專利名稱：自動多糖比色分析的制作方法
技術領域：
本發明涉及自動測定糖濃度的方法。
背景技術：
測量各種樣品中的糖含量是許多科學領域中的基本分析操作。眾所周知的測定糖濃度的比色法包括使用蒽酮(R.多雷伍德(Dreywood，R.)，工業與工程化學(Ind.EngChem.)，分析版(Anal.Ed.)18499，1946；E.E.莫斯(Morse，E.E.)，分析化學(Anal.Chem.)191012，1947；和D.L.莫里斯(Morris，D.L.)，科學(Science)107254，1948)、酚試劑(杜波斯(Dubois)等人，自然(Nature)168167，1951；杜波斯(Dubois)等人，分析化學(Anal.Chem.)28350-56，1956；以及布魯曼坎茲(Blumenkrantz)和埃斯波-漢森(Asboe-Hansen)，分析生物化學(Anal.Biochem.)54484，1973)、地衣酚(orcinol)(埃文(Irwin)和里韋爾(Leaver)，自然(Nature)1771126，1956)和間苯二酚(莫塞尼(Monsigny)等人，分析生物化學(Anal.Biochem.)175525-30，1988)進行的分析。蒽酮分析用于測量含有中性己糖的多糖的糖濃度，而酚試劑(例如，間羥基聯苯(mHDP)/3-苯基苯酚)則用于測量含有半乳糖醛酸或葡萄糖醛酸單糖的多糖的糖濃度。
用于糖濃度測定的各種比色分析內可變性的來源包括與操作人員進行樣品制備和測量有關的因素，諸如樣品處理、試劑稀釋、試劑的不穩定性、加熱和冷卻時間的變化等。取樣困難是應用許多所述分析時所固有的，這是因為通常需要從毫克/毫升濃度稀釋到微克/毫升濃度，以使樣品達到相對于標準品可定量的程度。盡管存在嚴格的方案，但取樣的困難(即，需要操作人員將濃溶液稀釋成極稀溶液)阻礙了這些分析發展成進行藥品調配和標示量(label claim)調配的準確可靠的分析。因此，仍需要開發出自動測定糖濃度的有效方法。
發明內容
本文提供一種自動測定糖濃度的方法。所述方法包括(1)制備一個或多個糖標準品，其包括以下步驟(a)將一部分糖工作儲備液(working stock solution)從糖工作儲備液源容器轉移到多個糖標準品接收容器中，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到所述多個糖標準品接收容器中，和(c)混合所述多個糖標準品接收容器的內容物，以制備所述一個或多個糖標準品；(2)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包括以下步驟(a)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉移到多個多糖試樣接收容器中，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到所述多個多糖試樣接收容器中，和(c)混合所述多個多糖試樣接收容器的內容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；(3)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到多孔板的一系列孔中；(4)將所述一個或多個糖標準品的一部分從所述多個糖標準品接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；(5)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；(6)將一部分酸試劑從酸試劑源容器轉移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；(7)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物；(8)用蓋子覆蓋所述多孔板；(9)加熱所述多孔板；(10)冷卻所述多孔板；(11)振蕩所述多孔板；和(12)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物的輻射能吸收，其中步驟1-12是在無人工介入的情況下執行。
在一個實施例中，在將所述多孔板冷卻后執行額外步驟，即將一部分顯色劑從顯色劑源容器轉移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中。
欲使用本發明的方法分析糖濃度的多糖試樣包括含有細菌莢膜多糖、活性細菌莢膜多糖或細菌莢膜多糖-蛋白質連結物的試樣。示范性細菌莢膜多糖包括來自腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis，Nm)血清群Y和W135；B群鏈球菌(Group B Streptococcus，GBS)血清型Ia和III；和肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的細菌莢膜多糖。
