專利名稱：：未分離的循環癌細胞的Her-2/neu蛋白的檢測和治療的制作方法未分離的循環癌細胞的Her-2/neu蛋白的檢測和治療
背景技術：
：市場上檢測來自癌細胞的Her-2/neu(也稱為Her2/neu、HER2、c-erbB-2和erbB2)蛋白或相關基因的現有測試繁瑣且非常耗時。而且，僅有25%30%的乳腺癌患者基于在其原發腫瘤活檢中發現Her-2/neu(也稱為Her2/neu、HER2、c-erbB-2和erbB2)蛋白或基因的水平升高而接受Her-2/neu定向治療。文獻中的數據表明在原發腫瘤活檢中具有Her2/neu陰性結果的大量女性(26名受測者中的11名)繼續發展為對其循環癌細胞的Her2/neu陽性(HayesDF等，IntJOncol21:1111-1117;MengS等，2004ProcNatlAcadSciUSA101:9393-9398)。此外，相當數量的患乳腺癌的女性沒有易用于測試Her-2-neu狀態的活檢材料。Hayes等與Meng等的文章中所用的方法繁瑣而耗時，需要快速的、更方便的測試，尤其是能在醫師的診室內進行的測試。Hayes等的方法需要流式細胞術分析而Meng等的方法需要熒光原位雜交(FISH)，這些都比本發明所述的Her-2/neu蛋白的直接檢觀lJ(例如，通過ECL)更加復雜和耗時。而且，Meng等與Hayes等的方法需要免疫磁珠以便富集腫瘤細胞。相反，就通過避免可見于從全血或外周血單核細胞中分離癌細胞的歩驟中的損失而改善靈敏度而言，無需這類分離步驟而進行的如本發明中的快速方法提供了額外的優點。Her2/neu和Her-2/neu耙向治療在來自患乳腺癌的女性的約25°/。的活檢樣品中觀察到Her2/neu癌基因的過表達，且所述過表達與較差的預后(prognosis)相關。曲妥珠單抗(HERCEPTIN)是抗Her2/neu受體的胞外域(ECD)的人源化單克隆抗體，并且抑制過表達該受體的人乳腺癌細胞的增殖(近期綜述見EsteveFJ2004，TheOncologist9(增刊第3期):第4-9頁)。乳腺癌細胞上的Her-2/neu蛋白表達可以容易地達到每個細胞500,000個分子以上的水平，與稱為SK-BR-3的過表達Her-2/neu的人乳腺癌細胞系的情形相同。目前的Her2/neu測試依賴于對患者的活檢組織切片進行所述蛋白的過表達或基因擴增的測試。在帶有基因擴增或所述蛋白的至少2+的免疫染色的那些女性中，用單一藥劑曲妥珠單抗或用曲妥珠單抗與如紫杉醇等化學治療劑的組合顯示出顯著響應。近來，拉帕替尼(也稱為GW-572016)已由美國食品藥品管理局(FDA)批準用于治療患Her-2/neu陽性乳腺癌的女性。除乳腺癌以外，Her-2/neu還在包括卵巢癌的其它癌細胞上過表達。在醫療實踐中迫切需要能從全血或PBMC樣品快速且直接地進行的方便測試，該測試具有足夠的靈敏度和特異性以便識別在循環乳腺癌細胞上有Her-2/neu蛋白過表達并因此可能受益于Her-2/neu靶向治療(例如，曲妥珠單抗、拉帕替尼)或受益于其它抗Her-2/neu定向治療的患乳腺癌的女性。由于文獻中有證據表明目前不適于曲妥珠單抗或拉帕替尼治療的數千名患乳腺癌的女性具有Her-2/neu過表達的循環腫瘤細胞并且具有被視作Her-2/neu陰性的原發腫瘤，因而所述測試越發重要。如果這類女性最初被識別出來，則她們可以受益于抗Her-2/neu靶向劑。在WO2006/041959(WellstatBiologiesCorp.)中描述了用于檢測經分離的循環癌細胞上的Her-2/neu蛋白表達的方法。就測試容易性、測試的迅速性、最重要的是就通過減少對樣品的大量操作來防止癌細胞損失而言，無需首先將循環癌細胞分離將是一個顯著優點。但現有技術認為主要障礙在于獲得具有足夠的靈敏度和特異性以便從全血血樣中或來自人外周血單核細胞樣品的低水平循環乳腺癌細胞中檢測Her-2/neu的免疫測試。Hayes等(2002，IntJOncol21:1111-1117)和Meng等(2004ProcNatlAcadSciUSA101:9393-9398)在他們的來自循環癌細胞的Her-2/neu的測試中都要求采用富集手段。利用流式細胞儀檢測循環癌細胞上的Her-2/neu，Hayes等表明為了獲取所需靈敏度這種富集是"必須"和"至關重要"的(見第1112頁最后一句和第1113頁第一句)。另外，Leone等(2003;JLeukocyteBiol74:593-601)表明在正常外周血單核細胞(PMBC)中Her-2/neu轉錄物和蛋白都以低水平表達。可以預期Leone等表明的這種Her-2/neu表達會使得在大量PBMC存在時難以看到循環癌細胞中的Her-2/neu表達。
發明內容本發明提供了一種檢測全血血樣中循環癌細胞上的Her-2/neu蛋白表達的方法，所述方法包括對所述血樣進行能檢測癌細胞相關Her-2/neu的免疫測試，其中陽性免疫測試結果表明在癌細胞上存在Her-2/neu;其中在進行免疫測試前未將循環癌細胞從全血中分離；且其中所述免疫測試a)能在SK-BR-3乳腺癌細胞以小于或等于100個SK-BR-3細胞/ml血液的濃度摻加(spike)入血液中時檢測來自所述SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-2/neu;和b)能夠在至少&106個人外周血單核細胞存在下進行測試時檢測來自10個SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-2/neu。