Lspr的酶測定的制作方法

專利名稱：Lspr的酶測定的制作方法
LSPR的酶測定
相關申請的交叉引用
本申請要求2007年1月3日提交的第60/878,617號美國臨時申請的 權益，將該臨時申請整體并入本文。
背景技術：
基于用于信號放大的酶反應的比色測定由于其便于使用及具有足 夠的靈敏度已經廣泛應用于臨床診斷學領域。酶標記的更新率、所用 的酶底物和酶量決定靈敏度。堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶是兩種最 常見的酶標記。前者經常用于與氯化硝基藍四氮唑(NBT)和/或5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸酯對曱苯胺鹽(BCIP)聯用。后者經常與3,3',5,5'-四曱 基聯苯胺(TMB)、 4-氯-l-萘酚(4-CN)、 3,3'-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB) 等聯用。在酶底物與所述酶反應時，形成不溶性有色產物。可以用肉 眼觀察不溶物以獲得定性結果，或利用筒單的光學檢測器獲得半定量 結果。因此，多少不溶性產物積聚以及光密度隨著積聚發生多大變化 決定了檢測極限。
已經付諸了許多努力來增加酶作用的效率和開發具有光密反應產 物的底物。通過升高溫度來促進酶促反應沒有太多余地，因為較高的 溫度導致酶的降解。增加酶的量的確有用，但對多少抗體可以結合到 固體表面有限制。用于免疫層析試劑盒的多孔膜已經達到了這種限制， 沒有顯著的改變可以期待。與比色方法相關的另 一缺點是差的動力學 范圍。只要檢測方法依賴于吸光度的測量，對于低于2的光密度的精確 測量是可能的，且另一方面最小吸光度是0.1級別。因此，范圍只有20， 僅覆蓋了一個數量級多點。
盡管肯定會做出改進，但沒有 一 個適用于大范圍酶/底物結合的通 用方法。本發明令人驚訝地提供了不依賴于對特定酶或底物的改進的 通用方法。發明概述
在一個實施方案中，本發明提供了檢測局域表面等離子體共振
(LSPR)檢測系統表面的折射率變化的方法。該方法包括利用固定的酶 從酶底物產生不溶性產物，其中所述不溶性產物在LSPR支持表面積
光或透射光的變化。
在另一個實施方案中，本發明提供了具有第一固體支持物的LSPR 傳感器、置于第一固體支持物上的LSPR支持表面、靠近LSPR支持表 面的固定的酶以及酶底物。
附圖
簡要說明
觀'J定(colorimetric 2-step sandwich assay)的比壽交。 圖2顯示了使用本發明方法的l-步測定。
圖3顯示了實施酶促反應后，金納米顆粒的掃描電子顯微鏡(SEM) 照片(1)以及表示在IL-6測定末，酶促反應過程中光密度變化的圖。
圖4顯示了可將抗體與納米顆粒(l)、與第 一 固體支持物(2)以及第 二固體支持物(3,4)結合的多種方式。
發明詳述 I.總述
本發明提供了通過利用局域表面等離子體共振(LSPR)支持表面檢 測分析物的方法。LSPR支持表面包括金包被表面，在該表面上有諸如 珠的金包被的納米顆粒陣列。本發明的方法利用夾心測定檢測分析物。 本發明的方法通過用固定在LSPR支持表面的珠的金表面上的第 一捕 獲部分捕獲分析物檢測所述分析物。然后利用具有檢測部分的第二捕 獲部分檢測所述分析物的存在。
在優選的實施方案中，所述夾心測定是免疫測定，其中捕獲部分 是抗體，而分析物是抗原。在另一個優選的實施方案中，檢測部分是酶，以使當第二捕獲部分結合到分析物時，將可溶性酶底物加入混合
物中，以致該酶將所述酶底物轉化為在LSPR支持表面積聚的不溶性產 物。不溶性產物在LSPR支持表面的積聚導致肉眼可見的反射或透射光 的波長位移(wavelength shift)。 LSPR的特性是需要4及少的不溶性產物 來誘發肉眼可見的波長位移。與本發明的方法相比，現有方法直接利 用比色法檢測不溶性產物的存在，因此需要大量的不溶性產物沉積。
色酶免疫測定的靈敏度。這通過局域表面等離子體共振效應放大了檢 測，通過在低容積反應區攪動樣品縮短了測定時間并將動力學范圍擴 大到幾個數量級之外。
可以通過利用與LSPR支持表面相關的近場光學(near-field optics) 提高比色酶免疫測定的靈敏度。在常規測定中，從酶促反應形成的有 色產物可以通過肉眼檢測，或通過監測在特定波長的吸光度的簡單裝 置檢測。如果在LSPR支持表面進行比色酶免疫測定，可以通過檢測反 射光或透射光的波長位移來間接檢測濃度低得多的有色產物的產生。 在固體表面吸收的納米顆粒形成了 LSPR支持表面，所述表面的特征在 于4兌消光i普(sharp extinction spectrum)。該4兌消光"i普可以是電,茲光i普的 任一部分，諸如在可見區中。銳消光譜是由于局域表面等離子體現象， 即局域自由電子的集體共振引起的。消光譜顯示了對局部折射率非常 敏感的依賴性。通過經由不溶性產物的吸收譜監測不溶性產物在LSPR 支持表面積聚誘發的折射率變化，檢測較低濃度的抗原是可能的。