在另一個實施例中，所述方法包括(1)制備一個或多個糖標準品，其包括以下步驟(a)將一部分糖工作儲備液從糖工作儲備液源容器轉移到多個糖標準品接收容器中，所述糖工作儲備液包括一種或多種選自由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、丙酮酸、N-乙酰基-D-半乳糖胺和N-乙酰基-D-甘露糖胺組成的群組的糖，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到所述多個糖標準品接收容器中，和(c)混合所述多個糖標準品接收容器的內容物，以制備所述一個或多個糖標準品；(2)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包括以下步驟(a)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉移到多個多糖試樣接收容器中，所述多糖試樣包括選自由肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F組成的細菌群組的細菌莢膜多糖，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到所述多個多糖試樣接收容器中，和(c)混合所述多個多糖試樣接收容器的內容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；(3)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到多孔板的一系列孔中；(4)將所述一個或多個糖標準品的一部分從所述多個糖標準品接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；(5)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；(6)將一部分硫酸-蒽酮試劑從硫酸-蒽酮試劑源容器轉移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；(7)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物；(8)用蓋子覆蓋所述多孔板；(9)加熱所述多孔板；(10)冷卻所述多孔板；(11)振蕩所述多孔板；和(12)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物的輻射能吸收，其中步驟1-12是在無人工介入的情況下執行。
在另一個實施例中，所述方法包括(1)制備一個或多個糖標準品，其包括以下步驟(a)將一部分糖工作儲備液從糖工作儲備液源容器轉移到多個糖標準品接收容器中，所述糖工作儲備液包括半乳糖醛酸，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到所述多個糖標準品接收容器中，和(c)混合所述多個糖標準品接收容器的內容物，以制備所述一個或多個糖標準品；(2)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包括以下步驟(a)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉移到多個多糖試樣接收容器中，所述多糖試樣包括選自由肺炎鏈球菌血清型1和5組成的細菌群組的細菌莢膜多糖，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到所述多個多糖試樣接收容器中，和(c)混合所述多個多糖試樣接收容器的內容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；(3)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到多孔板的一系列孔中；(4)將所述一個或多個糖標準品的一部分從所述多個糖標準品接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；(5)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；(6)將一部分硫酸-四硼酸鹽試劑從硫酸-四硼酸鹽試劑源容器轉移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；(7)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物；(8)用蓋子覆蓋所述多孔板；(9)加熱所述多孔板；(10)冷卻所述多孔板；(11)將一部分包括間羥基聯苯的顯色劑從顯色劑源容器轉移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；(12)振蕩所述多孔板；和(13)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物的輻射能吸收，其中步驟1-13是在無人工介入的情況下執行。
