專利名稱：：通過膜聯蛋白a3對前列腺癌癥的自身免疫調節的制作方法
技術領域：
：本發明涉及診斷前列腺癌的方法，所述方法包括用特定試劑測定膜聯蛋白(annexin)A3(ANXA3)和/或針對ANXA3的自身抗體。本發明允許對良性、癌前和惡性病況加以區分。此外，所述方法具有預后相關性。
背景技術：
：在以前的區分性定量蛋白表達研究中顯示，ANXA3與前列腺癌癥顯著相關U)。但是，對于ANXA3在人前列腺中的作用和生物學卻所知甚少。目前顯示，ANXA3是所謂的外來體(多種上皮細胞釋放的小嚢泡)的一部分(2)，這些外來體在對先天免疫系統的調控中的作用也極少為人所知(3)，它們的抗腫瘤活性非常近來才被發現(4)。近來的報道顯示前列腺癌癥患者中有針對所謂前列腺小體(其是來自前列腺的外來體)的自身免疫性(5)。用于治療或診斷前列腺癌癥和泌尿生殖道的其它上皮癌癥的蛋白生物標記物被描述于US2005130876、W003086461、WO2005078124、EP05Oil042.8和EP05026092.6中。這些文獻的內容都通過引用并入本文。US60/812，089和US60/859，489公開了一種癌癥診斷方法，其中，用高度特異性的單克隆抗體針對膜聯蛋白A3的存在和/或含量來分析樣品。這些文獻的內容都通過引用并入本文。雖然ANXA3已知是前列腺癌癥的標記物，但仍需要改進的方法用于對良性、癌前和惡性病況加以區分性診斷。
發明內容本研究的目的之一是調查ANXA3在良性前列腺上皮、高度前列腺上皮內瘤(HGPIN)和前列腺癌癥的上皮組分中的表達和定位，以及理解前列腺轉化進程中的定位改變和區別。根據本發明，我們發現，良性前列腺組織中抗ANXA3染色強且在尖部(apical)，而在癌癥中其較弱并且處于更基底處。用超過1900個病例進行的組織陣列研究顯示，ANXA3表達在良性、癌前和惡性前列腺組織沖的不同模式具有預后相關性并且提供了機制性的理解。在進展期癌癥中，觀察到ANXA3在非上皮散布Unterspresed)細胞中的存在，其通過針對調控性T-細胞(Tregs)的復染色而局部化(colocalize)。此外，可在癌癥患者中檢測到針對ANXA3的自身抗體的存在。這些針對ANXA3的自身抗體可能是在癌癥細胞的氧化應激下被誘導出來的。這證明經由外來體的ANXA3釋放構成了一種保護性機制，在前列腺癌癥患者中，癌癥細胞通過誘導針對含ANXA3的前列腺小體的自身免疫試圖復原。因此，可通過ANXA3外來體和/或癌癥細胞來調節Tregs的信號化。此外，可通過ANXA3陽性T細胞來誘導/調控針對前列腺小體/外來體的自身免疫抗體。綜合考慮，強烈表明良性前列腺增生(BPH)期間ANXA3向前列腺細胞外區室中的釋放構成針對癌癥的防御機制，癌組織通過誘導針對ANXA3的自身免疫抗體以及通過涉及到調控性T-細胞(Tregs)的機制，最終使得這種釋放停止。不同的ANXA3染色模式也首次提供了在通過Gleason分數、pT-分期和PSA劃分的中等風險組中預測PSA無進展存活的可能性。在笫一個方面，本發明涉及診斷癌癥(優選地，前列腺癌癥)的下述方法，其中針對膜聯蛋白A3的細胞內分布來分析組織樣品。在另一方面，本發明涉及診斷癌癥(優選地，前列腺癌癥)的下述方法，其中，針對膜聯蛋白A3的細胞內分布和/或含量以及針對對膜聯蛋白A3的自身免疫應答，對樣品(例如組織樣品或體液樣品)加以分析，其中，優選通過針對膜聯蛋白A3的自身抗體的存在和/或通過調控性T-細胞的存在，來表征自身免疫應答。本發明的另一方面涉及診斷癌癥(優選地，前列腺癌癥)的下述方法，其中，針對針對膜聯蛋白A3的自身抗體的存在和/或含量以及分析。