常規比色法依賴于積聚的酶促反應產物的直接光學檢測，具有僅 稍高于1個數量級的動力學范圍。這已受到大多數光學系統高精確地測 量0.1至1.5范圍內的光密度的能力限制。本發明的方法可以在不同的波 長監測LSPR支持表面的消光譜的變化。盡管常規的比色測定已經嘗試 了相似的方法，但常規方法使用有色產物的直接監測，而不是如本發 明所實踐的間接監測。此外，可以通過操縱物理參數來調整LSPR支持 表面的靈敏度。因此，可以將動力學范圍擴展幾個數量級。
II.定義
7如本文所使用的，術語"LSPR支持表面"指能通過受限自由電子的 共振蕩形成光學近場的表面，所述受限自由電子的共振蕩，通常稱為 局域表面等離子體共振。LSPR支持表面的特征在于如下文更詳細描述 的納米顆粒。LSPR支持表面可以是不透明的或透明的，且可以透射或 反射光，或即透射光也反射光。
如本文所使用的，術語"納米顆粒"指直徑為約10力至約10—7米的顆 粒和珠。納米顆粒可以由任何合適的物質制成，且包括但不限于珠、
棱錐、金屬絲、網絲等。本領域技術人員會認識到，其它的納米顆粒 可以用于本發明中。
如本文使用的，術語"過渡金屬"指周期表的元素，包括Sc、 Ti、 V、 Cr、 Mn、 Fe、 Co、 Ni、 Cu、 Zn、 Y、 Zr、 Nb、 Mo、 Tc、 Ru、 Rh、 Pd、 Ag、 Cd、 La、 Hf、 Ta、 W、 Re、 Os、 Ir、 Pt、 Au和Ac。本4貞i或 技術人員會認識到，上述的過渡金屬的每一種都可以采用幾種不同的 氧化狀態，所有的狀態都用于本發明。在一些實例中，形成了最穩定 的氧化狀態，但其它的氧化狀態也用于本發明。
如本文使用的，術語"固體支持物"指其上可以添加或形成LSPR支 持表面的任何物質。合適的固體支持物的實例包括，但不限于，玻璃(包 括孔徑可調的玻璃聚合物(例如，聚苯乙烯、聚氨基曱酸酯、聚苯乙烯 -二乙烯基苯共聚物)、硅橡膠、石英、乳膠、過渡金屬、磁性材料、 二氧化硅、氮化硅、砷化鎵以及其衍生物。除了表面的反應位點，固 體支持材料通常抵抗它們接觸的各種化學反應條件。用于本發明的固 體支持物可以是平滑的或粗糙的。平滑表面是在表面上具有導致粗糙 的最少特征的表面。粗糙表面是在表面上具有產生磨擦力的大多數特 征的表面。本發明的固體支持物包括第一固體支持物和第二固體支持 物。固體支持物可以是平面的或非平面的、柔性的或剛性的。另外， 固體支持物可以是多孔的網或織品。固體支持物可以是不透明的或透
明的，可以透射或反射光，或既可以透射光又可以反射光。本領域的 技術人員會認識到，其它的固體支持物可以用于本發明。
如本文使用的，術語"LSPR檢測系統"指通過監測LSPR支持表面 的折射率的變化檢測靶分析物的系統。這些變化可以是等離子體峰移(peak shifts),吸收、反射或透射光i普形狀的變化或諸如吸收、反射或 透射光鐠的面積或比率的相關度量的變化。
如本文使用的，術語"不溶性產物"指積聚在LSPR支持表面并改變 LSPR支持表面的折射率的化合物。通過利用酶的酶底物的轉化形成不 溶性產物。該不溶性產物可以是有色的或無色的。
如本文使用的，術語"酶底物"指可溶性化合物，其通過酶轉化為 隨后在LSPR支持表面積聚或改變LSPR支持表面的折射率的不溶性產 物。下文描述了用作本發明的酶底物的化合物的實例。酶底物可以是 有色的或無色的。
如本文使用的，術語"固定的酶"指固定在固體支持物上、并靠近 LSPR支持表面、并將酶底物轉化為不溶性產物的酶。下文描述了固定 的酶的實例和固定酶的方法。
如本文使用的，術語"免疫測定"指4企測利用兩種捕獲試劑4全測分 析物的測定，其中一個捕獲試劑通常結合到固體支持物材料上且第二 捕獲試劑包括檢測部分。可以使用多種免疫測定形式，諸如固相ELISA
參見,例如,Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (抗體，實 驗室手冊)(1988))。可以用于測定分析物的免疫測定包括，例如竟爭 性和非竟爭性測定系統，諸如Western免疫印跡、放射免疫測定、ELISA (酶聯免疫吸附測定)、"夾心"免疫測定、免疫沉淀反應測定、沉淀素反 應(precipitin reactions)、 凝膠擴散沉淀素反應(gel diffusion precipitin reactions),免疫擴散測定、凝集測定(agglutination assays)、補體結合 測定、免疫放射分析、熒光免疫測定、蛋白A免疫測定等等。本領 域的技術人員會認識到，其它免疫測定可以用于本發明。