由于排除了傳統糖濃度測定分析中與操作人員進行樣品制備和測量有關的因素(例如，樣品處理和溶劑稀釋)，故使用本發明的方法改進了糖濃度測定的準確性。
具體實施例方式 本發明提供一種針對自動測定糖濃度的方法。具體說來，所述方法包括(1)制備一個或多個糖標準品，其包括以下步驟(a)將一部分糖工作儲備液從糖工作儲備液源容器轉移到多個糖標準品接收容器中，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到所述多個糖標準品接收容器中，和(c)混合所述多個糖標準品接收容器的內容物，以制備所述一個或多個糖標準品；(2)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包括以下步驟(a)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉移到多個多糖試樣接收容器中，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到所述多個多糖試樣接收容器中，和(c)混合所述多個多糖試樣接收容器的內容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；(3)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到多孔板的一系列孔中；(4)將所述一個或多個糖標準品的一部分從所述多個糖標準品接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；(5)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；(6)將一部分酸試劑從酸試劑源容器轉移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；(7)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物；(8)用蓋子覆蓋所述多孔板；(9)加熱所述多孔板；(10)冷卻所述多孔板；(11)振蕩所述多孔板；和(12)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物的輻射能吸收，其中步驟1-12是在無人工介入的情況下執行。
“糖標準品”是指各標準品具有已知的糖濃度的一系列標準品。所述一系列標準品可包括例如濃度在2.5nM到100nM范圍內，諸如濃度為2.5nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM和100nM的糖。將理論標準品濃度(例如，nM)對所述一系列標準品中各標準品濃度的一組相同樣品的平均吸光度測量值作圖，并通過線性回歸分析計算斜率、y截距和相關系數(r)，產生標準曲線。
如本文所使用，術語“糖工作儲備液”包括具有糖組合物的溶液，所述糖組合物反映來自特定細菌的莢膜多糖的多糖重復單元的組成。示范性細菌包括腦膜炎奈瑟菌血清群Y(葡萄糖重復單元)、腦膜炎奈瑟菌血清群W135(半乳糖重復單元)、B群鏈球菌血清型Ia(葡萄糖/半乳糖重復單元)、B群鏈球菌血清型III(葡萄糖/半乳糖重復單元)、肺炎鏈球菌血清型1(半乳糖醛酸重復單元)、肺炎鏈球菌血清型3(葡萄糖重復單元)、肺炎鏈球菌血清型4(半乳糖/N-乙酰基-D-半乳糖胺/N-乙酰基-D-甘露糖胺/丙酮酸重復單元)、肺炎鏈球菌血清型5(半乳糖醛酸重復單元)、肺炎鏈球菌血清型6A(半乳糖/葡萄糖/鼠李糖重復單元)、肺炎鏈球菌血清型6B(半乳糖/葡萄糖/鼠李糖重復單元)、肺炎鏈球菌血清型7F(半乳糖/葡萄糖/鼠李糖重復單元)、肺炎鏈球菌血清型9V(葡萄糖/半乳糖/半乳糖醛酸重復單元)、肺炎鏈球菌血清型14(葡萄糖/半乳糖重復單元)、肺炎鏈球菌血清型18C(半乳糖/葡萄糖/鼠李糖重復單元)、肺炎鏈球菌血清型19A(葡萄糖/鼠李糖重復單元)、肺炎鏈球菌血清型19F(葡萄糖/鼠李糖重復單元)和肺炎鏈球菌血清型23F(半乳糖/鼠李糖/葡萄糖重復單元)。
“源容器”(如糖工作儲備液源容器、糖標準品接收容器、多糖試樣源容器和多糖試樣接收容器中所用)是指在儲存和操作期間可用于容納液體溶液的任何接受器(receptacle)。所屬領域中眾所周知此類容器，并且其包括(但不限于)玻璃試管、塑料試管、玻璃小瓶、塑料小瓶、塑料離心管和塑料微量離心管。
