確定聚谷氨酸-紫杉烷結合物中結合的紫杉烷的量的方法

專利名稱：確定聚谷氨酸-紫杉烷結合物中結合的紫杉烷的量的方法
確定聚谷氨酸-紫杉烷結合物中結合的紫杉烷的量的方法
背景技術：
紫杉醇(以商品名Taxo^注射劑可獲得)是化療藥紫杉烷的原型，其與P-微管蛋白結合，促進將該蛋白組裝i^微管并且穩定它們，最終引起細胞死亡。聚谷氨酸紫杉醇(paclitaxel poliglumex)(PPX ，化學名被(2，R，3，S)-3，-苯甲酰基酰氨基-l，-[4，10j3-雙(乙酰氧基)-2a-(苯甲酰基氧基)-l，7P-二羥基-9-氧代-5，20-環氧紫杉-ll-烯-13a-基氧基]-l，-氧代-3，-苯基丙-2，-醇部^y-酯化的N-(L-焦谷氨酰基)-[聚(L-谷氨酰基)-L-谷氨酸)，下文稱為PPX,是a-聚-L-谷氨酸(PGA)和紫杉醇的酯結合物，其中后者與PGA通過2，-羥基位共價結合。
近來，研究PPX用于非小細胞肺癌(NSCLC)和卵巢癌。攝入后在腫瘤組織中紫杉醇釋放并且將結合物蛋白水解/水解降解。
PPX的分子式和分子量是分布的，因為a-聚-L-谷氨酸的聚合度和與紫杉醇的結合位點數目根據制備方法而不同。PPX的平均分子量為約40,000道爾頓，其是通過非水凝膠滲透色譜法確定的，該色譜法通過多角激光散射進行檢測。在結合物中，約35。/。重量的紫杉醇以結合形式存在，總計每11個單體單元約i個紫杉醇酯鍵。合成PPX的方法在PCT公布W097/33552中公開。
在對PPX進行的制備試驗中，作為活性成分和最終的藥物產物，結合的紫杉醇和相關的基于紫杉烷的雜質的定量分析是有規定的。但是后一個試驗不能對PPX本身進行并且脫酯作用需要釋放紫杉醇。TetrahedronLetters, (1995)， 36(12)， 2001-2004/>開了應用堿性過氧化1^/四氯吹喃混合物水裂解紫杉醇的多種酯的方法，其中過乙酰化的紫杉醇的2，-乙酸酯比10-乙酰基位水解得更快。當這個方法應用于紫杉醇時，報道的產物是10-脫乙酰基紫杉醇(10-DAT)。最初用于PPX中結合的紫杉醇和相關的紫杉烷雜質的定量的已知方法包括用碳酸氫鈉/過氧化鈉將PPX徹底水解，在CHC13中將紫杉醇和相關的紫杉烷雜質一起萃取并且通過HPLC定量。加 入CHC13作為第二相使水解后釋放的紫杉烷立即萃取，防止了大部分 10-DAT形成。但是，水解反應引起紫杉醇的顯著降解，通常降解為10-脫乙酰基-紫杉醇(10-DAT)并且20%水平的10-DAT通常應用該方法，作 為^目體系不完全抑制IO位的水解。因此，紫杉醇和10-DAT的峰在一起 定量并且報道為紫杉醇+10-DAT。為了能夠將水解方法獲得的紫杉醇 十10-DAT的量校正為僅總的紫杉醇，需要進行應用NMR定量的第二種方 法以將天然結合的10-DAT定量。因此，降解產物的形成和結合的紫杉烷 分布的改變是該方法的顯著缺點。另外，對于降解的化合物，色語條件不 是特異的。
因此，需要用于將PGA-結合的紫杉醇和其它PGA-結合的紫杉烷定量 的改善的方法。 發明詳述
因此，本發明涉及確定PGA-紫杉烷結合物中的結合的紫杉烷的量的 方法，該方法包括在非水介質中將結合物水解，應用肼f汴生物代替氫過氧 陰離子(hydroperoxy anion)。
更詳細地說明，本發明的方法包括將PGA-紫杉烷結合物與式(I)化合 物反應
(I)
其中
!^和R2獨立地選自d-Cnr烷基、C廣d()-羥基烷基、C3-d。鏈烯基、 Qrd。-羥基鏈烯基、C3-do-炔基、C3-d(r羥基炔基、芳基、雜芳基；或者 W和I^與它們連接的氮原子一起形成3-8元雜環，該雜環任選包含至多3 個選自O、 S和N的雜原子并且任選凈皮至多2個羥1^代；
得到未結合的紫杉烷和PGA-酰肼，
然后確定未結合的紫杉烷。