如本文使用的，術語"抗體"指基本上由 一個免疫球蛋白基因或多 個免疫球蛋白基因或其片段編碼的多肽，其特異性結合和識別分析物 (抗原)。識別的免疫J求蛋白基因包括K、入、a、 7、 S、 e和/i恒定區基因 以及無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為K或X。重鏈分為7、 /x、 a、 S或e,其依次限定免疫球蛋白類別，分別為IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。
示例性免疫球蛋白(抗體)結構單位包含四聚體。每一四聚體由兩個相同的成對多肽《連組成，每一對具有一個"輕"(約25 kD)和一個"重" 鏈(約50-70 kD)。每一鏈的N-末端限定主要負責抗原識別的約100至 110個或更多個氨基酸的可變區。術語可變輕鏈(VO和可變重鏈(VH)分 別指這些輕鏈和重鏈。
例如，抗體以完整的免疫球蛋白形式或以眾多通過由各種肽酶消 化產生的良好表征的片段形式存在。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區 的二硫聯接(disulfide linkages)下方消化抗體，產生F(ab)、，即Fab的二 聚體，其本身是通過二硫鍵連接到VH-CH l的輕鏈。F(ab)'2可以在溫和 的條件下被還原以打斷鉸鏈區的二硫聯接，由此將F(ab)'2二聚體轉化 為Fab'單體。該Fab'單體本質上是帶有部分鉸鏈區的Fab(參見，Paul (Ed.) Fundamental Immunology (基礎免疫學),第三版,Raven Press, NY (1993))。盡管根據完整抗體的消化定義了各種抗體片段，但本領域技 術人員會認識到，這些片^殳可以以化學方法或通過利用重組DNA方法 學從頭合成。因此，如本文使用的，術語抗體也包括通過完整抗體的 修飾產生或利用重組DN A方法學從頭合成的抗體片段(例如，單鏈 Fv)。
如本文使用的，術語"夾心測定"指直接測量捕獲的分析物的量的 測定。例如，在一個"夾心"測定中，捕獲試劑可以直接結合到固體底 物，它在那里得以固定。然后這些固定的捕獲試劑捕獲存在于測試樣 品中的靶分析物。因此固定的輩巴分析物隨后被帶有檢測部分的第二捕 獲試劑結合。可選擇地，所述檢測部分可以是帶標記的第三試劑，其 對衍生第二試劑的種類的試劑是特異的。第二試劑可以由諸如生物素 的可檢測的部分修飾，第三標記的分子諸如酶標記的鏈霉抗生物素可
以特異結合該可;f全測部分。如下文所述的，所述試劑可以是抗體或
adncctins。
如本文所使用的，術語"透明的"指材料透射光的能力。在本發明 中， 一些固體支持材料是透明的，吸收通過所述材料的很少的光。
III.檢測局域表面等離子體共振(LSPR)檢測系統表面的折射率變化 的方法本發明提供了檢測局域表面等離子體共振(LSPR)檢測系統表面的 折射率變化的方法。該方法包括使用固定的酶從酶底物產生不溶性產 物，其中所述不溶性產物在LSPR支持表面積聚。該方法也包括利用 LSPR,即利用被LSPR表面反射的或穿過LSPR表面透射的光譜的變 化，檢測由不溶性產物存在引起的表面的反射或透射光的變化。
本發明的基本原理是基于由與納米級貴金屬顆粒有關的局域表面 等離子引起的增強效應。在直徑為5nm至1000nm的這些顆粒中，產生 了由受限的自由電子的共振蕩導致的顯著的消光。共振電子產生了強 烈的局域電/f茲場，與非局域化的表面等離子體相比，強度增加了幾個 數量級。局域場，通常稱為光學近場(optical near-field),從表面延伸 幾十nm。當近場內的折射率變化時，由顆粒導致的消光被極為壽丈感地 修正。利用這種靈敏度，本發明提供了用于在LSPR附近進行比色的酶 測定方法。當產物沉積于LSPR支持表面時，消光譜的變化足以用肉眼 檢測，甚至當沉積厚度低于10nm時。監測的不是酶產物的吸光率。而 是LSPR支持表面的消光譜的變化，其易受LSPR附近產物存在的影響。 可以基于需要的靈敏度選擇待監測的波長。較接近波峰的波長區間20 至50nm適用于高靈敏度，且更遠的那些適用于較低靈敏度。因此，通 過在多重波長或全光譜的監測，延伸動力學范圍是可能的。
盡管有許多形成表面吸附的顆粒的方法，本發明的方法利用通過 單分散顆粒的單層首先在固體支持物培育的貴金屬表面吸附的步驟。 固體支持物可以是任何合適的材料，諸如硅、玻璃或聚合物。另一種 貴金屬層沉積在納米顆粒單層的頂部。通過仔細選擇納米顆粒直徑和 貴金屬層的厚度，產生其消光峰可以與待檢測的整個范圍的光的任一 波長匹配的LSPR支持表面是可能的。例如，可見光譜的任一波長可以 以這種方式匹配。而且，LSPR支持表面的不同納米顆粒直徑顯示了不 同的靈敏度，以致使用多個類型和直徑的顆粒可以用于進一步擴展動 力學范圍。本發明的顆粒包括，但不限于，由貴金屬和其他物質構成 的球形、三角形或顆粒，所述其它物質即由聚合物、金屬、金屬合金 或非金屬合成物制成的物質，本發明的顆粒可以是空的或多孔的，或 是有芯的，內部是不同的材料、液體或物質且具有5nm至100um的直
ii徑、長度或質量，其可以通過使用掩模和/或移除掩模的機械的、真空 的或化學方法被組成圖案。