如本文所使用，“轉移”(如在轉移一部分糖工作儲備液、轉移一部分稀釋劑、轉移一部分多糖試樣、轉移所述一個或多個糖標準品的一部分、轉移所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分和轉移一部分酸試劑中所用)包括將液體從源容器運輸或移動到接收容器，或將液體從源容器/接收容器運輸或移動到多孔板的孔中。所屬領域技術人員眾所周知，可通過自動液體處理裝置實現液體的轉移。所述裝置一般使用一個或多個能同時轉移多個液體樣品的多通道移液歧管(multichannel pipette manifold)。
“稀釋劑”是指用于實現例如糖工作儲備液或多糖試樣的稀釋的試劑，以及用作“空白”(即，不含糖/多糖)以進行依賴于輻射能吸收測量值的糖濃度測定的試劑。本發明所用的稀釋劑例如包括注射用水(WFI)、生理鹽水(即，0.9％NaCl)和琥珀酸鹽緩沖的生理鹽水。“混合”是指在接收容器或多孔板的孔中將各種組分相混或摻合。所屬領域技術人員眾所周知，可通過多種方式，例如包括反復移液(諸如通過自動液體處理裝置執行)和振蕩(諸如通過板振蕩器執行)，來實現液體組分的混合。
如本文所使用，“多糖試樣”包括含有已知組成的多糖的樣品。試樣中多糖的組成須為已知的，因為是使用從利用由適當糖標準品得到的吸光度數據產生的線性回歸線獲得的方程，通過測定所存在的糖重復單元的量(例如，以納摩爾濃度為單位)，來得到糖濃度。用特定血清型多糖重復單元的分子量乘以由適當線性回歸線獲得的多糖重復單元的納摩爾濃度，將提供多糖試樣中所存在的多糖重復單元的納克數。
已知組成的多糖的實例包括諸如來自腦膜炎奈瑟菌血清群Y、腦膜炎奈瑟菌血清群W135、B群鏈球菌血清型Ia、B群鏈球菌血清型III、肺炎鏈球菌血清型1、肺炎鏈球菌血清型3、肺炎鏈球菌血清型4、肺炎鏈球菌血清型5、肺炎鏈球菌血清型6A、肺炎鏈球菌血清型6B、肺炎鏈球菌血清型7F、肺炎鏈球菌血清型9V、肺炎鏈球菌血清型14、肺炎鏈球菌血清型18C、肺炎鏈球菌血清型19A、肺炎鏈球菌血清型19F和肺炎鏈球菌血清型23F的細菌莢膜多糖。試樣中所含多糖可為未經修飾的、經活化的(即，經修飾以促進其連結)、經連結的(例如，與諸如CRM197等載體蛋白連結)或其任何組合。“稀釋過的多糖試樣”是指添加過稀釋劑的多糖試樣。
如本文所使用，“酸試劑”包括具有酸性pH值的試劑。在優選實施例中，酸試劑包括硫酸。在一些實施例中，除硫酸外，酸試劑還包括蒽酮。在其它實施例中，除硫酸外，酸試劑還包括四硼酸鹽。
“加熱所述多孔板”是指增加多孔板各孔中內容物的溫度。酸pH值(即，如由酸試劑提供)與熱的組合可將多糖分解成其組成單糖。對于本發明的方法，在高于環境溫度且至多100℃溫度的溫度下，諸如在75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、96℃、97℃、98℃和99℃下，加熱多孔板。在優選實施例中，在95±5℃下，將多孔板加熱10±2分鐘。所屬領域技術人員眾所周知，將多糖分解成其組成單糖所需的加熱的時間量尤其視加熱多糖的溫度而定；溫度越低，需要加熱的時間越長。所屬領域技術人員將有能力根據所用溫度調節加熱的時間。可通過所屬領域中眾所周知的任何方法，諸如將多孔板放入水浴中或放在加熱板上，來實現多孔板的加熱。
“冷卻所述多孔板”是指降低多孔板各孔中內容物的溫度。可通過所屬領域中眾所周知的任何方法，諸如將板從其熱源移開并使其在環境溫度下冷卻，來實現多孔板的冷卻。或者，可將板轉移到溫度(諸如4℃)低于環境溫度的環境(例如，冰箱或水浴)中。
如本文所使用，“振蕩所述多孔板”包括攪動多孔板以混合其孔中的內容物。在本發明的方法中，可使用諸如板振蕩器等所屬領域眾所周知的任何裝置，實現多孔板的振蕩。“測量所述多孔板中所有所述一系列孔的內容物的吸光度”是指使用分光光度計測量含有空白的一系列孔、含有糖標準品的一系列孔以及含有多糖試樣的一系列孔的吸光度。對于重復單元中含有諸如半乳糖、葡萄糖和鼠李糖等中性己糖的多糖(例如，肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；以及GBS血清型Ia和III)，使用硫酸-蒽酮試劑，并測定吸光度。在一些實施例中，在625nm下測定吸光度。對于重復單元中含有半乳糖醛酸或葡萄糖醛酸的多糖(例如，肺炎鏈球菌血清型1和5)，使用硫酸-四硼酸鹽試劑與mHDP，并測定吸光度。在一些實施例中，在520nm下測定吸光度。在本發明的方法中，通過包括空白、糖標準品和多糖試樣的多份相同樣品，諸如2、3、4、5、6份或更多份相同樣品，來增加準確性。隨后測定空白、糖標準品和多糖試樣的一組相同樣品的平均吸光度。