本發明的還一方面涉及對已被歸類為具有發展性前列腺癌癥中等風險的受試者進行程度劃分的方法，其中，針對膜聯蛋白A3的存在、定位和/或含量對來自所述受試者的樣品加以分析。本發明的還一方面是用于診斷癌癥(優選地，前列腺癌癥)的測試試劑，其包含(i)用于測定膜聯蛋白A3的試劑和(ii)用于測定針對膜聯蛋白A3的自身抗體的試劑和/或用于測定調控性T-細胞的試劑。本發明的還一方面是用于診斷前列腺癌癥的測試試劑，其包含用于測定針對膜聯蛋白A3的自身抗體的試劑。可根據本發明診斷的癌癥優選是泌尿生殖和/或胃腸道的癌癥，例如前列腺、膀胱、腎、尿道、卵巢、子宮或結腸的癌癥。特別地，癌癥是上皮癌。在一種尤其優選的實施方式中，癌癥是前列腺癌癥。在一種優選的實施方式中，本發明包括對疾病階段的區分性診斷和/或預后評價。例如，本發明允許對選自下述的疾病階段進行區分性診斷(i)良性病況，特別地，良性前列腺病況，例如，良性前列腺增生(BPH)、纖維化和慢性前列腺炎，(ii)癌前病況，例如，多種階段(PIN-l-3)的前列腺上皮內瘤，包括高度上皮內瘤(HGPIN)1，和/或(iii)惡性病況，例如，前列腺癌，特別是通過Gleason分數和pT-分期指示的處于進展期(progressed)狀態的進展期(advanced)前列腺癌。更優選地，本發明允許一方面在良性和癌前病況之間進行區分性診斷，另一方面對惡性病況進行區分性診斷。在本發明的一種優選的實施方式中，在樣品中測定ANXA3的存在、含量和/或分布，所述樣品可以是體液或組織樣品。更優選地，樣品是組織樣品，例如，來自前列腺組織的組織切片或活檢樣品。在另一實施方式中，可在樣品中測定ANXA3的細胞內分布/定位，其中所述樣品是組織樣品，優選是組織切片或活檢樣品，例如來自前列腺組織的。優選地，在上皮細胞中測定ANXA3的細胞內定位，特別是在前列腺上皮細胞中測定。應當注意，可在單種組織樣品或不同樣品(例如，來自同一受試者的體液樣品和組織樣品)上測定存在、含量和細胞內定位。樣品中高含量的ANXA3(例如，對應于組織樣品的強染色)基本上指示良性病況。中等/低含量的ANXA3(例如，對應于組織樣品的弱/中等染色)指示癌前病況或者早期/早-中期惡性病況。樣品中不存在ANXA3指示惡性病況，基本上是處于進展期狀態的惡性病況，例如，在中期或晚期。此外，樣品中不存在ANXA3指示前列腺癌證的侵略性亞組，特別是具有手術(根治性前列腺切除術)后進展的高風險。ANXA3的尖部細胞內定位，特別是ANXA3在尖部定位的嚢泡(例如外來體和前列腺小體)中的存在，基本上指示良性或癌前病況。ANXA3的擴散性細胞內定位，特別是組合不存在尖部定位的嚢泡的情況時，指示惡性病況。針對ANXA3的自身免疫應答的存在，例如，針對ANXA3的自身抗體的存在，和/或強ANXA3-陽性(但是是細胞內的，非尖部的)調控T-細胞的存在，基本上指示惡性病況，特別是處于進展期狀態的惡性病況。本發明包括對樣品中多肽或細胞的測定。優選地，這種測定包括免疫學方法，其中，使用免疫測試試劑來測定組分的存在、含量和/或定位。用于測定樣品中ANXA3的試劑優選是特異于ANXA3的抗體，例如，多克隆抗體或單克隆抗體。尤其優選的是高特異性單克隆抗體，如us60/812,089和US60/859,489(它們通過引用并入本文)所述。用于測定樣品中ANXA3自身抗體的試劑優選是ANXA3多肽或其包含可被自身抗體識別的表位的片段。更優選地，ANXA3多肽是重組ANXA3多肽。用于測定樣品中調控性T-細胞的試劑優選是針對調控性T-細胞7的標記物(例如，CD25或Foxp3或其它此類標記物)的抗體。本發明的方法可在適于免疫測定的任何測試形式中進行，包括適于自動設備的測試形式。