A. LSPR支持表面
本發明的LSPR支持表面能檢測LSPR支持表面的消光譜的變化， 其中消光譜對產物的存在是敏感的。通過經由LSPR支持表面的吸收譜 監測由不溶性產物的存在誘發的折射率的變化，檢測較低濃度的抗原 是可能的。
圖l描述了以常規方法和本發明的方法實施的2-步夾心比色測定。 在通常情形下，方法起始于抗體包被的表面(1)。加入包含靶分子(抗原) 的樣品啟動表面結合抗體和抗原的結合事件(2)。然后，加入酶聯二抗 (3)。底物的加入導致有色酶促反應產物的形成(4)。通過在表面形成多 少有色產物來確定存在于樣品中的抗原的量(5)。在本發明的方法中， 方法起始于帶有固定的抗體的金顆粒包被的表面(6)。加入包含抗原的 樣品進行第一抗原/抗體反應(7)。加入二抗(8)，并加入底物，進行酶 促反應(9)。最后，通過金顆粒的消光譜的變化確定抗原的量(IO)。總 位移朝向較長的波長。監測不同波長的光譜位移或全光譜使技術人員 能夠調整靈敏度。
圖2顯示了如何實施稱為l-步測定的可選擇免疫測定模式。關于該 測定，當抗原和二抗還自由懸浮在液相中時，使兩者形成抗原/二抗復 合物。該復合物被表面接合的抗體捕獲(2)。如圖l中的2-步測定，通過 監測金顆粒的消光譜的變化進行檢測(3)。 1-步測定適用于需要較短測 定時間的測試。
圖3 (1 )顯示了進行酶促反應后的金顆粒的掃描電子顯微鏡(SEM) 照片，標記是堿性磷酸酶，且底物是NBT和BCIP的混合物。顆粒直徑 為100nm,且顆粒周圍的殼是酶促反應的沉積的產物。據估計沉積物 的厚度為約20nm。 (2)是表示IL-6測定末，酶促反應過程中光密度的最 大位置的變化圖。金顆粒的消光譜的峰值為570 nm,且監測的波長范 圍是620至630 nm。在t二50秒時注射BCIP/NBT底物混合物。從頂端到 底端，抗原濃度是60、 6、 0.6、 0.06ng/ml。LSPR支持表面可以包括可以是排列的、組成圖案的或分層的其任 一組合的納米顆粒。納米顆粒可以是任意大小和形狀，諸如膠體、網 絲、納米棒、納米線和珠。納米顆粒可以是單層或多層納米顆粒。在 一些實施方案中，納米顆粒形成單層。
LSPR支持表面的納米顆粒可以由單一物質或物質的混合物制成。 當所述納米顆粒由物質的混合物制成時，所述混合物可以是均質的或 異質的，以使納米顆粒內形成2層或多層材料。所述納米顆粒可以是中 空的或多孔的。所述納米顆粒可以使不透明的或透明的，并能夠透射 或反射光，或既透射光又反射光。
于本發明的納米顆粒的材料的實例包括但不限于，金屬、聚合物、陶 瓷(諸如^f圭石)和玻璃。
在一些實施方案中，本發明的納米顆粒包括過渡金屬，所述過渡 金屬包4舌Sc、 Ti、 V、 Cr、 Mn、 Fe、 Co、 Ni、 Cu、 Zn、 Y、 Zr、 Nb、 Mo、 Tc、 Ru、 Rh、 Pd、 Ag、 Cd、 La、 Hf、 Ta、 W、 Re、 Os、 Ir、 Pt、 Au和Ac。本領域的技術人員會認識到，上文描述的過渡金屬的每一種 可以采取幾種不同的氧化狀態，所有狀態都可以用于本發明。在一些 實例中，形成了最穩定的狀態，但其它氧化狀態也用于本發明。此外， 本發明的過渡金屬可以是金屬氧化物。在一些實施方案中，過渡金屬 可以是Au、 Ag、 Ta、 Pt、 Pd、 Cu或Rh。在其它實施方案中，過渡金 屬可以是金。
適的聚合物。在一些實施方案中，所述聚合物可以是聚苯乙烯、聚曱 基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯。在一些實施方案中，納米顆粒可以是玻璃 或包括聚苯乙烯、聚曱基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯在內的聚合物。用作 本發明的納米顆粒的陶瓷可以是任何陶覺。在一些實施方案中，所述 陶瓷可以是Si02或玻璃。
在其它實施方案中，材料的混合物用作LSPR支持表面的納米顆 粒。可以使用任何組合的材料。在一些實施方案中，納米顆粒可以是 包被金的聚苯乙烯或包被金的玻璃。本領域的技術人員會認識到，其
1它材料可用作本發明的納米顆粒。
在另一個實施方案中，LSPR支持表面的每一納米顆粒是具有頂部
和底部的i朱，其中頂部包被有過渡金屬。在其它實施方案中，納米顆 粒珠是聚苯乙烯，且過渡金屬是金。當本發明的納米顆粒珠是包被的， 諸如包被金的玻璃珠時，包被層可以是任何有益的厚度。在一些實施
方案中，金包被層的厚度可以是l nm或更小，幾納米或上百納米。使 用本領域技術人員已知的技術，諸如蒸發、賊射和CVD可以實現納米 顆粒的包被。
本發明的LSPR支持表面的納米顆粒可以是任意大小和尺寸。在一 些實施方案中，納米顆粒的大小是5nm至約1000nm。在一些其它的實 施方案中，珠的直徑為約10nm至約1000nm。仍在一些實施方案中， 所述珠的直徑為約50nm至約500nm。本領域的技術人員會認識到，其 它大小和尺寸的納米顆粒可以用于本發明。