在某些實施例中，本發明的方法包括在冷卻多孔板后，將一部分顯色劑從顯色劑源容器轉移到多孔板中所有含有稀釋劑、一個或多個糖標準品和一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中。“顯色劑”是指包括在與糖反應后形成可檢測(例如，利用分光光度計)顏色的物質的組合物。示范性成色物質包括蒽酮、mHDP和咔唑。
以下實例是出于說明目的提供，并且不用作限制。
實驗 實例1測定糖含量的自動蒽酮分析 使用蒽酮分析，測定重復單元中含有諸如半乳糖、葡萄糖和鼠李糖等中性己糖的多糖(例如，肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；以及GBS血清型Ia和III)的糖含量。在硫酸和熱的作用下，將多糖分解成其組成單糖。蒽酮試劑與己糖反應，形成黃綠色復合物，利用分光光度計(例如，在625nm下)讀取其吸光度；在分析范圍內，吸光度與所存在的己糖的量成比例。
試劑制備 使用下式計算各血清型儲備液所需的糖重量，來制備50mM糖儲備液
分子量顯示于表I中。
表I-分子量 使用50mM糖儲備液，制備1.0mM(肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；以及GBS血清型Ia和III)和0.5mM(肺炎鏈球菌血清型18C)糖工作儲備液，以反映各血清型的多糖重復單元的組成(表II和III)。
表II-肺炎鏈球菌糖工作儲備液
表III-腦膜炎奈瑟菌/B群鏈球菌糖工作儲備液
通過將1.0g蒽酮與500ml硫酸混合，來制備酸試劑(0.2％蒽酮-硫酸)。
標準品制備 對于所有Nm、GBS和肺炎鏈球菌血清型(除18C外)，利用杰納斯(Janus)(珀金-埃爾默公司(Perkin-Elmer)，馬薩諸塞州沃爾瑟姆(Waltham，MA))自動液體處理系統，在數組每一濃度5個的微量離心管中，使用適于所分析血清型的1.0mM工作儲備液并將WFI作為稀釋劑，制備15nM、30nM、45nM和60nM糖標準品(1ml等分試樣)。對于肺炎鏈球菌血清型18C，使用0.5mM工作儲備液，制備7.5nM、15nM、22.5nM和30nM糖標準品(1ml等分試樣)。使用這些體積制得默認標準曲線(default standardcurve)。
樣品制備 利用杰納斯自動液體處理系統，在數組每一稀釋液5個的微量離心管中，制備使樣品(例如，肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；以及GBS血清型Ia和III)達到分析范圍所需的稀釋液。可使用以下計算來估算所有Nm、GBS和肺炎鏈球菌血清型(除18C外)的樣品量
如果未完全確定樣品的預期濃度，則選擇一定范圍的稀釋度(例如，1∶50、1∶75、1∶100、1∶150和1∶200)，以使至少一種落在分析范圍內。
程序 使用整合有萊伯威爾移動臂(labware movement arm)以及供讀取器整合、溫度控制和混合的輔助儀器的杰納斯自動液體處理系統，將一式五份100μl稀釋劑(例如，WFI)分配到多孔板5個孔中；稀釋劑用作空白。將一式五份100μl各適當標準品(例如，肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；或GBS血清型Ia和III)分配到多孔板5個孔中，同樣，將一式五份100μl各試樣分配到多孔板5個孔中。
將200μl酸試劑添加到各孔中，并利用反復移液，充分混合各孔的內容物。將多孔板覆蓋(手工或經由萊伯威爾移動臂)并在95±5℃加熱10±2分鐘，此后在環境溫度下冷卻≥10分鐘。通過萊伯威爾移動臂將多孔板放到讀板器上，輕柔振蕩并在625nm下測定各孔中內容物的輻射能吸收。
使用肺炎鏈球菌血清型6A糖標準品和試樣執行的自動操作的代表性實例顯示于表IV和表V中。
表IV-肺炎鏈球菌血清型6A 表V-肺炎鏈球菌血清型6A
使用9個不同的96孔板執行9個實驗；在各板上制備一式六份的標準品和樣品。對于實驗1-6，使用15nM、30nM和60nM標準品產生標準曲線。對于實驗7-9，使用8nM、15nM、23nM和30nM標準品產生標準曲線。顯示樣品濃度(mg/ml)。AVG.平均值；Stnd.Dev.標準差；RSD相對標準差。
實例2測定糖含量的自動糖醛酸分析 使用糖醛酸分析，測定重復單元中含有半乳糖醛酸或葡萄糖醛酸的多糖(例如，肺炎鏈球菌血清型1和5)的糖含量。在硫酸、四硼酸鈉和熱的作用下，將多糖分解成其組成單糖。添加mHDP引起紫紅色復合物的形成，并利用分光光度計(例如在520nm下)讀取吸光度；在分析范圍內，吸光度與所存在的糖醛酸的量成比例。
試劑制備 使用下式計算所需半乳糖醛酸的重量，來制備50mM半乳糖醛酸儲備液
使用50mM半乳糖醛酸儲備液，制備1.0mM半乳糖醛酸工作儲備液。
通過將2.38g十水合四硼酸鈉與500ml硫酸混合，來制備酸試劑(12.5mM四硼酸鈉-硫酸)。