本發明提供了一種檢測血樣中循環癌細胞上的Her-2/neu蛋白表達的方法，所述方法包括對所述血樣進行能夠檢測癌細胞相關Her-2/neu的免疫測試，其中陽性免疫測試結果表明在所述癌細胞上存在Her-2/neu;其中在進行所述免疫測試之前沒有將所述循環癌細胞從外周血單核細胞中分離；且其中所述免疫測試a)能夠在SK-BR-3乳腺癌細胞以小于或等于100個SK-BR-3細胞/ml血液的濃度摻加入血液中時檢測來自所述SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-2/neu;和b)能夠在至少口106個人外周血單核細胞存在下進行測試時檢測來自10個SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-之/neu。本發明基于無需將循環癌細胞分離以檢測這些細胞上的Her-2/neu蛋白表達的發現。就測試的容易性、測試的迅速性、最重要的是就通過減少對樣品的大量操作來防止癌細胞損失而言，無需首先將循環癌細胞分離是--個顯著優點。更少的步驟使本發明的方法進行起來更快和更廉價。此外，更少的步驟使所述方法更易于自動化。而且，本發明的改進測試通過消除分離步驟防止了癌細胞的損失，這種損失對檢測來自血樣中的循環癌細胞的Her-2/neu的靈敏度有顯著的不利影響。本發明提供了一種識別可能受益于采用靶向Her-2/neu的抗癌劑的治療的癌癥患者的方法，所述方法包括上述檢測方法。當用于識別這類患者時，從該患者抽取含癌細胞的血樣。本發明提供了一種治療如此識別出的癌癥患者的方法，該方法包括對患者施用靶向Her-2/neu的抗癌劑。圖1.SK-BR-3乳腺癌細胞(Her-2/neu過表達的陽性對照)與MDA-MB-468(Her-2/neu過表達的陰性對照)的裂解物中Her-2/neu的免疫測試檢測的ECL信號的比較。所示為使用l個細胞/孔、2個細胞/孔和10個細胞/孔的裂解物的數據。圖2.SK-BR-3乳腺癌細胞(Her-2/neu過表達的陽性對照)與MDA-MB-468(Her-2/neu過表達的陰性對照)的裂解物中Her-2/neu的免疫測試檢測的ECL信號的進一步比較。在該圖中使用來自如圖l所示的相同實驗的數據，不同之處在于在該圖中還包括從50個細鵬孔和250個細鵬孔的裂解材料獲得的數據以便顯示增加的X軸范圍。具體實施例方式此處所用的連接詞"包含"是開放式的。采用該詞語的權利要求除該權利要求中敘述的那些要素以外還可以包含其它要素。因而，例如，所述權利要求可以解讀為還包含沒有在其中具體敘述的其它步驟的方法，只要所敘述的要素或其等價物存在即可。術語"未分離癌細胞"或"未經分離的癌細胞"如此處使用，與帶有測試用抗原的癌細胞有關的術語"未分離癌細胞"或"未經分離的癌細胞"是指在至少100,000個非癌細胞/ml樣品、更優選為至少500,000個非癌細胞/ml樣品、更優選為至少1,000,000個非癌細胞/ml樣品且最優選為至少2,000，000個非癌細胞/ml樣品存在下可檢測抗原的癌細胞。例如，如果測試針對于發現于循環人癌細胞上的抗原，且如果循環人癌細胞處在500,000個人外周血單核細胞/ml測試樣品的存在下，則所述樣品中的循環人癌細胞是未經分離的癌細胞和未分離癌細胞。在本發明的一個實施方式中，免疫測試是基于溶液的免疫測試。基8于溶液的免疫測試如此處所用，術語"基于溶液的免疫測試"是指使用抵抗抗原的至少一種抗體的在溶液中的所述抗原的免疫測試。適合基于溶液的免疫測試的檢測技術包括電化學發光、化學發光、熒光化學發光、熒光偏振和時間分辨熒光。在本發明的另一個實施方式中，免疫測試是夾心免疫測試。如本文所用，術語"夾心免疫測試"是指使用各自均抵抗抗原或抗原的一部分的抗體對(例如，抗體'A'和抗體'B')來檢測所述抗原的測試。對于所述抗體對，將抗體'A'共價或非共價地標記至報道分子(例如，可電化學發光的分子或可發熒光的分子)。抗體'A'的非共價標記的實例是使抗抗體'A'的經標記的二抗與抗體'A'結合。抗體'B'與如測試板、磁體或電極等固體支持相直接連接(或使其間接連接)。適于夾心免疫測試的檢測技術包括電化學發光、化學發光和熒光化學發光。本發明提供了對血樣中循環乳腺癌細胞上的Her-2/neu蛋白水平進行定量的足夠靈敏的方法，還提供了用于識別可能受益于使用曲妥珠單抗、拉帕替尼或其它耙向Her-2/neu的藥劑的治療的患乳腺癌女性的方法。可以耙向Her-2/neu的其它藥劑正在開發中并且具有與本發明用的曲妥珠單抗或拉帕替尼相似的適用性。這些藥劑包括但不限于Genentech開發的OMNITARG(帕妥珠單抗)；Pfizer開發的CP-724,714和CP-654577(Minister等，2007，ClinCancerRes13:1238-1245;Barbacci等，2003，CancerRes63:4450-4459);Wyeth開發的HKI-272(Wong等，2006，JClinOncol24(6月20日增刊):3018;Rabindran等，2004，CancerRes2004,64:3958-3965);和Bristol-Myers-Squibb開發的BMS-599626。在Spector等，2007(BreastCancerRes9，從第205頁開始)和Janmaat與Giaccone，2003(TheOncologist8:576-586)中描述了在其特異性中包括Her-2/neu的其它抗癌劑。靶向Her-2/neu的額外的抗癌劑還包括靶向Her2的納米顆粒生物綴合物(見AlexisF等，2007;第4181號摘要，2007美國癌癥研究協會年會)和含化學治療劑的抗Her2免疫脂質體(見NobleCO等，2004，ExpertOpinTherTargets8:335-353》本發明采用的免疫測試具有足以檢測來自每毫升血液中摻加的至少100個SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-2/neu的靈敏度，優選具有足以檢測來自每毫升血液中摻加的至少30個SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-2/neu的靈敏度，更優選具有足以檢測來自每毫升血液中摻加的至少10個SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-2/neu的靈敏度，更優選具有足以檢測來自每毫升血液中摻加的至少3個SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-2/neu的靈敏度，且最優選具有足以檢測來自每毫升血液中摻加的至少1個SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-2/neu的靈敏度。