用于本發明的LSPR支持表面的納米顆粒的大小和形狀，允許 LSPR支持表面得以調整，以與諸如可見光的全范圍的任意波長匹配。 也可以利用用于納米顆粒的不同形狀、大小和材料調整LSPR支持表面 的動力學范圍和靈敏度。
本發明的固體支持物可以是支持LSPR支持表面的任意材料。用于 固體支持物的材料包括，但不限于，過渡金屬、陶瓷、聚合物和玻璃。 本領域的技術人員會認識到，其他材料可以用于本發明。
可以通過諸如使表面平滑或使表面粗糙修飾固體支持物的表面以 獲得納米級特征。在一些實施方案中，固體支持物包被有過渡金屬， 諸如上文所述的過渡金屬。在一些其它的實施方案中，固體支持物包 被有金。包被層可以是任意有益的厚度，從小于lnm、包括幾納米直 到最多數百納米。
LSPR支持表面和固體支持物材料在用于檢測LSPR支持表面的折 射率變化的光的波長處可以是不透明或透明的。在一些實施方案中， 折射光用于^r測LSPR支持表面的折射率的變化。在一些實施方案中， 透射光用于檢測LSPR支持表面的折射率的變化。在一些其它的實施方 案中，折射光和透射光都用于檢測不溶性產物的存在。B.測定、酶和酶底物
部分捕獲，然后4吏用一全測部分檢測。通常，它是包含捕獲試劑和檢測 試劑的夾心測定。最通常的是，所述試劑是抗體，但它們可以是激素 受體、adnectins或分析物結合試劑的任何其它組合。
在一些實施方案中，所述測定是免疫測定。可以使用的多種免疫 測定，包括但不限于，固相ELISA免疫測定(對于免疫測定形式和可以 用于確定特異性免疫反應條件的描述，參見，例如Harlow & Lane， Antibodies, A Laboratory Manual (抗體，實'驗室手冊)(1988))。可以用 于檢測分析物的免疫測定包括，例如，竟爭性和非竟爭性測定系統， 諸如Westem免疫印跡、放射免疫測定、ELISA (酶聯免疫吸附測定)、 "夾心"免疫測定、免疫沉淀反應測定、沉淀素反應、凝膠擴散沉淀素 反應、免疫擴散測定、凝集測定、補體結合測定、免疫放射分析、熒 光免疫測定、蛋白A免疫測定等等。在優選的實施方案中，所述測 定是諸如ELISA測定的夾心測定。ELISA測定包括將未知量的抗原附 著于表面，然后使特異性抗體流過所述表面，以使它能夠結合所述抗 原。該抗體與酶連接，且在最后步驟中，加入酶能夠將其轉化為一些 可檢測信號的物質。因此，在焚光ELISA的情形下，當光照到樣品上 時，任何抗原/抗體復合物會發焚光以使樣品中抗原的量能得以測量。
實施ELISA包括至少一種對特定抗原具特異性的抗體。將帶有未 知量抗原的樣品非特異(通過吸附到表面)或特異(在"夾心"ELISA中， 通過被特異于相同抗原的另 一種抗體捕獲)地固定在固體支持物上。抗 原被固定后，加入檢測抗體，與抗原形成復合物。可以將檢測抗體與 酶共價連接，或自身可以被通過生物結合連接到酶的二抗檢測。在每 一步之間，板通常用溫和的去垢劑溶液洗滌以去除沒有特異結合的任
何蛋白或抗體。最后的洗滌步驟后，通過加入酶底物使板顯色以產生 可見信號，其指示樣品中抗原的量。
用于本發明的酶是將可溶性化合物轉化為不溶性化合物的酶。用 于本發明的酶的實例包括但不限于，堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶。本領域的技術人員會認識到，其它酶也可以用于本發明。
化合物的酶底物。在一些實施方案中，可溶性化合物沒有顏色且不溶 性化合物是有色的。酶底物的實例包括但不限于，氯化硝基藍四氮唑
(NBT)、 5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸酯對曱苯胺鹽(BCIP)、 3,3',5，5'-四曱基 聯苯胺(TMB)、 4-氯-l-萘酚(4-CN)和3,3'-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽 (DAB)。其它的酶底物包括稱為ECL和ECL Plus的電化學發光 (ElectroChemiLuminescent)化學制品。本領域的技術人員會認識到，其 它的酶底物可以用于本發明。
在其它的實施方案中，所述酶通過連接到抗體固定。在一些其它 的實施方案中，所述酶經由夾心測定固定。
許多不同的方法可以用于定位捕獲試劑。最簡單的方法是將試劑 直接置于LSPR支持表面的表面。將捕獲試劑連接到明顯不同于金顆粒 的表面也是可能的。該表面永久地或僅在酶反應的持續時間固定在相 對于金顆粒的位置。例如，捕獲試劑可以固定在固體支持物上，或固 定在如磁珠的第二固體支持物上。在一些實施方案中，捕獲試劑是抗 體。
