其他外來顆粒。
10. 如權利要求l要求的試劑，其中所述待測物配對物選自蛋白和碳7JC化合物。
11. 一種檢測樣品中待測物的方法，所述方法包括用如權利要求l要求的試劑接觸所述樣品，并檢測待測物-待測物配對物復合物的形成。
12. 如權利要求11要求的方法，其中檢測所述復合物所采用的檢測技術選自化學發光、比色法、放射、反射、熒光發光、雙折射、光密度變 化、比濁法、散射比濁法、掃描激光顯微技術、目測和數字成像。
13. 如權利要求11要求的方法，還包括在與插入所述樣品中的電極平面垂直的方向上施加電場。
14. 如權利要求13要求的方法，可檢測所述樣品中最低達皮摩爾濃度的待測物。
15. —種用于檢測樣品中待測物的試劑盒，所述試劑盒包括如權利要求1要求的試劑和說明書。
16. 如權利要求15要求的試劑盒，其中所述待測物是傷寒沙門氏菌抗原。
17. 如權利要求15要求的試劑盒，還包含電極、在垂直方向上對所述樣品施加電能的工具和用于檢測讀出信號的工具。
18. —種用于制備如權利要求l要求的所述試劑的方法，所述方法包括(a) 制備一種基質的懸浮液；(b) 用一種待測物配對物包被所述基質；并(c) 將肝素加入上述反應體系。
全文摘要
本公開提供了一種用于檢測樣品中待測物的試劑以及制備所述試劑的方法。所述試劑包含肝素和被待測物配對物包被的基質。所述試劑的待測物配對物能夠與所述待測物結合。本公開還提供一種通過用所述試劑接觸所述樣品并檢測待測物-待測物配對物復合物的形成來檢測樣品中待測物的方法。本公開還提供一種用于檢測樣品中待測物的試劑盒。
文檔編號G01N33/569GK101680894SQ200880015415
公開日2010年3月24日 申請日期2008年3月13日 優先權日2007年3月14日
發明者A·K·蘇德, A·S·尼吉, G·P·雷, G·S·阿加沃, K·瑟卡拉, S·M·P·雷杰 申請人:國防研究與發展組織總干事;印度理學院