本發明采用的免疫測試耐干擾，從而能在至少l，OOO，OOO個人外周血單核細胞存在下進行檢測時檢測10個SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-2/neu。在優選實施方式中，所述免疫測試產生與血樣中的癌細胞相關Her-2/neu分子數成比例的信號。從患有癌癥、尤其是乳腺癌的患者取得血樣(通常在約8ml20ml范圍內)。所包括的步驟詳細描述如下1.必要時將紅細胞和中性粒細胞耗竭。優選實施方式包括該步2.對來自循環癌細胞的Her-2/neu蛋白進行檢測和定量。1，必要時將紅細胞和中性粒細胞耗竭。優選方法采用帶抗凝劑(EDTA或擰檬酸鹽)的BDVacutainerCPT管。這些管含有經正確離心時(1，100xg，10分鐘，甩平轉子)能將紅血球和中性粒細胞除去的材料。離心后，管的底部含有紅細胞(紅血球)和中性粒細胞的細胞沉淀。在細胞沉淀上方是凝膠屏障(gelbarrier),而在凝膠屏障上方是作為血漿底部帶的單核的細胞(腫瘤細胞、淋巴細胞和單核細胞)。然后可以容易地從凝膠屏障上方的頂部收集腫瘤細胞、淋巴細胞和單核細胞。由于該方法不僅除去紅血球還除去中性粒細胞，因而優選該方法。2.對來自循環癌細胞的Her-2/neu蛋白進行檢測和定量。然后可以通過使用與檢測分子直接或間接相連的抗Her-2/neu的單克隆抗體(mAb)(如HERCEPTIN)或多克隆抗體(例如，來自R&DSystems的目錄號為AF1129的山羊多克隆抗體)來完成Her-2/neu的檢測。在電化學發光(ECL)的情形中，檢測分子是釕。在公共領域中有大量文獻詳細地10提供了用于在含三丙胺的溶液中將釕與抗體相連(例如，Lee等，AmJTropMedHyg2001，65:1-9)然后通過ECL檢測磁珠上的抗原的有用方法。施加電位使釕標記激發并發光并且用ECL檢測儀器(如ORIGEN分析儀或如來自BIOVERISCorporation,蓋瑟斯堡，美國馬里蘭州的M-Series384等商購儀器)進行檢測。本發明釆用的免疫測試由至少一個抗體且優選為兩組抗伴組成。這些抗體可以為抗Her-2/neu的多克隆抗體或單克隆抗體。單克隆抗體優選為人源化小鼠單克隆抗體，例如曲妥珠單抗。曲妥珠單抗是本發明的免疫測試和治療方法的優選實施方式。在本發明的另一個實施方式中，使用了抵抗靶向Her-2/neu的抗體之一的二抗。在本發明的優選實施方式中，將所述二抗共價或非共價地標記于報道分子(例如，可電化學發光的分子或可發熒光的分子)。在本發明的另一個優選實施方式中，使用ECL并將所述二抗生物素化從而使得所述二抗能與鏈霉親和素包被的磁珠連接。為了檢測Her-2/neu，可以從如R&DSystems(明尼阿波利斯，美國明尼蘇達州)、Biosource(卡馬里奧，美國加利福尼亞州)和BDBiosciences(圣地亞哥，美國加利福尼亞州)等來源商購各種抗Her-2/neii的單克隆抗體和多克隆抗體，其中包括抗胞外域和抗細胞質域的抗體。兔多克隆抗體也可獲自LABVISIONCorp(弗里蒙特，美國加利福尼亞州；如neuAb-21)和UPSTATECELLSIGNALINGSOLUTIONS(普萊西德湖，美國紐約州；如目錄號06-562)。抗Her-2/neu的胞外域的山羊多克隆抗體可獲自R&DSystems(目錄號AF1129)。抗全長重組Her-2/neu的山羊多克隆抗體可獲自EXALPHABIOLOGICS(羅斯代爾，美國馬里蘭州；目錄號M100P)。預計這種抗全長Her-2/neu的多克隆抗體能與Her-2/neu的胞外域和細胞質域結合而對胞外域不具特異性；這種抗體仍然有用但優選應將其與對Her-2/neu更具特異性的抗體組合使用。可利用的單克隆抗體同時抗胞外域(例如，R&DSystems目錄號MAB1129)和細胞質域(例如，LABVISIONneuAB-8)，包括抗C末端肽(例如，LABVISIONneuAB-15)。在Hudziak等(1997，美國專利第5，677，171號)中也公開了抗Her-2/neu的單克隆抗體。一個改良實施方式使用HERCEPTIN，這是因為與該抗體的結合最能預測作為對患者的治療的HERCEPTIN的結合。慮及更高的靈敏度，另一個有利的實施方式使用多克隆抗體或與Hei"-2/neu蛋白上的許多抗原表位結合的抗體混合物(cocktail)。在本發明的一個實施方式中，通過在樣品進行細胞裂解前使一種抗Her-2/neu的抗體與癌細胞結合而對完整無損的癌細胞進行免疫測試中的一步。用于與完整無損的癌細胞結合的這種抗體必須抗Her-2/neu的胞外域。作為另一種選擇，可以在基于溶液的免疫測試的所有步驟之前將癌細胞裂解并對細胞裂解物進行免疫測試。在這種情況下，免疫測試可以利用與Her-2/neu的胞外域或細胞質域選擇性結合的抗體。在本發明的更具體的實施方式中，免疫測試使用與Her-2/neu的細胞質域選擇性結合的一種或兩種抗體。在本發明的基于溶液的免疫測試的優選實施方式中，釆用抵抗抗原的抗體來將溶液中的抗原與如磁體、電極或測試板等固體支持物間接相連。基于溶液的免疫測試的實例是采用電化學發光(ECL)從而用抵抗抗原的兩種抗體來檢測所述抗原的實例，其中所述抗體之一由釕標記而另--個與能連接至電極的磁珠相連。