本發明的酶可以以任何合適的方式固定于納米顆粒或固體支持 物。所述酶的固定可以是通過形成共價鍵、形成離子鍵、氫鍵和范德 華力等。圖4顯示了抗體被結合的多種方式。抗體可以直接連接到(l) 中LSPR支持表面的納米顆粒的頂端或連接到靠近納米顆粒的單獨區 域(2)。可選擇地，抗體可以連接到能夠置于靠近抗體包被的表面處的 單獨表面，其中支持表面被制成多孔的以及透明的，以確保抗原能接 觸抗體并允許詢問光(interrogating light)達到抗體包被的表面。另 一種 方法利用抗體包被的磁珠，所述珠可以通過外磁體(external magnet)(4) 與金顆粒包一皮的表面發生聯系。酶促反應產物沉積后，可以移走磁珠 以便于光學讀數。將抗體連接到單獨的表面的優點是增加了信號；當 酶促反應產物在棵LSPR支持表面而不是已被抗體覆蓋的LSPR支持表 面沉積時，這種變化更大。
在另一實施方案中，LSPR支持表面位于第一固體支持物上。在其他實施方案中，酶固定在第--固體支持物上。在一些其它的實施方案 中，酶固定在第二固體支持物上，其中在產生步驟中，所述第二固體
支持物靠近LSPR支持表面。仍在其它的實施方案中，所述第二固體支
持物是透明的。仍在其它的實施方案中，所述第二固體支持物是磁珠。 在另一個實施方案中，第一固體支持物的表面是平滑的。仍在另一個 實施方案中，第一固體支持體的表面是粗糙的。
用于要求保護的本發明中的諸如磁乳膠珠和氧化鐵顆粒的石茲珠或
顆粒，是本領域技術人員已知的。例如，在U.S. Pat. No. 4，672,040中 描述了》茲性顆粒。磁性顆粒可以從例如PerSeptive Biosystems, Inc. (Framingham Mass.), Ciba Coming (Medfield Mass.)、 Bangs Laboratories (Carmel Ind.)以及BioQuest, Inc. (Atkinson N,H.)商購。
已經開發出以與抗體相似的方式耙向并結合耙標的其它化合物。 這些"抗體模擬物"中的某些利用非免疫球蛋白支架作為抗體可變區的 可選擇性蛋白框架。
例如，Ladner等(U.S. Patent No. 5,260，203)描述了具有結合特異性 的單一多肽鏈結合分子，所述結合特異性與聚合的、但分子上分離的) 抗體的輕鏈和重鏈可變區的結合特異性相似。單鏈結合分子包含由肽 連接子連接的抗體的重鏈和輕鏈可變區的抗原結合部位，其折疊成與 雙肽抗體(two peptide antibody)相似的結構。單鏈結合分子顯示了優于 常規抗體的幾個優點，包括較小的體積、更大的穩定性以及更易修飾。
Ku等(尸麼.淑/. ^SW. ".S乂 92(14):6552-6556 (1995))公開了
基于細胞色素13562的抗體的替代物。Ku等(1995)制備了其中細胞色素 1)562的兩個環被隨機排列并基于與牛血清白蛋白的結合進行選擇的文 庫。發現個別的突變體選擇性地與BSA結合，與抗-BSA抗體相似。
Lipovsek等(U.S. Patent Nos. 6，818，418和7，115,396)公開了抗體模 擬物，其以纖連蛋白或纖連蛋白樣蛋白支架以及至少一個可變環為特 征。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物稱為Adnectins，顯示了天然的或 經改造的抗體的許多相同特征，包括對任一靶向配體的高親和力和特 異性。設計新的或改良的結合蛋白的任何技術都可以用于這些抗體模 擬物。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結構與IgG重鏈可變區的結構 相似。因此，這些模擬物顯示在本質和親和力上與天然抗體相似的抗 原結合特性。此外，這些基于纖連蛋白的抗體模擬物顯示了優于抗體 和抗體片段的某些益處。例如，這些抗體模擬物的天然折疊穩定性不 依賴于二硫鍵，并因此在通常會降解抗體的條件下是穩定的。此外，
由于這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結構與IgG重鏈的結構相似，可 以在體外采用環隨機化和改組(shuffling)的方法，其與體內的抗體親和 力成熟方法相4以。
Beste等(/Voc.胸/. Sc丄f/.&左96(5): 1898-1903 (1999))公開
了基于脂質運載蛋白支架(Anticalin⑧)的抗體模擬物。脂質運載蛋白支 架由在蛋白末端帶有四個高變環的i8-桶組成。Beste (1999)將所述環隨 機突變并根據與例如熒光素的結合進行選擇。三種變體展示了與熒光 素的特異性結合，其中一個變異體顯示了與抗熒光素抗體相似的結合。
其它的分析表明，所有隨機化的位置都是可變的，表明Anticalin⑧適于 用作抗體的替代物。
Anticalins⑧是小的單鏈肽，通常為160至180個殘基，其提供了優 于抗體的幾個優點，包括降低的生產成本、增加的存儲穩定性和降低 的免疫學反應。