在一些測試形式中，可優選使用帶有標記基團(例如可視標記物，例如，膠乳或金粒、焚光標記物基團、酶標記物基團等)的試劑。可根據標準方法來生產試劑和標記基團的綴合物，例如通過將試劑的反應活性氨基酸側基團(例如羧基、氨基和/或疏醇基)與標記基團共價偶聯，例如通過雙功能間隔(spacer)分子。優選地，從人類受試者獲得樣品。在一些實施方式中，所述方法是非侵入性的診斷流程，其中，樣品可以是尿樣，特別是exprimate尿樣或糞便樣品。如果需要的話，可對樣品進行預處理流程，例如凝膠過濾。在另一些實施方式中，所述方法可以是組織化學流程，其中樣品可以是組織樣品，特別是活檢樣品，例如，鉆取(punch)或穿刺(lance)活檢樣品或來自TUR-P(經尿道前列腺電切術)的樣品。在組織化學流程中，可通過測定ANXA3在樣品中的定位來對細胞內或細胞外的ANXA3進行選擇性測定。在一種優選的實施方式中，本發明包括對ANXA3的半定量或定量測定。這種半定量或定量測定可包括基于預先確定的分離點值(cut-offvalue)來評估測試結果以及將評估結果與疾病階段關聯起來。可通過根據已知方法，在來自健康人和/或具有預先確定的疾病階段的人的樣品中測定ANXA3來確定分離點值。此外，還可通過評估經染色的組織樣品以及將評估結果與疾病階段關聯起來，來測定ANXA3在樣品中的量。本發明還涉及對自身抗體針對ANXA3的自身免疫應答的測定和/或對調控性T-細胞存在的測定。這種測定可單獨進行或可與對ANXA3的測定組合進行。自身抗體的存在指示惡性病況，特別是處于進展期階段的惡性病況。對自身抗體的測定任選與對調控性T-細胞的測定相組合。調控性T-細胞的存在指示惡性病況，特別是處于進展期階段的惡性病況。可對樣品進行分級分離流程，這允許對細胞內和細胞外ANXA3進行分別的測定。例如，可對樣品加以離心，以獲得細胞沉淀團和上清液，其中，在細胞沉淀團中測定細胞內膜聯蛋白A3，在上清液中測定細胞外膜聯蛋白A3。在一種尤其優選的實施方式中，所述方法包括對細胞外ANXA3進行選擇性測定。在另一種尤其優選的實施方式中，所述方法包括對細胞內ANXA3進行選擇性測定。本發明的方法還可包括對其它癌癥標記物(例如，癌癥標記物)加以測定。對其它癌癥標記物的測定可以在其中測定ANXA3的相同樣品中進行，或者可在不同樣品中進行，例如，血、血清和/或血漿樣品。尤其優選的是對血、血清或血漿標記物的測定，特別是對激肽釋放酶(kallikrein)蛋白酶家族中至少一種成員(例如前列腺特異性抗原(PSA))和/或至少一種上皮細胞標記物(特別是前列腺特異性膜抗原(PSMA))的測定。本發明可以是下述篩選流程，其中，針對癌癥，特別是前列腺癌癥，對個體或個體的組加以測試。另一方面，所述方法還可包含預后評估或治療后續測試，其中，對已經診斷為癌癥(特別是前列腺癌癥或其之前階段)陽性的個體進行預后評估和/或治療控制監測。在一種尤其優選的實施方式中，本發明涉及對疾病進展的預后評估，這在任何診斷評價(特別是針對治療控制)中都是有用的工具。預后評估可基于僅對ANXA3的測定或者基于與其它標記物(例如PSA)的組合。例如，通過組織學評估和/或通過測量PSA或其它癌癥標記物的水平，可將患者分為低風險組(例如PSA水平<10ng/ffll)、中等風險組(例如PSA水平>10但<20ng/ml)和高風險組(例如PSA水平>20ng/ml)。在這些組中測定ANXA3可產生更多的有用信息，特別是在被分類為中等風險組的患者中。如果這些中等風險患者是ANXA3陽性的，那么無PSA存活的百分比將顯著高于被測定為ANXA3陰性的患者。因此。本發明允許對個體患者組進行進一步的風險劃分。優選地，可基于ANXA3測定結果對本來被分類為中等風險組的患者重新分類。