除電化學發光以外，可以產生本應用所需的高靈敏度的其它基于溶液的免疫測試包括但不限于a)化學發光，如LiuY等，2003(JFoodProtection66:512-517)所述。b)熒光化學發光(FCL)，如YuH等，2000(BiosensBioelectron14:829-840)所述。c)熒光偏振免疫測試(見HowanitzJH，1988ArchPatholLabMed112:775-779)。d)時間分辨熒光免疫測試(ButcherH等，2003,JImmunolMethods272:247-256;Soukka等，2001，ClinChem47:1269-1278;HowanitzJH，1988ArchPatholLabMed112:775-779)。在本發明的夾心免疫測試的優選實施方式中，采用了其中一個抗體由釕標記而另一個抗體與能連接至電極的磁珠相連的電化學發光(ECL)。由于其靈敏度，可以將用于識別可能受益于采用靶向Her-2/neu的抗癌劑的治療的患者的本發明的方法有效地應用于這樣的患者取自所述患者的腫瘤活檢組織此前通過Her-2/neu用組織測試被確定為(例如，通過免疫組織化學或FISH分析)對Her-2/neu表達為陰性。參考下列實施例可以更好地理解本發明，所述實施例僅為說明性而不限制本文所述的發明。實施例實施例1患有轉移性乳腺癌的患者進入診室并直接抽取血樣(8mL40mL)至含有如檸檬酸鹽等抗凝劑的BDVacutainerCPT管內。將所述材料在1500RCF(相對離心力)1800RCF離心20分鐘。將凝膠屏障上方的細胞層除去并置于已含有如多克隆抗體或HERCEPTIN(曲妥珠單抗)等抗Her-2/neu抗體的另一個容器(例如，管)內。所述抗體已預先由釕標記。用釕標記抗體的常規方法描述于現有技術中，如Lee等，AmJTrapMedHyg2001,65:1-9。然后將樣品中的細胞裂解。裂解可以通過現有技術巾描述的許多細胞裂解劑實現，所述細胞裂解劑例如但不限于裂解緩沖液A[1%NP-40,20mMTris(pH8.0)，137mMNaCl，10%甘油，2mMEDTA，lmM原釩酸鈉，10ng/mL抑肽酶，10pg/mL亮肽素]。將經生物素化且抗Her-2/neu的二抗加入裂解物中。例如，該二抗是抗Her-2/neu的生物素化多克隆抗體，如來自R&DSystems的多克隆抗體(目錄號BAF1129)。接著將三丙胺溶液與鏈霉親和素包被的磁珠一同加入細胞裂解物中，所述磁珠將兩個抗體和所結合的抗原帶至電極附近。施加電流并用如商購ECL檢測裝置(BIOVERISCorporation)等ECL檢測裝置檢測電化學發光(ECL)。在這些儀器內，緊靠工作電極上方安置有光電倍增管(PMT)用于有效光俘獲。在工作電極下方，安置有磁體用于俘獲涂布有耙標抗原的珠體。信號與所發現的結合于循環腫瘤細胞表面上的Her-2/neu的量成比例。實施例2提供了與實施例1中所用的方法相同的方法，不同之處在于將兩個抗Her-2/Neu多克隆抗體用于檢測。實施例3方法與實施例1和2中所用的方法相同，不同之處在于在添加抗體對中的每一個之前將PBMC樣品裂解。實施例4方法與實施例1和3中所用的方法相同，不同之處在于直接使用全血血樣而非PBMC樣品。實施例5提供了與實施例14中所用的方法相同的方法，不同之處在于患者之前具有基于其原發腫瘤分析的Her2/neu陰性結果或沒有易于獲得的腫瘤組織用于分析。實施例6具有高于如實施例15中所示的對照樣品的Her-2/neu水平的患者被視為具有Her-2/neu陽性的腫瘤細胞，因而以包含如曲妥珠單抗等抗Her-2/neu的單克隆抗體的方案進行治療。優選治療由以卯分鐘輸注施用的4mg/kg的初始負荷劑量與以30分鐘輸注施用的2mg/kg的周維持劑量組成。實施例7具有高于如實施例15中所示的對照樣品的Her-2/neu水平的患者被視為具有Her-2/neu陽性的腫瘤細胞，因而以包含拉帕替尼的方案進行治療。采用拉帕替尼的給藥方案的實例是在重復的21天循環中與2000mg/mV日的卡培他濱組合(在第114天以相隔約12小時的兩劑口服施用)將該藥劑在第121天以1,2500mg每日一次口服給藥(5片250mg/片的片劑)。實施例8具有高于如實施例15中所示的對照樣品的Her-2/neu水平的患者被視為具有Her-2/neu陽性的腫瘤細胞，因而以包含CP-724,714的方案進行治療。采用CP-724，714的給藥方案的實例是將該藥劑每日兩次以250mg的口服劑量給藥。14實施例9具有高于如實施例15中所示的對照樣品的Her-2/neu水平的患考被視為具有Her-2/neu陽性的腫瘤細胞，因而以包含HKI-272的方案進行治療。采用HKI-272的給藥方案的實例是將該藥劑以240mg320mg的口服劑量在第1天給藥一次然后從第8天開始每日一次。實施例10在該實施例中，將純化的重組Her-2/neu(胞外域)用作檢測采用電化學發光的基于溶液的免疫測試的靈敏度的標準品。將該標準品稀釋于含1。/。牛血清白蛋白(BSA)的PBS中(磷酸鹽緩沖鹽水；pH=7.2)。配制測試緩沖液測試緩沖液l:PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)中的0.5。/。Tween-20和0.50/。牛血清白蛋白(BSA)Her-2/neu標準品(重組Her-2/neu胞外域)獲自OncogeneScience(產品號EL541)。生物素化和非生物素化形式的山羊抗人Her-2/neu多克隆抗體(闬錄號分別為BAF1129和AF1129)均獲自R&DSystems,Inc.(明尼阿波利斯，明尼蘇達州55413，美國)。用Lorence&Lu(PCTWO2006/041959A2)中指示的方法對多克隆抗體AF1129進行釕標記("TAG標記")。下面在本實施例和后續實施例中，將釕標記的多克隆抗體AF1129和生物素化的多克隆抗體BAF1129稱作"TAG-pAb"和"生物素-pAb")。