Hamilton等(U.S. Patent No. 5,770,380)公開了利用杯芳烴的剛性非 肽有機支架的合成抗體模擬物，其與作為結合部位的多個可變肽環連 接。肽環在幾何學上都從杯芳烴的同一側突出，彼此不接觸。由于這 種幾何構型，所有的環都可以用于結合，從而增加了對配體的結合親 和力。然而，與其它抗體模擬物相比，基于杯芳烴的抗體模擬物并不 僅由肽組成，因此它較不易受蛋白酶的攻擊。支架也不是完全由肽、 DNA或RNA組成，這意味著該抗體模擬物在極端環境條件下相對穩 定，壽命長。此外，既然基于杯芳烴的抗體模擬物相對較小，它不大 可能產生免疫原性反應。
Murali等(Ce〃 Mo/所o/ 49(2):209-216 (2003))討論了將抗體降解為 更小的模擬肽(peptidomimetics)的方法，它們稱為"抗體樣結合模擬肽 "(ABiP)，也可以作為抗體的替代物。
18除了非免疫球蛋白的蛋白框架外，在包含RNA分子和非天然寡聚 體的化合物(例如，蛋白酶抑制劑、苯二氮卓類、嘌呤衍生物和/3-轉角 模擬物)中，也模擬了抗體特性。
將酶連接到表面的其它方法包括，使用同源雙功能 (homobifunctional)和異源雙功能(heterobifunctional)連接子。零長交耳關 劑(Zero-length cross linking reagents)i秀導兩個配體的直接偶耳關，而不引 入任何外來物質。催化二硫鍵形成的試劑屬于這類。另一個實例是誘 導羧基和第一位氨基縮合以形成酰胺鍵的試劑，諸如碳二亞胺、氯曱 酸乙酯、伍德沃氏(Woodward's)試劑Kl、羰基二咪唑等。同源雙功能 試劑攜帶兩個相同的功能基團，而異源雙功能試劑包含兩個不同的功 能基團。大多數異源雙功能交聯劑包含第 一位胺反應基團和硫醇反應 基團(thiol-reactive group)。 Heindel等(Heindel， N. D. et al., Bioconjugate Chem. 2， 427-430 (1991))公開了曱酰與硫醇偶聯的新異源雙功能連接 子。在優選的實施方案中，共價交聯劑選自能形成二硫(-S-S-)、乙二 醇(誦CH(OH)-CH(OH)-)、偶氮(-N二N-)、亞楓(-S(-02)-)或酯(-C(-0)-0-) 鍵的試劑。
在不同的方法中，配體通過其寡糖連接。多肽配體上的寡糖化學 氧化或酶促氧化成醛，在該分子上產生了獨特的功能基團，其可以與 包含例如胺肼、酰肼、氨基脲的化合物反應。由于糖基化位點在多肽 分子中是明確的，通過氧化的寡糖部分的選擇性偶聯會比其它偶聯方 法產生更為均一的產物，且被預期對配體的受體結合特性具有較少副 作用。針對糖類的異源雙功能交聯劑公開于，例如1992年8月5號提交 的共同未決的專利申請第07/926,077號和美國專利第5，329,029號中。
C.檢測
施方案中，檢測方法是使用合適裝置通過比色檢測。在其它實施方案 中，；險測通過肉眼進行。LSPR支持表面的折射率變化的檢測在任一波 長處進行，特別是具有約200至約1000nm的波長的光。用于檢測LSPR 支持表面的折射率變化的檢測儀器包括但不限于，UV-Vis分光計和板讀數器。
IV. LSPR傳感器
本發明的LSPR傳感器包括第 一 固體支持物、如上文所述的并安置 于第 一 固體支持物的LSPR支持表面、靠近LSPR支持表面的固定的酶 以及酶底物。
V. 試劑盒
在一些實施方案中，本發明提供了具有如上文所述的LSPR傳感器 和酶底物的試劑盒。本發明的試劑盒也可以包括溶劑、緩沖液、穩定 劑和使用說明書。
VI. 實施例
實例l:檢測LSPR表面的折射率的變化
根據下文描述的多種步驟，進行用于LSPR表面的免疫測定的流程。
步驟l.捕獲抗體的固定
首先利用本領域已知的方法制備LSPR支持表面，所述方法包括在 玻璃底物上沉積金，隨后在金包被的玻璃底物上形成單層聚苯乙烯珠， 且然后在整個表面沉積另一層金。然后用具有以9:1比率混合的羥基鏈 烷石克醇(hydroxyl-alkanethiol)和羧基鏈烷碌u醇(carboxyl-alkanethiol)的 自組裝單層(SAM)修飾所述金包被的表面。
用溶于水的0.05% Tween20洗滌SAM-官能化的LSPR支持表面。然 后將其用雙蒸水沖洗并干燥。如在即Greg T. Hermanson, 5"cc^wga^ JfecAm々證，Academic Press, San Diego， 1996中描述的，用溶液(溶于O.l M MES緩沖液的IOO mM NHS + 400 mM EDC in)激活LSPR支持表面 的羧基基團15至30分鐘。
孵育30分鐘后，沖洗掉所述溶液并換為500 nM抗體溶液的溶液。 抗體溶液在無胺緩沖液如PBS中。將抗體固定30分鐘，最長為24小時。 例如，檢測C-反應蛋白的捕獲抗體是來自Biodesign的小鼠單克隆的抗CRP抗體Cat弁M86007M。通過使表面與溶于水的50 mM氨基聚乙烯氧
然后表面用水沖洗，并通過在購自Pierce化學公司的StartingBlock 緩沖液中孵育15分鐘進一步封閉以對抗非特異性結合。然后將用捕獲 抗體活化的LSPR支持表面用雙蒸水沖洗并保持在濕潤的環境中，直至 使用傳感器。