對于本發明的目的，PGA-紫杉烷結合物是a-聚-L-谷氨酸(PGA)，其中 谷氨酸重復單元的一個或多個Y-氯基通過紫杉烷的2，-羥基與紫杉烷分子發生酯化。典型的是，PGA包含60至310個單體單元并且分子量的范圍 為8,000至40,000道爾頓。PGA-酰肼是由將紫杉烷的2，-羥基與PGA-紫杉 烷結合物中的PGA的谷氨酸重復單元的y-g連接的酯基與式(I)的肼反 應而產生的酰肼。在PGA-酰肼中，式(I)化合物的伯氨基的氮與PGA的谷 氨酸重復單元的Y-氯基的羰基結合。
本文所用的紫杉烷指的是紫杉醇、多西他賽或其它可以從天然來源例 如紫杉或者從細胞培養中分離出來的紫杉烷，或者化學合成的紫杉烷例如 10-脫乙酰基紫杉醇、7-表紫杉醇、三尖杉寧堿(cephalomannine)、 7-表-三 尖杉寧堿和N-脫苯甲酰基-N-苯基乙酰基紫杉醇。最優選的紫杉烷是紫杉 醇。
本文所用的術語"Crdo-烷基"指的是包含1至約10個碳原子的直 鏈或支鏈飽和的烴基，例如甲基、乙基、丙基(例如正丙基和異丙基)、丁 基(例如正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如正戊基、異戊基、 新戊基)等。
本文所用的術語"d-d。-羥基烷基"指的是d-do-烷基，其可以被至 多3個羥基取代。
本文所用的術語"C3-C。-鏈烯基"指的是包含3至約10個碳原子并 且具有一個或多個雙碳-碳鍵的烷基。鏈烯基的實例包括乙烯基、丙烯基、 丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。
本文所用的術語"C3-d(r羥基鏈烯基"指的是可以在碳原子上被至多 3個羥基取代的C3-do-鏈烯基，所述的碳原子不包括碳-碳雙鍵的碳原子。
本文所用的"C3-d()-炔基"指的是包含3至約10個碳原子并且具有 一個或多個三碳-碳鍵的烷基。炔基的實例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、 戊炔基等。
本文所用的術語"C3-do-羥基炔基"指的是可以在碳原子上被至多3
個羥基取代的C3-do-炔基，所述的碳原子不包括碳-碳三鍵的碳原子。
本文所用的術語"d-C3-烷基"指的是包含1至3個碳原子的直鏈或
支鏈飽和的烴基。
本文所用的術語"d-C3-卣烷基"指的是被至多3個卣原子(即F、 Cl、
6Br、 I)取代的d-C3-烷基。
本文所用的術語"d-C3-烷氧基"指的是0-d-C3-烷基，例如甲g、 乙氡基、正丙氧基和異丙氧基。
本文所用的術語"d-C3-硫代烷氧基"指的是S-d-C3-烷基，即甲基 硫代、乙基J危代、正丙基J克代和異丙基J危代。
本文所用的"芳基"指的是芳族碳環基，包括單環或多環芳族烴，例 如苯基、萘基、蒽基、菲基、1,2-二氬化茚基、茚基等，其可以任選被以下 基團取代鹵素、C廣C3畫烷基、C廣CV鹵烷基、C廣Qr烷氧基、d畫CV硫代 烷氧基或硝基。
本文所用的"雜芳基"是芳族雜碳環基并且包括單環和多環芳族烴， 所述的芳族烴包含至少一個雜原子環成員例如石危、氧或氮，并且其可以任: 選被以下基團取代鹵素、Q-C3烷基、C廣C3-鹵烷基、C廣CV烷氧基、C!-C3-硫代烷氧基或硝基。雜芳基包括吡咬基、嘧咬基、吡噪基、喊,基、三嗪 基、呋喃基、會啉基、異會啉基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、吲哚基、吡 咯基、噁喳基、苯并呋喃基、苯并蓉吩基、苯并瘞唑基、異喁喳基、吡唑 基、三哇基、四唑基、吲哇基、1，2，4-蓉二哇基、異噻峻基、苯并塞哈基、 嘌呤基、^"唑基、苯并咪哇基等。
可以有利地用于進行本發明的式(I)化合物的實例包括N，N-二甲基肼、 苯基肼、4-溴苯基肼、4-異丙基苯基肼、4-甲氧基苯基肼、l-曱基-l-苯基肼、 1-氨基吡咯烷、l-氨基-2，6-二甲基哌啶、l-氨基-順式-2，6-二甲基哌啶、 (S)-(-)-l-氨基-2-(甲氧基甲基)吡咯烷、(R)-(+)-l-氨基-2-(甲氧基甲基)吡咯 烷、4-氨基嗎啉、l-絲哌咬、l-絲-4-曱基p底溱、l-脈-4-(2-羥基乙基) 哌溱、l-l^-高哌咬。優選的試劑是N,N-二甲基肼、苯基肼、4-氨基嗎啉 和1-M哌咬，最優選的是4-氨基嗎啉。