ANXA3陽性的患者可被重新分類進低風險阻，而ANXA3陰性(以及任選地，具有針對ANXA3的自身免疫應答)的患者被分進高風險組。進一步地，通過下述附圖和實施例更詳細地解釋本發明。附圖描述圖1顯示了良性前列腺增生樣品(1A)、來自具有中等Gleason分數的前列腺癌癥組織的樣品(1B)和具有ANXA3陽性散布細胞的進展期癌癥組織切片(1C)中ANXA3染色強度和定位的區別。這種類型的細胞還對CD3(—般性的T-細胞標記物)染色陽性(1D);以及對CD25陽性(針對調控性T-細胞(Tregs)的特異性標記物)(1E)以及對Foxp3(另一種針對Tregs的特異性標記物)陽性(1F)。圖2顯示了ANX染色結果(陰性、弱、中等、強)的總結，這取決于分別的病況(良性病況、癌前病況PIN和惡性病況)，即，；f艮據Gleason(GS)分數分類的癌癥在良性上皮中發現了最高的染色強度。(a)染色強度在PIN和具有增加的去分化的癌中減少。(b)尖部ANXA3染色與增加的癌癥嚴重性負相關。兩種參數與前列腺轉化的多個階段的關聯性是高度顯著的(p值<0.001)。ANXA3:膜聯蛋白A3;PIN1:前列腺上皮內瘤。圖3顯示了不同患者組中ANXA3染色與無PSA存活時間的關系。(a)關于染色模式(尖部對比擴散)，對ANXA3陽性腫瘤的亞分析，使得可以分類為預后相關的亞組(b)根據風險組分類，無PSA進展存活的概率(c)通過ANXA3狀態(陽性對陰性)進行亞劃分，使得可將代表最大群體的中等風險組(n=969)分入高風險和低風險亞組(p=0.0001)。AMA3:膜聯蛋白A3;PSA:前列腺特異性抗原。圖4顯示了無PSA存活時間與ANXA3狀態之間的關系。陰性AMA3染色狀態與無PSA存活顯著相關。根據(b)Gleason級別、(c)pT分期和(d)外科手術前PSA(以ng/inl計)的無PSA存活概率。ANXA3:膜聯蛋白A3;PSA:前列腺特異性抗原。圖5顯示了自身抗體在來自前列腺癌癥患者中的存在。實施例I.材料和方法1.1抗體下述抗體用于本研究克隆tgc7ProVII5C5(DSMACC2780)，單克隆，2.4mg/ml;針對靼標蛋白ANXA3。1.2組織分析了含有>3000份組織樣品的已有的前列腺癌癥TMA。在結果部分提供了對組成的詳細描述。1.3免疫組織化學(IHC)開發了適于在經福爾馬林固定的組織中進行膜聯蛋白A3檢測的IHC方案。詳細方案在下文中給出。ANXA3免疫染色(IHC)方案載片制備參對TMAs在二甲苯中脫蠟至少1小時，GFS2x5分鐘二曱苯。*在遞減的乙醇系列直到蒸餾水中進行再水化*在PBS緩沖液中漂洗5分鐘預處理(表位恢復)參在乙酸pH2中對載片進行5分鐘高壓滅菌*在PBS緩沖液中漂洗5分鐘過氧化物酶封閉*在1%仏02/甲醇中孵育10分鐘參在PBS緩沖液中潤洗2x5分鐘。抗體孵育參在pbs中以1:8100(0.3jjg/ml)稀釋一抗(anxa3)*用100-200m1經稀釋的抗體覆蓋組織/tma切片*在潮濕腔中于30。C孵育2小時參在TRIS-PBS緩沖液(1:10)中漂洗2x5分鐘在30°C應用經HRP綴合的二抗(EnVisionDAK0K4003，抗兔)30分鐘*在TRIS-PBS緩沖液中漂洗2x5分鐘發色團*用DAB-發色團(LiquidDABDAKOCodeNo.:K3467)在室溫下覆蓋載片10分鐘*在PBS緩沖液中徹底清洗栽片參用蘇木精(HarrisHematoxylinHTX31000，MediteGmbH)復染色1minsec攀用水漂洗參在水遞減的乙醇系列中，在HCl-乙醇藍中區分5分鐘攀覆蓋二甲笨。1.4IHC計分一位病理學家對所有染色加以評估。