電化學發光測試如下進行依次將稀釋于4個PBS測試緩沖液中的25pl/孔Her-2/neu標準品和50mJ/孔TAG-pAb與生物素-pAb的混合物[以下兩組濃度之--(A)50nl中各1ng/ml(在每孔250pl的最終測試體積中最終濃度為0.2Mg/ml);和(B)50pl中0.7ng/ml的生物素-pAb(在每孔250pl的最終測試體積中最終濃度為0.14pg/ml)，和50pl中1.2ng/ml的TAG-pAb(在每孔250^的最終測試體積中最終濃度為0.24pg/ml)]加入96孔U形底聚丙烯板的孔內并在室溫持續振蕩下溫育(例如，2小時)。在各孔內加入25pl中的10pg鏈霉親和素磁珠(例如，DynabeadsM-280Streptavidin，BioVeris，Corporation,蓋瑟斯堡，美國馬里蘭州)并在持續振蕩下溫育(例如，30分鐘)。在各孔內加入測試緩沖液1以使最終體積為每孔250^il。本測試中被分析物(重組Her-2/neu胞外域)的量從16pg/孔至160pg/孔至1600pg/孔變化。還包括不帶分析物的對照孔。對所有條件以至少一式兩孔進行測試。然后用M-Series384分析儀(BioVeris，Corporation,蓋瑟斯堡，美國馬里蘭州)對96孔板的電化學發光進行分析。結果顯示，在兩組所用條件下使用TAG-pAb和生物素-pAb以基于溶液的免疫分析能夠檢測到所有受測的重組Her-2/neu胞外域水平(16pg/孔、160pg/孔和1600pg/孔)，并且所述水平均高于基線(表1)。表1.通過采用釕標記的多克隆抗體(TAG-pAb)和生物素化的多克隆抗體(生物素-pAb)的免疫測試對重組Her-2/neu的電化學發光(ECL)檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>高于來自不帶抗原的對照孔的平均信號的平均ECL信g。實施例11方法與實施例10中所用的方法相同，不同之處在于:分析SK-BR-3乳腺癌細胞(Her-2/neu過表達的陽性對照細胞)的和MDA-MB-468乳腺癌細胞(對Her-2/neu過表達呈陰性)的細胞提取物。根據ATCC推薦條件使SK-BR-3和MDA-MB-468細胞(來自ATCC，馬納薩斯，美國弗吉尼亞州)生長于6孔組織培養板中，用PBS將其洗滌2次，并用血細胞計數器對等分試樣進行計數。用Pierce裂解緩沖液(如Lorence&Lu[PCTWO2006/041959A2]中所述)進行SK-BR-3細胞的裂解并獲得上清液。每孔中裂解上清液的量有所不同，為提取自1250個SK-BR-3或MDA-MB-468細胞的裂解上清液，并使用實驗10中所述的免疫測試釆用最終測試濃度為0.2ng/ml的TAG-pAb和0.2jug/ml的生物素-pAb對Her-2/neu進行分析。本實驗的結果如圖1和圖2所示。圖1通過圖表展示了數據組的較低端以便最佳地觀察該測試檢測來自低細胞數的Her-2/neu的能力。圖1僅包括最多達10細胞/孔的細胞范圍的數據。圖2通過圖表展示了整個數據組(多達250細胞/孔)。可以由本實驗中的SK-BR-3細胞的裂解物檢測Her-2/neu并且檢測到的Her-2/neu高于基線，所述裂解物包括本實驗中使用最低量的SK-BR-3裂解物的那些孔中的裂解物(每孔添加有1個細胞的孔中的裂解物；圖1)。而且，在Her-2/neu免疫測試中，SK-BR-3細胞(Her-2/neu過表達的陽性對照)的裂解物在從1個細胞/孔250個細胞/孔的整個受測范圍內均給出比MDA-MB-468細胞(對Her-2/neu過表達呈陰性)的裂解物高得多的信號，表明Her-2/neu檢測結果的高特異性(圖1和圖2)。實施例12在本實驗中，免疫測試方法與實施例10中所用的方法相同，不同之處在于人外周血單核細胞(PBMC)獲自商業來源(CellularTechnologyLtd.;克利夫蘭，美國俄亥俄州；產品號CTL-UP1)，并且以與實施例ll的乳腺癌細胞相同的方式制備裂解物。通過在各孔中添加下列物質來制備測試用樣品10個SK-BR-3細胞或對照PBS測試緩沖液(PBS，pH=7.2，含0.5%BSA和0.5%Tween20)的細胞裂解物。625,000個人PBMC或對照PBS測試緩沖液(PBS，pH=7.2，含0.5%BSA和0.5%Tween20)的細胞裂解物。在這些合并的裂解物中，添加下列物質在各孔內添加Tag-pAb和生物素-pAb(每種抗體的最終測試濃度為0.2pg/ml)，并將96孔板在室溫持續振蕩下溫育2小時。在各孔內添加25^中的10嗎鏈霉親和素磁珠(例如，DynabeadsM-280Streptavidin，目錄號110028，BioVeris，Corporation,蓋瑟斯堡，美國馬里蘭州)并在持續振蕩下溫育30分鐘。在各孔內添加PBS測試緩沖液(PBS，pH=7.2，含0.5%BSA和0.5°/。Tween20)以使最終體積為250pl/孔。然后如實施例10所述對96孔板進行電化學發光分析。本實驗的結果如表2所示。無法從625,000個人PBMC中檢測到Her-2/neu(表2)。相反，即使從所用的最小量的SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物(IO個SK-BR-3細胞的裂解物/孔;見表6)中也可以檢測到Her-2/neu。另外，添加625,000個人PBMC的細胞裂解物不干擾對乳腺癌細胞中Her-2/neu的檢測(表2)。表2.在存在或不存在人PBMC裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中Her-2/neu的ECL免疫測試檢測<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>'這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。"