標準品制備 利用杰納斯自動液體處理系統，在數組每一濃度5個的微量離心管中，使用1.0mM半乳糖醛酸工作儲備液并將WFI作為稀釋劑，制備2nM、4nM、8nM、12nM和16nM糖標準品(1ml等分試樣)。使用這些體積制得默認標準曲線。
樣品制備 利用杰納斯自動液體處理系統，在數組每一稀釋液5個的微量離心管中，制備使樣品(例如，肺炎鏈球菌血清型1和5)達到分析范圍所需的稀釋液。可使用以下計算來估算兩種肺炎鏈球菌血清型的樣品量
如果未完全確定樣品的預期濃度，則選擇一定范圍的稀釋度(例如，1∶50、1∶75、1∶100、1∶150和1∶200)，以使至少一種落在分析范圍內。
程序 使用整合有萊伯威爾移動臂以及供讀取器整合、溫度控制和混合的輔助儀器的杰納斯自動液體處理系統，將一式五份40μl稀釋劑(例如，WFI)分配到多孔板5個孔中；稀釋劑用作空白。將一式五份40μl各適當標準品(例如，肺炎鏈球菌血清型1和5)分配到多孔板5個孔中，同樣，將一式五份40μl各試樣分配到多孔板5個孔中。
將250μl酸試劑添加到各孔中，并利用反復移液，充分混合各孔的內容物。將多孔板覆蓋(手工或經由萊伯威爾移動臂)并在90℃加熱20分鐘，此后在環境溫度下冷卻≥20分鐘。將5μl 0.15％mHDP添加到各孔中，并利用反復移液，充分混合各孔的內容物。使多孔板的內容物在環境溫度下反應15-20分鐘，此后通過萊伯威爾移動臂將多孔板放到讀板器上，輕柔振蕩并在520nm下測定各孔內容物的輻射能吸收。
冠詞“一”在本文中用于指一個或多于一個(即，至少一個)所述冠詞的語法賓語。舉例說來，“一因素”意思指一個或多個因素。
本說明書中提及的所有公開案和專利申請案都指示本發明所屬領域技術人員的水平。所有公開案和專利申請案都以引用的方式并入本文中，引用的程度就如同指出將各個別公開案或專利申請案特定且個別地以引用的方式并入本文中一般。
盡管已借助說明以及出于理解清楚的目的而提供的實例相當詳細地描述了前述本發明，但顯然，可在隨附權利要求的范圍內實行某些修改和變更。
權利要求
1.一種自動測定糖濃度的方法，其包含以下步驟
a)制備一個或多個糖標準品，其包含以下步驟
(i)將一部分糖工作儲備液從糖工作儲備液源容器轉移到多個糖標準品接收容器中；
(ii)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到所述多個糖標準品接收容器中；和
(iii)混合所述多個糖標準品接收容器的內容物，以制備所述一個或多個糖標準品；
b)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包含以下步驟
(i)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉移到多個多糖試樣接收容器中；
(ii)將一部分所述稀釋劑從所述稀釋劑源容器轉移到所述多個多糖試樣接收容器中；和
(iii)混合所述多個多糖試樣接收容器的內容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；
c)將一部分所述稀釋劑從所述稀釋劑源容器轉移到多孔板的一系列孔中；
d)將所述一個或多個糖標準品的一部分從所述多個糖標準品接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；
e)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；
f)將一部分酸試劑從酸試劑源容器轉移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；
g)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物；
h)用蓋子覆蓋所述多孔板；
i)加熱所述多孔板；
j)冷卻所述多孔板；
k)振蕩所述多孔板；和
l)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物的輻射能吸收，
其中步驟a-1是在無人工介入的情況下執行。
2.根據權利要求1所述的方法，其進一步包含以下步驟在冷卻所述多孔板后，將一部分顯色劑從顯色劑源容器轉移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述顯色劑包含間羥基聯苯。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述糖工作儲備液包含一種或多種選自由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、丙酮酸、N-乙酰基-D-半乳糖胺和N-乙酰基-D-甘露糖胺組成的群組的糖。