版本a)，對于每份組織樣品和抗體而言，通過目測以四級計分(O、1、2、3)來估計膜染色強度。除此之外，以4級計分來估計染色陽性的腫瘤細胞的比例(<20%、>=20<40%、>=40-<90°/。、>90%)。從這兩個參數建立最終的IHC分數。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>對于某些統計分析而言，可將癌癥分為陰性組(陰性)或陽性組(弱、中等、強)1.5數據文件描述本研究中產生的所有數據都被概括于數據文件中，其中主題描述3cr下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>1.6統計學用齊平方檢驗來計算不同腫瘤亞組中ANXA3表達差異的概率。用Kaplan-Meier繪圖進行計算，以展現AMA1表達對患者診斷的影響。進行Cox回歸分析來進行多元分析。2.結果基于對含有1679份來自根治性前列腺切除術的標本的癌癥核心的組織微陣列的分析，來自用針對ANXA3的特異性抗體進行的免疫細胞化學的代表性圖像(圖l)顯示了良性前列腺增生(1A)、具有中等Gleason分數的前列腺癌癥組織(1B)和進展期癌癥(1C)的典型標本中ANXA3染色強度和定位的差異。此外，分析了135個良性和125個瘤前(高度PIN)傷口的組。通常，ANXA3染色主要是胞質性的，其顯示了有胞質和膜結合/嚢泡模式的細胞內差異。在良性腺體上皮中，看到顯著的細胞和核ANXA3染色。此外，在細胞頂點集中的小胞質嚢泡中發現了染色，這導致了尖部著重的胞質染色模式。在細胞頂點，頻繁觀察到ANXA3陽性嚢泡的形成，這對應于進入腺體小管的泌離分離過程。良性分泌細胞和HGPIN傷口被均勻陽性染色，主要是尖部著重的胞質染色。但是，在HGPIN中，染色強度顯著減少(p<.0001)。在癌癥中，染色強度進一步顯著減少(包括27%的陰性染色，p〈.00t)1)，并且觀察到明顯從尖部著重的胞質染色模式轉變為擴散胞質染色(p<.0001)。圖2中提供了對這些結果的概括。陰性ANXA3染色與pT-分期和Gleason分數相關(p〈.0001)，但與PSA無關(p=0.29)。Kaplan-Meier分析揭示了顯著降低的無PSA進展存活(P<.0001;對數秩檢驗)，在多元分析中，陰性ANXA3染色顯示是獨立的預后預測因素(HR1.20,p-.002)。表1和2中提供了細節。通過抗體染色對進展期癌癥中散布的單細胞的進一步分析顯示，這些細胞主要是T-細胞(1D)，更具體地，調控性T-細胞(Tregs)，因為它們表達CD25(1E)和Foxp3(1F)(6)。Tregs近來已被報導稱作用于腫瘤特異性的耐受性(7)。關于對ANXA3陽性癌癥的分析，針對Gleason分數有相關性(p-0.04)，但是，與預期相反，高級別的癌癥顯示最大比例的強染色癌癥(35.6%),而弱染色的癌癥在低級別和高級別的癌癥中幾乎相等14(35.6對36.3%)。染色強度還與PSA水平相關(p=0.0029)。ANXA3強染色的癌癥在PSA>20ng/ml的類別中最常見(41.1%)，而ANXA3弱染色在低于20ng/ml的PSA類別中最常見。對于局部進展期的癌癥而言，有染色強度降低的趨勢，但是這并沒有達到統計顯著性的要求(p-O.0630)。在1317名患者中可觀察到PSA后續。生物化學上的復發被定義為在兩次連續測量中PSA>-0.1ng/ml。354名患者發展出了PSA復發。所有后續上的中位數為33個月，而無復發患者的后續中位數為39個月。進行ANXA3-—元分析，我們顯示，較之ANXA3陽性腫瘤而言，ANXA3染色陰性與顯著降低的無PSA存活時間相關(p<0.0001)。