負ECL信號低于背景水平。實施例13在這兩個實驗中，如實施例10中使用Her-2/neu蛋白標準品和實施例11中使用SK-BR-3裂解物那樣進行免疫測試，不同之處在于使用人源化單克隆抗體曲妥珠單抗(Herceptin)代替生物素-pAb并且測試了下列四種ECL免疫測試條件之一條件l:將曲妥珠單抗用釕直接標記。使用如實施例10中指定的最終測試濃度為0.2pg/ml的生物素化多克隆抗體。條件2:將曲妥珠單抗用生物素直接標記。使用如實施例10中指定的最終測試濃度為0.2pg/ml的釕標記多克隆抗體。條件3和4:在這兩種條件中，沒有將曲妥珠單抗直接標記；而是使用二抗(生物素標記的抗人IgG)。。條件3:首先將曲妥珠單抗(當以250pl/孔進行ECL時最終濃度為0.2pg/ml)直接與細胞裂解物溫育50分鐘。在該步驟后添加生物素標記的抗人IgG(最終濃度0.2pg/ml;eBioscience，圣地亞哥，美國加利福尼亞州；目錄號13-4998，生物素標記的山羊抗人IgG抗體)和TAG-pAb(最終濃度0.2jig/ml)，然后將這些測試組分在室溫溫育1小時，接著添加鏈霉親和素珠(如此前在實施例10中所用)。。條件4:濃度與條件3相同，不同之處在于改變了試劑的添加順序。在條件4中，首先將曲妥珠單抗和釕標記的pAb(TAG-pAb)與細胞裂解物溫育50分鐘。在該步驟后添加生物素標記的抗人IgG，然后將這些測試組分在室溫溫育1小時，接著添加鏈霉親和素珠(如此前在實施例10中所用)。在使用曲妥珠單抗的第一個實驗中，在測試Her-2/neu陽性對照樣品時測試了條件1和2。在該實驗中，使用1600pg/孔的Her-2/neu時，條件1產生了遠遠高于背景的信號，并且比條件2更靈敏。表3A根據條件1和2(這兩種條件詳見實施例13的正文)使用標記的曲妥珠單抗對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物屮Her-2/neu標準品的ECL免疫測試檢測平均ECL信號(高于背景)Her曙2/neu(pg/孔)條件l條件21負，負*41421611116021負*16008114負ECL信號低于背景水平。在使用曲妥珠單抗的下一個實驗中，設計了條件3和4來改善相對于條件1和2的靈敏度，并將條件3和4用于測試SK-BR-3細胞裂解物的Her-2/neu。結果顯示在條件3和4下，在基于溶液的測試中可以將曲妥珠單抗與多克隆抗體共同使用以檢測至少1個SK-BR-3細胞/孔的裂解物的Her-2/neu(表3B)。條件4在檢測少量的SK-BR-3細胞時比條件3更靈敏。表3B.使用未標記的曲妥珠單抗、生物素標記的抗人IgG和TAG-pAb對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中Her-2/neu的ECL免疫測試檢測。測試了如實施例13的正文中限定的兩種不同免疫測試條件(條件3和4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>基于該實施例的結果，在使用曲妥珠單抗的4種測試條件中，使用抗曲妥珠單抗的二抗的條件3和4相對于將曲妥珠單抗直接標記且未使用二抗的條件1和2提供了有利結果。實施例14在本實驗中，使用TAG-pAb和生物素-pAb的免疫測試方法與實施例12中所用的方法相同，且使用曲妥珠單抗的免疫測試方法與實施例13的條件4相同。來fi6個額外供體的人外周血單核細胞(PBMC)獲自CellularTechnologyLtd.(克利夫蘭，美國俄亥俄州；產品號CTL-UP1)，且如實施例12那樣制備裂解物。在本實施例屮，在有或沒有SK-BR-3細胞的裂解物(以10細胞/孔進行測試)摻加入這些PBMC裂解物的條件下以500,000細胞/孔1,000,000細胞/孔測試PBMC的裂解物。對于單獨的PBMC供體，使用TAG-pAb和生物素-pAb的結果如表49所示，對于所有供體的平均值的結果如表10所示。如表49所示且如表10中所總結，在所有供體PBMC中獲得了非常一致的結果。即使高達l，OOO,OOO個PBMC的裂解物也給出了比僅10個SK-BR-3細胞的裂解物明顯更低的Her-2/neu信號。即使在高達l，OOO,OOO個PBMC的裂解物的存在下也能由10個SK-BR-3細胞的裂解物獲得高信號。這些結果表明人PBMC不會千擾本免疫測試從少量的過表達Her-2/neu的乳腺癌細胞中檢測Her-2/neu的能力。對于單獨的PBMC供體，使用曲妥珠單抗、生物素標記的抗人IgG和TAG-pAb的結果如表1116所7;，對于所有供體的平均值的結果如表17所示。iOT采用這些抗體的基于溶液的免疫測試獲得的結果與使用TAG標記的多克隆抗體和生物素標記的多克隆抗體時獲得的結果非常相似。在所有使用的供體PBMC中，結果再一次一致。與由僅10個SK-BR-3細胞的裂解物所獲得的高信號相反，來自各個供體的1,000，000個PMBC的裂解物都沒有給出高于基線的Her-2/neu信號。這些結果再次表明人PBMC不會干擾本方法從少量的過表達Her-2/neu的乳腺癌細胞中檢測Her-2/neu的能力。表4.在存在或不存在來自供體0706號的人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用生物素-pAb和Tag-pAb)_<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。表5.在存在或不存在來自供體0920號的人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用生物素-pAb和Tag-pAb)__<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。表6.