2. 抗原的捕獲
將C-反應蛋白或CRP在由磷酸鹽緩沖液(PBS)、 lmMCa2+、 0.01% v/v Tween 20和10 uM BSA (牛血清白蛋白)組成的緩沖液中(緩沖液A) 稀釋成從l pM (l(T12 M)直到luM (10—6 M)的多種濃度。然后將抗原與抗 體活化的LSPR支持表面一起孵育5分鐘至2小時的一段時間。
3. 第二抗抗原抗體捕獲
然后將傳感器與緩沖液A中的濃度為250 nM的多克隆山羊抗人 CRP抗體(Bethyl Labs, Cat# A80-125A)—起孵育。該抗體可以標記有酶 或探針(例如，生物素)。孵育15至30分鐘后，第二抗體用緩沖液沖洗 掉。
4. 針對第二抗抗原抗體的酶耳關抗體
然后使酶聯抗體，即驢抗山羊IgG抗體堿性磷酸酶偶聯物(Bethyl Lab, Cat# A50-101AP)反應約2至30分鐘，隨后用緩沖液A沖洗掉。
5. 顯色
將酶底物加到LSPR支持表面并孵育30秒至10分鐘。未反應的酶底 物用水沖洗掉。然后測量表面的吸收光譜或反射光譜。
盡管出于清楚理解的目的，通過說明和實施例較詳細地描述了前 述發明，但本領域的技術人員會認識到，在所附的權利要求的范圍內 可以做出某些變化和修飾。此外，本文提供的每一篇參考文獻通過引 用的方式整體并入的程度，如同每一篇參考文獻通過引用的方式單獨 并入。
權利要求
1.檢測局域表面等離子體共振(LSPR)檢測系統表面的折射率變化的方法，所述方法包括a)使用固定的酶從酶底物產生不溶性產物，其中所述不溶性產物在LSPR支持表面積聚，以及b)利用LSPR檢測由所述不溶性產物的存在引起的表面的反射光或透射光的變化。
2. 如權利要求l所述的方法，其中所述表面包含納米顆粒，其中 每一 納米顆粒的大小為約5 nm至約1000 nm。
3. 如權利要求2所述的方法，其中每一納米顆粒包含選自Au、 Ag、 Ta、 Pt、 Pd、 Rh和Cu的過渡金屬。
4. 如權利要求3所述的方法，其中所述過渡金屬是金。
5. 如權利要求3所述的方法，其中每一納米顆粒還包含玻璃或選 自聚苯乙烯、聚曱基丙烯酸酯或聚丙烯酸酯的聚合物。
6. 如權利要求5所述的方法，其中所述納米顆粒是具有頂部和底 部的珠，其中所述頂部包被有金屬。
7. 如權利要求6所述的方法，其中所述納米顆粒珠包含聚苯乙烯 且所述金屬包含金。
8. 如權利要求l所述的方法，其中所述酶底物是選自氯化硝基藍 四氮唑(NBT)、 5-溴-4-氯-3'-吲哚基磷酸酯對曱苯胺鹽(BCIP)、 3，3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)、 4-氯-1 -萘酚(4-CN)和3,3'-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽 (DAB)的成員。
9. 如權利要求l所述的方法，其中所述酶是選自^5威性磷酸酶和辣 根過氧化物酶的成員。
10. 如權利要求2所述的方法，其中所述酶通過連接到抗體固定。
11. 如權利要求10所述的方法，其中所述酶通過夾心測定固定。
12. 如權利要求l所述的方法，其中所述檢測步驟包括利用LSPR!己的
13. 如權利要求l所述的方法，其中所述檢測步驟包括利用LSPR 檢測由所述不溶性產物的存在引起的表面透射光的變化。
14. 如權利要求2所述的方法，其中所述LSPR支持表面位于第一 固體支持物上。
15. 如權利要求14所述的方法，其中所述酶固定于所述第一固體 支持物上。
16. 如權利要求14所述的方法，其中所述酶固定于第二固體支持 物上，其中所述第二固體支持物在產生步驟中靠近所述LSPR支持表 面。
17. 如權利要求16所述的方法，其中所述第二固體支持物是透明的。
18. 如權利要求16所述的方法，其中所述第二固體支持物是磁珠。
19. 如權利要求14所述的方法，其中所述第一固體支持物的表面是平滑的。
20. 如權利要求14所述的方法，其中所述第一固體支持物的表面是粗糙的。
21. LSPR傳感器，其包含 第一固體支持物；置于所述第一固體支持物上的LSPR支持表面；以及 靠近所述LSPR支持表面的固定的酶。
22. 試劑盒，其包含 權利要求21所述的LSPR傳感器；以及 酶底物。
全文摘要
本發明提供了檢測局域表面等離子體共振(LSPR)檢測系統表面的折射率變化的方法。該方法包括利用固定的酶從酶底物產生不溶性產物，其中所述不溶性產物在LSPR支持表面積聚。所述方法也包括利用LSPR檢測由不溶性產物的存在引起的表面反射光或透射光的變化。
文檔編號G01N33/551GK101617229SQ200880001661
公開日2009年12月30日 申請日期2008年1月2日 優先權日2007年1月3日
發明者蘭迪·斯道爾, 竹井弘之, 達尼埃勒·格利翁 申請人:萊姆達仁公司