在關于染色模式方面對ANXA3陽性腫瘤的亞分析能進一步將該組患者分入兩個預后相關亞組。較之尖部染色而言，在具有擴散上皮染色的ANXA3陽性腫瘤中，預后顯著更糟(對數秩檢驗p-O.0013，圖3A)。除了組合使用良好建立的經典預后參數PSA、Gleason級別和pT-分期之外，為進一步研究ANXA3狀態是否有預后相關性，我們將我們的群體分入3個風險組。根據PSA1級別和分期，患者被分類為進展低風險、中等風險和高風險。在進展低風險的那些人群中，外科手術前PSA為10ng/ml或更低，前列腺切除術標本的Gleason分數為6或更小，癌癥為器官局限性的。在進展高風險的人群中，外科手術前PSA超過20ng/ml，前列腺切除術的Gleason分數為7或更高，腫瘤分期為>pT3。不處于低風險或高風險的那些被分入中等風險組。如圖3B所示，風險類別顯示了進展的顯著不同風險(p".0001)。通過ANXA3狀態(陽性對陰性)進行的化學能將中等風險組(代表了最大的群體(n-922))分為高風險和低風險亞組(P-0.0001)。在低風險或高風險組中不能定義亞組(表3)。對中等風險的Kaplan-Meier分析還顯示ANA3陰性患者的PSAPFS顯著降低(圖3C)。較之ANXA3陽性胂瘤而言，ANXA3染色陰性與顯著降低的無PSA存活時間相關(p<0.0001，圖4A)。然而，針對染色分數(弱對中等對強)對ANXA3陽性癌癥的劃分沒能顯示預后相關亞組(對數秩檢驗，p-0.642，數據未示出)。除ANXA3染色(陰性對陽性)之外，一元分析還顯示了針對已經建立的預后因子(Gleason分數、pT分期和外科手術前的PSA血清水平)的預后顯著性(p<0.0001，圖4B-D)。我們繼續測試了癌癥患者中抗ANXA3自身免疫性的可能性，這通過在夾心ELISA中針對針對重組ANXA3的免疫反應活性篩選患者血清來進行。對照包括ANXA5、MCV1Ana,有及沒有磷酸絲氨酸包覆。事實上，我們在一些前列腺癌癥患者中發現了非常高且特異性的抗ANXA3效價。如圖4所示，這些患者之一的多克隆血清對重組ANXA3，來自前列腺癌癥細胞系(PC3細胞)的天然ANXA3染色(較之用相應的單克隆抗ANXA3抗體染色而言)。從該患者的全血分離B細胞，使用我們的特異性單克隆抗體，重組ANXA3和PC3細胞提取物作為陽性對照，我們能分離和培養相應的生產抗ANXA3抗體的B-細胞克隆，并由此繼續分離和培養人單克隆抗ANXA3抗體。圖5顯示了相應的Western印跡雜交。3.討論ANXA3在從良性到惡性前列腺上皮轉變期間的定位和細胞內分布的持續改變及其預后顯著性表明了ANXA3在前列腺組織生物學中的重要地位。分泌的ANXA3在前列腺的細胞外區室中的存在(符合報導的蛋白在外來體/前列腺小體中的存在(2)和提出的這些嚢泡的抗癌癥作用(4))讓我們測試了ANXA3是否可被前列腺癌癥患者的PC3細胞提取物或尿中的抗體所獲取。FACS分析確實顯示，ANXA3是潛在的抗原性表面蛋白(數據未示出)。篩選來自癌癥和BPH患者的血清(來自大規模的臨床研究，以評價ANXA3的診斷價值)，我們在一小組癌癥患者中發現了自身抗體，并分離出了產生抗ANXA3抗體的B細胞的相應克隆。在目前針對早期前列腺癌癥檢測的標準生物標記物(PSA)的缺陷的背景上(8、9)，考慮到使用活檢或完全前列腺切除術后的標本進行風險評估的困難決定性(10、11)，ANXA3提供了綜合診斷蛋白生物標記的潛力。ANXA3的關鍵特征之一是細胞內和細胞外分布和定位使得不僅能在體液中進行穩定的、非侵入性的檢測以用于前列腺癌癥的早期檢測，并且還可反映DM/RM分析物(基本上僅可檢測總ANXA3的替代物)所無法反映出的腫瘤生物學的重要方面。