PGA-紫杉烷結合物與(I)的反應在質子惰性有機溶劑例如二甲基甲酰 胺、二曱亞砜、N-甲基吡咯烷酮等中進行。根據本發明優選的實施方案， 將PPX或包含PPX的藥物的樣品溶于或懸浮于二甲基甲酰胺或二甲亞砜 中以提供PPX的濃度為25至52 mg/mL之間，然后加入4-氨基嗎啉或4-氨基嗎啉的三氟乙酸溶液。PPX溶液和4-氨基嗎啉/三氟乙酸的比例是1:0.3v/v至1:0.5 v/v之間。將混合物在室溫約20C至約42"C之間下攪拌約2小 時至約24小時的時間。
未結合的紫杉烷的確定可以通過HPLC進行或者通過任何其它本領域 已知的用于定量分析紫杉烷的方法進行。
根據本發明優選的實施方案，將PPX或包含PPX的藥物的樣品溶于 二甲亞砜中以提供PPX的濃度為48至52 ng/mL之間并且加入4-氨基嗎 啉的三氟乙酸溶液，其中三氟乙酸與4-氨基嗎啉的比例為0.017:1 v/v。 PPX 溶液與4-氨基嗎啉/三氟乙酸的比例為1:0.5 v/v。將混合物攪拌并且監控溫 度和反應時間直至約2%-7%結合的紫杉烷釋放。優選的是，溫度保持在范 圍為約38-42X:并JL^應時間的范圍為約1.9至約2.1小時。在這些范圍內， 純度分布作為轉化的函數不改變。加入乙腈后，將溶液通過離心超濾以除 去未反應的聚合物，然后直接進樣至HPLC柱以確定紫杉醇和每種紫杉烷 雜質的面積百分數。將USP中報道或計算的UV響應因子應用于將已知雜 質的％面積轉化為相對于紫杉醇的w/w%;其它未知雜質的量代替計算為 %面積。紫杉醇的純度是通it^ 100%減去所有雜質的總和計算的。
本發明方法溫和的反應條件使紫杉醇降解從約20%降低至小于0.5% 并且使10-DAT的定量高于0.2。/。，因此，無需NMR定量。
現在，本發明通過以下實施例更詳細地說明。
實施例
為了說明本發明方法的準確度和靈敏度，在紫杉醇中添加已知量 (10。/。w/w)的三種化學上不同的紫杉烷，然后與37%w/w量的a-聚-(L)-谷氨 酸結合。三種紫杉烷中的兩種是合成的雜質(三尖杉寧堿和7-表-三尖杉寧 堿)，第三種是降解雜質(7-表紫杉醇)。在定量限和上特異限(upper specification limit)之間，對于每種紫杉烷，研究三種不同添加水平(1.2%、 9.8%、 28%w/w)。所有三種雜質回收量為100%至115%之間，其被認為 對于本發明的目的用途是可接受的。該試驗的代表性實例在實施例1中給 出。PPX批次的常規釋放分析在實施例2中報告。
實施例1
紫杉醇/7-表紫杉醇結合物的溶液是通過在10 mL燒瓶中精確稱量350± 5 mg結合物并且將其溶于二甲亞砜中制備的。用相同溶劑將溶液稀釋至 一定體積。在5mL燒瓶中精確稱量250士2.5mgPPX(藥用級)。在相同燒 瓶中加入0.085 mL添加溶液(相應于添加水平為1.2Vow/w)并且用二甲亞砜 稀釋至一定體積。然后根據實施例2中給出的通用方法進行氨解反應并且 通過HPLC分析。7-表紫杉醇的回收率為110.7%。 實施例2
將精確稱量的250 mg PPX(活性藥物成分)轉移至5 mL燒瓶中。用二 甲亞砜溶解后，用相同溶劑將樣品稀釋至一定體積。將1.0mL該溶液轉移 至5 mL圃錐形底小瓶中。將三角形磁力攪拌棒置于每個小瓶中并JU^入 0.5 mL包含比例為0.017:1(0.034 mL TFA加入至2.0 mL 4-氨基嗎啉中)的 三氟乙酸和4-氨基嗎啉的溶液。將小瓶緊密加蓋，置于40C:h2X:的恒溫攪 拌水浴上并且攪拌2士0.1小時。反應結束時，歷經約10分鐘，將小M慢 冷卻至室溫，然后加入0.75 mL乙腈。混合后，將樣品轉移至離心過濾器(分 子量截斷(cut-off)二10，000道爾頓)并且在3000xg下離心1小時。將1 mL 樣品轉移至HPLC小瓶中，加入10 |LiL冰醋酸并且通過HPLC分^f斤，確定 紫杉烷含量，該分析應用Zorbax 300SB-C8柱，4.6x100 mm 3.5 pm, Agilent Cat. No. 861973-卯6，保持在40"C下并且用7JC/乙腈梯度混合物從20%乙腈 /80%7片至卯％乙腈/10%7&在60分鐘內洗脫，在227 nm處進行UV檢測。