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述多糖試樣包含細菌莢膜多糖、活性細菌莢膜多糖或細菌莢膜多糖-蛋白質連結物中的一種或多種。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述細菌莢膜多糖包含選自由以下組成的細菌群組的細菌莢膜多糖腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)血清群Y、腦膜炎奈瑟菌血清群W135、B群鏈球菌(Group B Streptococcus)血清型Ia、B群鏈球菌血清型III、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)血清型1、肺炎鏈球菌血清型3、肺炎鏈球菌血清型4、肺炎鏈球菌血清型5、肺炎鏈球菌血清型6A、肺炎鏈球菌血清型6B、肺炎鏈球菌血清型7F、肺炎鏈球菌血清型9V、肺炎鏈球菌血清型14、肺炎鏈球菌血清型18C、肺炎鏈球菌血清型19A、肺炎鏈球菌血清型19F、肺炎鏈球菌血清型23F和其組合。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述酸試劑包含硫酸和蒽酮。
8.根據權利要求2所述的方法，其中所述酸試劑包含硫酸和四硼酸鹽。
9.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述糖工作儲備液源容器、所述糖標準品接收容器、所述多糖試樣源容器和所述多糖試樣接收容器都選自由玻璃試管、塑料試管、玻璃小瓶、塑料小瓶、塑料離心管、塑料微量離心管和其組合組成的群組。
10.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述稀釋劑選自由注射用水、生理鹽水、琥珀酸鹽緩沖的生理鹽水和其組合組成的群組。
11.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述稀釋劑為注射用水。
12.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述轉移是由自動液體處理裝置執行。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述自動液體處理裝置包含多通道移液歧管。
14.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述混合是通過反復移液來執行。
15.根據權利要求1或2所述的方法，其中加熱所述多孔板是通過板式加熱器執行。
16.一種自動測定糖濃度的方法，其包含以下步驟
a)制備一個或多個糖標準品，其包含以下步驟
(i)將一部分糖工作儲備液從糖工作儲備液源容器轉移到多個糖標準品接收容器中，所述糖工作儲備液包含一種或多種選自由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、丙酮酸、N-乙酰基-D-半乳糖胺和N-乙酰基-D-甘露糖胺組成的群組的糖；
(ii)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到所述多個糖標準品接收容器中；和
(iii)混合所述多個糖標準品接收容器的內容物，以制備所述一個或多個糖標準品；
b)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包含以下步驟
(i)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉移到多個多糖試樣接收容器中，所述多糖試樣包含選自由以下組成的細菌群組的細菌莢膜多糖肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；
(ii)將一部分所述稀釋劑從所述稀釋劑源容器轉移到所述多個多糖試樣接收容器中；和
(iii)混合所述多個多糖試樣接收容器的內容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；
c)將一部分所述稀釋劑從所述稀釋劑源容器轉移到多孔板的一系列孔中；
d)將所述一個或多個糖標準品的一部分從所述多個糖標準品接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；
e)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；
f)將一部分硫酸-蒽酮試劑從硫酸-蒽酮試劑源容器轉移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；
g)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物；
h)用蓋子覆蓋所述多孔板；