我們的結果與BPH1的前列腺上皮分泌的ANXA3(可能在外來體/前列腺小體中)的抗癌和保護性作用一致，ANXA3在BPH經過PIN到Gleason分數更高的前列腺癌癥的前列腺轉化期間逐漸丟失。外來體ANXA3的降低是由于調控性T-細胞在進展期癌癥中誘發的自身免疫機制(針對細胞外前列腺小體的表面抗體)導致的。中等風險組的大群患者首次得以被進一步分類，未來繼續基于ANXA3的前列腺癌癥進展預測是人們很有興趣的。鑒于ANXA3在前列腺癌癥中的這種分子背景(7)，又暗示了其在向癌性階段的前列腺轉化的免疫調控中的作用，以及ANXA3在膜轉運(membranetrafficking)、淋巴細胞移動、細胞運動和信號轉導中的作用(12)，其在外來體(2)和前列腺小體(3)中的存在是特別有興趣的。前列腺小體被認為能調控先天的免疫系統(14,15)，并且近來還與前列腺癌癥的不同階段相關聯(l5，16)。將組織和尿AMA3關聯起來還可進一步協助理解癌癥相關的ANXA3定位和釋放的動力學。有這種可能性本文所述的對作為針對前列腺癌癥標記物的ANXA3進行的研究具有更普遍的牽連，因為有兩篇非常近來的報道發現ANXA3是針對卵巢透明細胞腺癌(17)和結直腸癌(18、19)的負相關標記物，類似于我們的研究。因此，ANXA3釋放針對上皮腺癌起到普遍性的癌癥相關作用這一假設值得更多的注意力。ANXA3染色陰性在前列腺癌癥中作為獨立預后因子代表了我們的研究得最為重要的發現。AMA3染色陰性揭示了在根治性前列腺切除術后進展高風險的前列腺癌癥的生物攻擊性亞組。總之，ANXA3代表了有前途的候選組織標記物，當與標準預后參數組合時，其能在個體患者中提供更為精確的預后預測，因此有助于未來患者管理。表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表2:AMA3染色與pT-分期、Gleason分數(GS)和PSA的關聯<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3:根據ANXA3的狀態，風險劃分，將患者分為進展低風險、中等風險和高風險，示出了生物化學復發速率參考文獻1-W.Woznyetal.，Proteomics.7,313(2007).2.T.Pisitkun，R.F.Shen，M.A.Knepper，ProcNatlAcadSciUSA101，13368(2004).3.S.Keller,M.P.Sanderson,A.Stoeck，P.Altevogt，Immunol.Lett.107，102(2006).4，Y.Yangetal.，JCancerRes.Clin.Oncol.(2007).5.M.Schostak，A.Schrattenholz，submitted(2007).6.A.Larssonetal，Urol.Oncol.24，195(2006).7.M.Miyara,S.Sakaguchi，TrendsMol.Med.(2007).8.G.Zhou，H.I.Levitsky，JImmunol.178，2155(2007).9.A.W.Roddametal.，Eur.Urol.48，386(2005).10.A.Stameyetal.，JUrol.172，1297(2004).11.M.Aminetal.，Scand.JUrol.Nephrol.Suppl20(2005).12.J.I.Epsteinetal.，Scand.JUrol.Nephrol.SupplZA(2005).13.V.Gerke，C.E.Creutz，S.E.Moss,Nat.Rev.Mol.CellBiol.6，449(2005).14.F.G.Kravetsetal.