在存在或不存在來自供體1026號的人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用生物素-pAb和Tag-pAb)_<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。表7.在存在或不存在來自供體0711號的人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用生平均ECL信號(高于背景)'SK-BR-3細胞的裂解物(SK-BR-3細胞/孔)不含PBMC的裂解物每孔含500,000個PBMC的裂解物每孔含1，000,000個PBMC的裂解物0016775107898051052'這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。表8.在存在或不存在來自供體0524號的人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用生物素-pAb和Tag-pAb)平均ECL信號(高于背景^SK-BR-3細胞的裂解物(SK-BR-3細胞/孔)不含PBMC的裂每孔含500,000個PBMC的裂解物每孔含1,000,000個PBMC的裂解物0021034010789683■'這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。表9.在存在或不存在來向供體0116G號的人PBMC的裂解物吋對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用生物素-pAb和Tag-pAb)平均ECL信號(高于背緊rSK-BR-3細胞的裂解物(SK-BR-3細胞/孔)不含PBMC的裂每孔含500,000個PBMC的裂解物每孔含1，000,000個PBMC的裂解物0012186107896181137'這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。表10.表49的數據的平均值在存在或不存在人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用生物素-pAb和Tag-pAb)。所示為所有供體PBMC的數據的平均值。平均ECL信號(高于背景rSK-BR-3細胞的裂解物(SK-BR-3細胞/孔)不含PBMC的裂解物每孔含500,000個PBMC的裂解物每孔含1,000,000個PBMC的裂解物00147150107896781035號。表11.在存在或不存在來自供體0706號的人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用曲妥珠單抗、生物素標記eKJ抗人IgG和Tag-pAb)平均ECL信號(髙于背景)'SK-BR-3細胞的裂解物(SK-BR-3細胞/孔)不含PBMC的裂解物每孔含l，OOO，OOO個PBMC的裂解物00負"10428314這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。負ECL信號略低于背景水平。表12.在存在或不存在來自供體0920號的人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用曲妥珠單抗、生物素標記的抗人IgG和Tag-pAb)_平均ECL信號(高于背景)'SK-BR-3細胞的裂解物(SK-BR-3細胞/孔)不含PBMC的裂每孔含500,000個PBMC的裂解物每孔含l,OOO，OOO個PBMC的裂解物00負"負**10428492269這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。負ECL信號略低于背景水平。表13.在存在或不存在來自供體1026號的人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用曲妥珠單抗、生物素標記的抗人IgG和Tag-pAb)_平均ECL信號(高于背景rSK-BR-3細胞的裂解物(SK-BR-3細胞/孔)不含PBMC的裂每孔含500,000個PBMC的裂解物每孔含l，OOO，OOO個PBMC的裂解物00負"負**10428452311這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。"負ECL信號略低于背景水平。表14.在存在或不存在來自供體0711號的人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用曲<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。負ECL信號略低于背景水平。表15.在存在或不存在來自供體0524號的人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用曲妥珠單抗、生物素標記的抗人IgG和Tag-pAb)_<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。負ECL信號略低于背景水平。表16.在存在或不存在來自供體0116G號的人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用曲妥珠單抗、生物素標記的抗人IgG和Tag-pAb)_<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。"負ECL信號略低于背景水平。表17.表1116的數據的平均值在存在或不存在人PBMC的裂解物時對SK-BR-3乳腺癌細胞裂解物中的Her-2/neu的ECL免疫測試檢測(使用曲妥珠單抗、生物素標記的抗人IgG和Tag-pAb)。所示為所有供體PBMC的數據的平均值。