結果(六次重復的平均值，并且表示為用相關響應因子校正的面積％)
在表l中報告。 表l,
紫杉烷 用RRF校正的面積％
漿果赤霉素III: 低于纟艮告水平
10-DAT: 0.24%
三尖杉寧堿 0.22%
OR1: 低于報告水平
OR2+OR3: 0.39%
7-表-10-脫乙酰基紫杉醇 低于報告水平
紫杉醇 98.80%7-表-紫杉醇 0.16% 未知(RRT 1.13): 低于報告水平 未知(RRT 1.28): 低于報告水平 以OR" OR2和OR3表示的雜質是a-聚-(L)-谷氨酸與具有下式的紫杉 烷的結合物
o
ORl: Rl = OAc, R2 = OH, R3 = OBz OR2: Rl = OH, R2 = OAc, R3 = OBz OR3: Rl = OBz, R2 = OAc, R3 = OH
式
權利要求
1.確定聚谷氨酸-紫杉烷結合物中結合的紫杉烷的量的方法，其中一種或多種紫杉烷分子通過2’-羥基位與α-聚-L-谷氨酸的γ-羧基連接，所述的方法包括以下步驟a)將聚谷氨酸-紫杉烷結合物與式(I)化合物反應R1R2N-NH2(I)其中R1和R2獨立地是C1-C10-烷基、C1-C10-羥基烷基、C3-C10鏈烯基、C3-C10-羥基烷基、C3-C10-炔基、C3-C10-羥基炔基、芳基、雜芳基；或者R1和R2與它們連接的氮原子一起形成3-8元雜環，該雜環任選包含至多3個選自O、S和N的雜原子并且任選被至多2個羥基取代；得到未結合的紫杉烷和聚谷氨酸酰肼；以及b)確定未結合的紫杉烷的量。
2. 權利要求1的方法，其中未結合的紫杉烷的量是通過HPLC確定的。
3. 權利要求1或2的方法，其中紫杉烷選自紫杉醇、多西他賽、10-脫乙酖基紫杉醇、7-表紫杉醇、三尖杉寧堿、7-表-三尖杉寧堿和N-脫苯甲 酰基-N-苯基乙酰基紫杉醇。
4. 權利要求1至3中任意一項的方法，其中紫杉烷是紫杉醇。
5. 權利要求1至4中任意一項的方法，其中式(I)化合物選自N，N-二曱 基肼、苯基肼、4-溴苯基肼、4-異丙基苯基肼、4-曱緣苯基肼、l-曱基-l-苯基肼、1-氨基吡咯烷、l-氨基-2，6-二曱基哌啶、l-氨基-順式-2，6-二甲基 哌咬、(S)+)-l-絲-2-(甲氧基曱基)吡咯烷、(R)-(+)-l-絲-2-(甲氧基甲基) 吡咯烷、4-氨基嗎啉、l-M哌啶、l-氨基-4-甲基哌噪、l-KJ^4-(2-羥基 乙基)哌溱和l-M-高哌啶。
6. 權利要求1至5中任意一項的方法，其中式(I)化合物選自N,N-二曱 基肼、苯基肼、4-氨基嗎啉和l-氨基哌啶。
7. 權利要求1至6中任意一項的方法，其中式(I)化合物是4-氨基嗎啉。
8. 權利要求7的方法，其中步驟a)在二甲基曱酰胺或二甲亞砜中在溫 度范圍為20至42'C下進行。
9. 權利要求8的方法，其中步驟a)在二曱亞砜中在溫度為38至42'C 下進行。
全文摘要
本發明涉及確定PGA-紫杉烷結合物中結合的紫杉烷、特別是紫杉醇的量的方法，所述的方法包括a)將PGA-紫杉烷結合物與式(I)化合物反應R¹R²N-NH₂(I)，其中R¹和R²如說明書中定義；得到未結合的紫杉烷和PGA酰肼，以及b)確定未結合的紫杉烷的量。
文檔編號G01N33/50GK101641598SQ200880007196
公開日2010年2月3日 申請日期2008年3月5日 優先權日2007年3月6日
發明者H·斯普尼莫爾, K·霍夫達, L·西維耶羅, M·麥克肯農, S·法齊奧尼, V·利維 申請人:細胞治療學公司