，Prostate43，169(2000).15.J.Radons,G.Multhoff,Exerc.Immunol.Rev.11，17(2005).16.N.E.Schartz,N.Chaput，F.Andre,L.Zitvogel,Curr.Opin.Mol.Ther.4,372(2002).17.A.J.Abusamraetal，BloodCellsMol.Dis.35，169(2005).18.A.Moritaetal，Proteomics.(2006).19.P.Alfonsoetal，Proteomics.5，2602(2005).20.J.Madoz-Gurpideetal.，Mol.CellProteomics.5，1471(2006).權利要求1.診斷癌癥的方法，其中，針對膜聯蛋白A3的細胞內分布對樣品加以分析。2.權利要求1的方法，其中所述癌癥是泌尿生殖和/或胃腸道的癌癥。3.權利要求1或2的方法，其中所述癌癥是上皮癌癥。4.權利要求1-3中任意一項的方法，其中所述癌癥是前列腺癌。5.權利要求1-4中任意一項的方法，其中所述試劑是抗體。6.權利要求1-5中任意一項的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。7.權利要求1-6中任意一項的方法，其是組織化學流程。8.權利要求7的方法，其中所述樣品是組織樣品，特別是活檢樣時09.權利要求1-8中任意一項的方法，其中在上皮細胞，特別是在前列腺上皮細胞中測定所述膜聯蛋白A3的細胞內分布。10.權利要求1-9中任意一項的方法，其包括對選自下述的疾病階段進行區分性診斷(i)良性病況，(ii)癌前病況，和(iii)惡性病況。11.權利要求1-10中任意一項的方法，其中還測定至少一種另外的標記物。12.權利要求ll的方法，其中所述另外的標記物是前列腺特異性抗原(PSA)和/或前列腺特異性膜抗原(PSMA)。13.權利要求1-12中任意一項的方法，其中測定其它針對膜聯蛋白A3的自身抗體。14.診斷癌癥特別是前列腺癌癥的方法，其中，針對膜聯蛋白A3的存在、含量和/或細胞內分布以及針對針對膜聯蛋白A3的自身免疫應答，對樣品，例如組織或體液樣品，加以分析，其中，優選地，通過針對膜聯蛋白A3和/或前列腺小體/外來體的自身抗體的存在或通過ANXA3陽性調控性T-細胞的存在來表征所述自身免疫應答。15.診斷癌癥特別是前列腺癌癥的方法，其中，針對針對膜聯蛋白A3的抗體的存在和/或含量以及任選地針對調控性T-細胞的存在和/或含量來分析樣品。16.權利要求1-15中任意一項的方法，其中，膜聯蛋白A3的不存在指示前列腺癌的攻擊性亞組，特別是手術后進展高風險的亞組。17.對已被分類為前列腺癌癥發展中等風險的受試者進行劃分的方法，其中，針對膜聯蛋白A3的存在和/或含量來分析來自所述受試者的樣品。18.診斷癌癥的測試試劑，其中包含(i)測定膜聯蛋白A3的試劑，以及(ii)測定針對膜聯蛋白A3的自身抗體的試劑和/或測定調控性T-細胞的試劑。19.權利要求18的試劑，用于診斷前列腺癌癥。20.用于診斷前列腺癌癥的測試試劑，其中包含用于測定針對膜聯蛋白A3的自身抗體的試劑。全文摘要本發明涉及診斷前列腺癌的方法，所述方法包括用特定試劑測定膜聯蛋白A3(ANXA3)和/或針對ANXA3的自身抗體。本發明允許對良性、癌前和惡性病況加以區分。此外，所述方法具有預后相關性。文檔編號G01N33/574GK101669032SQ200880011783公開日2010年3月10日申請日期2008年4月9日優先權日2007年4月12日發明者A·施拉滕赫爾茲申請人:普羅迪奧塞斯股份公司