i)加熱所述多孔板；
j)冷卻所述多孔板；
k)振蕩所述多孔板；和
l)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物的輻射能吸收，
其中步驟a-1是在無人工介入的情況下執行。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述選自由肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F組成的細菌群組的細菌莢膜多糖為活性細菌莢膜多糖。
18.根據權利要求16所述的方法，其中所述選自由肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F組成的細菌群組的細菌莢膜多糖與載體蛋白連結。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述載體蛋白為CRM197。
20.一種自動測定糖濃度的方法，其包含以下步驟
a)制備一個或多個糖標準品，其包含以下步驟
(i)將一部分糖工作儲備液從糖工作儲備液源容器轉移到多個糖標準品接收容器中，所述糖工作儲備液包含半乳糖醛酸；
(ii)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉移到所述多個糖標準品接收容器中；和
(iii)混合所述多個糖標準品接收容器的內容物，以制備所述一個或多個糖標準品；
b)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包含以下步驟
(i)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉移到多個多糖試樣接收容器中，所述多糖試樣包含選自由肺炎鏈球菌血清型1和5組成的細菌群組的細菌莢膜多糖；
(ii)將一部分所述稀釋劑從所述稀釋劑源容器轉移到所述多個多糖試樣接收容器中；和
(iii)混合所述多個多糖試樣接收容器的內容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；
c)將一部分所述稀釋劑從所述稀釋劑源容器轉移到多孔板的一系列孔中；
d)將所述一個或多個糖標準品的一部分從所述多個糖標準品接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；
e)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉移到所述多孔板的一系列孔中；
f)將一部分硫酸-四硼酸鹽試劑從硫酸-四硼酸鹽試劑源容器轉移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；
g)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物；
h)用蓋子覆蓋所述多孔板；
i)加熱所述多孔板；
j)冷卻所述多孔板；
k)將一部分包含間羥基聯苯的顯色劑從顯色劑源容器轉移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；
l)振蕩所述多孔板；和
m)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內容物的輻射能吸收，
其中步驟a-m是在無人工介入的情況下執行。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述選自由肺炎鏈球菌血清型1和5組成的細菌群組的細菌莢膜多糖為活性細菌莢膜多糖。
22.根據權利要求20所述的方法，其中所述選自由肺炎鏈球菌血清型1和5組成的細菌群組的細菌莢膜多糖與載體蛋白連結。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述載體蛋白為CRM197。
全文摘要
本文提供一種自動測定糖濃度的方法。所述方法包括制備一個或多個糖標準品和一個或多個稀釋過的多糖試樣；將所述一個或多個糖標準品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分連同稀釋劑一起轉移到多孔板中的一系列孔中；將一部分酸試劑轉移到所述多孔板中的所述一系列孔中；混合所述多孔板中所述一系列孔的內容物；加熱并冷卻所述多孔板中所述一系列孔的內容物；振蕩所述多孔板；和測量所述多孔板中所述一系列孔的內容物的輻射能吸收，其中所有步驟都是在無人工介入的情況下執行。
文檔編號G01N35/02GK101657726SQ200880012342
公開日2010年2月24日 申請日期2008年3月13日 優先權日2007年3月14日
發明者文森特·圖魯拉, 肖內·沃爾特斯, 蘇迪漢姆·辛格, 拉薩帕·阿魯姆汗 申請人:惠氏公司