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>這些值的背景是僅來自測試緩沖液的信號。負ECL信號略低于背景水平。權利要求1.一種檢測全血血樣中的循環癌細胞上的Her-2/neu蛋白表達的方法，所述方法包括對所述血樣進行能夠檢測癌細胞相關Her-2/neu的免疫測試，其中陽性免疫測試結果表明在所述癌細胞上存在Her-2/neu；其中在進行所述免疫測試之前沒有將所述循環癌細胞從所述全血中分離；且其中所述免疫測試a)能夠在SK-BR-3乳腺癌細胞以小于或等于100個SK-BR-3細胞/ml血液的濃度摻加入血液中時檢測來自所述SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-2/neu；和b)能夠在至少1×106個人外周血單核細胞存在下進行測試時檢測來自10個SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-2/neu。2.—種檢測血樣中的循環癌細胞上的Her-2/neu蛋白表達的方法，所述方法包括對所述血樣進行能夠檢測癌細胞相關Her-2/neu的免疫測試，其中陽性免疫測試結果表明在所述癌細胞上存在Her-2/neu;其中在進行所述免疫測試之前沒有將所述循環癌細胞從外周血單核細胞中分離；且其中所述免疫測試a)能夠在SK-BR-3乳腺癌細胞以小于或等于100個SK-BR-3細胞/ml血液的濃度摻加入血液中時檢測來自所述SK-BR-3乳腺癌細胞的Her畫2/neu;和b)能夠在至少lxl(^個人外周血單核細胞存在下進行測試時檢測來自10個SK-BR-3乳腺癌細胞的Her-2/neu。3.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫測試是基于溶液的免疫測試。4.如權利要求3所述的方法，其中，所述免疫測試采用選自由電化學發光、化學發光、熒光化學發光、熒光偏振和時間分辨熒光組成的組的技術用于檢測。5.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫測試是夾心免疫測試。6.如權利要求5所述的方法，其中，所述免疫測試釆用選自由電化學發光、化學發光和熒光化學發光組成的組的技術用于檢測。7.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫測試產生與所述血樣中存在的癌細胞相關Her-2/neu分子數成比例的信號。8.如權利要求1或2所述的方法，其中，.所述免疫測試使用與Her-2/neu的細胞質域選擇性結合的一種或兩種抗體。9.如權利要求8所述的方法，其中，所述免疫測試使用與Her-2/neu的細胞質域選擇性結合的兩種抗體。10.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫測試使用抗Her-2/neu的多克隆抗體。11.如權利要求10所述的方法，其中，所述免疫測試使用抗所述多克隆抗體的二抗。12.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述免疫測試使用抗Her-2/neu的單克隆抗體。13.如權利要求12所述的方法，其中，所述免疫測試使用抗所述單克隆抗體的二抗。14.如權利要求12所述的方法，其中，所述單克隆抗體是人源化小鼠單克隆抗體。15.如權利要求14所述的方法，其中，所述單克隆抗體是曲妥珠單抗。16.—種識別可能受益于采用靶向Her-2/neu的抗癌劑的治療的癌癥患者的方法，所述方法包括權利要求1的方法，其中含癌細胞的所述血樣取自所述患者。17.如權利要求16所述的方法，其中，通過Her-2/neu的組織測試己預先確定來自所述患者的腫瘤活檢組織的Her-2/neu表達為陰性。18.如權利要求17所述的方法，其中，所述組織測試選自由免疫組織化學和熒光原位雜交分析組成的系列。19.一種治療可能受益于采用靶向Her-2/neu的抗癌劑的治療的癌癥患者的方法，所述方法包括對根據權利要求1618中任一項所述的方法識別出的患者施用所述靶向Her-2/neu的抗癌劑。20.如權利要求19所述的方法，其中，所述抗癌劑選自由曲妥珠單抗、拉帕替尼、CP-724，714、HKI-272和BMS-599626組成的系列。21.—種識別可能受益于采用靶向Her-2/neu的抗癌劑的治療的癌癥患者的方法，所述方法包括權利要求2的方法，其中，含癌細胞的所述血樣抽取自所述患者。22.如權利要求21所述的方法，其中，通過Her-2/neu的組織測試已預先確定來自所述患者的腫瘤活檢組織的Her-2/neu表達為陰性。23.如權利要求22所述的方法，其中，所述組織測試選自由免疫組織化學和熒光原位雜交分析組成的系列。24.—種治療可能受益于采用靶向Her-2/neu的抗癌劑的治療的癌癥患者的方法，所述方法包括對根據權利要求2123中任一項所述的方法識別出的患者施用所述靶向Her-2/neu的抗癌劑。25.如權利要求24所述的方法，其屮，所述抗癌劑選自由曲妥珠單抗、拉帕替尼、CP-724，714、HKI-272和BMS-599626組成的系列。全文摘要通過進行靈敏的Her-2/neu免疫測試檢測了在血液或外周血單核細胞(PBMC)樣品中的循環癌細胞上的Her-2/neu蛋白表達。在進行所述免疫測試前無需分離癌細胞。陽性結果表明Her-2/neu在所述血樣中的癌細胞上表達。該方法可以用于識別可能受益于采用如曲妥珠單抗(HERCEPTIN)、拉帕替尼、CP-724，714、HKI-272和BMS-599626等靶向Her-2/neu的抗癌劑的治療的癌癥患者。文檔編號G01N33/574GK101663584SQ200880012580公開日2010年3月3日申請日期2008年4月15日優先權日2007年4月19日發明者羅伯特·M·勞倫斯,明魯申請人:威爾斯達特生物制劑公司