專利名稱：H5亞型豬流感病毒抗體檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及豬的一種病毒抗體的快速診斷器具，具體是H5亞型豬流感病毒抗體檢 測試劑盒。
背景技術：
豬流感(swine influenza, SI)是由正粘病毒A型流感病毒(SIV)引起的豬的一種急性、傳染 性呼吸道疾病，以突發、高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭、高發病率、低死亡率為主要特征。 由于SIV可損害呼吸道上皮細胞，患病豬容易繼發和并發豬呼吸繁殖障礙綜合征、豬偽狂犬 病、豬呼吸道冠狀病毒感染、豬圓環病毒病、豬傳染性胸膜肺炎、豬傳染性萎縮鼻炎、豬巴 氏桿菌病等其它疾病，使疫情變得復雜而反復，是集約化養豬場普遍存在且難以根除的豬呼 吸道病之一，對養豬業危害極大。近年來，對我國部分省市豬群豬流感的血清學調査表明近 年我國豬群中Hl、 H3亞型豬流感的污染相當普遍，甚至豬群中還出現了 H5N1和H9N2亞 型SI的感染。由于豬上皮細胞同時具有人流感病毒和禽流感病毒的病毒受體，其作為毒株間 基因重組的流感病毒"混合器"，在流感病毒跨種屬障礙而感染新宿主的過程中，扮演著流感 病毒中間宿主及多重宿主的作用，在人和動物流感的病原學、生態學及流行病學中占有舉足 輕重的地位，具有重要的公共衛生意義，因此，對豬SIV感染的監測是預測和防止流感大暴 發的最重要手段。
目前，用于豬流感病原和抗體檢測的方法主要有病毒的分離鑒定、血凝和血凝抑制試驗、 神經氨酸酶抑制試驗、中和試驗、瓊脂凝膠擴散試驗、免疫熒光法、酶聯免疫吸附試驗、聚 合酶鏈式反應、實時熒光定量PCR和NASBA法等方法，上述技術和方法雖然可以檢測豬流 感病毒及其抗體水平，在實踐中也取得一定的效果，但均存在試驗操作復雜，耗時長，需要 特定的專業技能和儀器設備等，成本昂貴，常限于實驗室內進行，很難在基層普及和推廣。 因此，研制開發適用于養殖基層的快捷、簡便的H5亞型豬流感病毒抗體檢測器具，對豬群 H5亞型豬流感病毒抗體水平進行實時監測，對流感的預防和控制有重要意義。
發明內容
本實用新型的目的是克服上述已知技術存在的不足，提供一種快捷、簡便的H5亞型豬 流感病毒抗體檢測試劑盒，可有效檢測H5亞型豬流感病毒抗體水平，用于H5亞型豬流感病 毒感染的血清學監測。本實用新型的目的是這樣實現的-
本設計的H5亞型豬流感病毒抗體檢測試劑盒有一個盒體10，該盒體10內有采用重組表 達的H5亞型豬流感病毒血凝素HA1蛋白為包被抗原的密封包裝的檢測板1，作為洗滌和稀 釋使用的20倍濃縮的洗滌液或樣品稀釋液2，陰性血清對照3，陽性血清對照4，酶結合物 工作液5，顯色液A 6，顯色液B7，終止液8和操作說明書9;上述液體試劑均分裝在小瓶 內。
用于包被密封包裝的檢測板1的重組表達的H5亞型豬流感病毒血凝素HA1蛋白保留了 H5亞型豬流感病毒血凝素蛋白的抗原活性，用于檢測H5亞型豬流感病毒的血凝素特異性抗 體。
與現有技術相比，本實用新型具有下列優點-
本實用新型以基因工程表達的重組血凝素HA1蛋白為檢測抗原，該重組蛋白為非全病毒 抗原、安全性好，不含無關雜蛋白，只與H5亞型豬流感病毒血凝素抗體特異結合，不與豬 的其它疫病血清發生交叉反應，特異性強，敏感性高；使本實用新型檢測H5亞型豬流感病 毒抗體，無需另配其它試劑，樣品無需無菌處理，按試劑盒說明書操作單一樣品在2-3小時 內即可判定結果，操作簡便快速，人人都可操作，能較好滿足不同層次人員的需要，如疫病 監測、海關檢疫、衛生防疫、集約化養殖到個體養殖等，易于大范圍推廣應用，具有良好的 應用前景。
圖l是本實用新型主視圖。 圖2是本實用新型內部俯視圖。
圖中，1、密封包裝的檢測板；2、 20x濃縮洗滌液或樣品稀釋液；3、陰性血清對照； 4、陽性血清對照；5、酶結合物工作液；6、顯色液A; 7、顯色液B; 8、終止液；9、操作 說明書；10、 盒體。
具體實施方式使用步驟如下
1) 使用前將20x濃縮洗滌液或樣品稀釋液2恢復至室溫，搖動使沉淀的鹽溶解，然后用
蒸餾水或去離子水作20倍稀釋(如50mL濃縮液定容到1000mL)，即為洗滌液或樣品稀釋液；
2) 將待檢血清用樣品稀釋液作1: 400稀釋(如2nL待檢樣品加入到800^iL稀釋液中)；
3) 取出檢測板l，分別在相應孔中加入陽性血清對照4和陰性血清對照3(不用稀釋)、稀 釋好的待檢血清各lOOpL，可各重復1孔。置37'C孵育30分鐘；
4) 甩掉步驟3中液體，每孔加洗漆液20(HiL，洗滌6次，每次間隔l分鐘，拍干；5) 每孔加入酶結合物工作液5 100|xL， 37'C孵育30分鐘；
6) 甩掉酶結合物工作液5，每孔加洗滌液200pL，洗滌6次，每次間隔l分鐘，拍干；
7) 將顯色液A 6和顯色液B 7按1:1混合，每孔加入100ML， 37'C避光孵育5-15分
鐘；
8) 加終止液8 50jiL，用酶標儀在450nm波長下讀取每孔光吸收值(OD45Q,值)。
9) 結果判定
① .試驗結果同時符合下列條件，方為有效兩孔陽性對照OD45o平均值應^0.6;陰性對 照平均值蕓0.25;
② 臨界值的計算臨界值上限=(陽性對照孔OD45C均值-陰性對照0045()均值)><0.20+陰性 對照OD45Q平均值；臨界值下限=(陽性對照孔OD柳均值-陰性對照OD45Q均值)x0.15+陰性對 照OD450平均值
③ 結果判定被檢樣品0045()平均值<臨界值下限，為H5亞型豬流感病毒抗體陰性；被
檢樣品OD45o平均值^臨界值上限，為H5亞型豬流感病毒抗體陽性；介于二者之間，判為可 疑，應復檢，復檢OD45o值S臨界值上限(復檢時)，判為H5亞型豬流感病毒抗體陽性，反之
則判為陰性。
備注不用時，應于2 8'C避光保存，開封后，應在3個月內用完。
權利要求1.H5亞型豬流感病毒抗體檢測試劑盒，其特征在于該檢測試劑盒有一個盒體(10)，盒體(10)內有采用重組表達的H5亞型豬流感病毒血凝素HA1蛋白為包被抗原的密封包裝的檢測板(1)，作為洗滌和稀釋使用的20倍濃縮的洗滌液或樣品稀釋液(2)，陰性血清對照(3)，陽性血清對照(4)，酶結合物工作液(5)，顯色液A(6)，顯色液B(7)，終止液(8)和操作說明書(9)；上述液體試劑均分裝在小瓶內。
專利摘要H5亞型豬流感病毒抗體檢測試劑盒涉及豬的一種病毒抗體的快速診斷器具。其組成包括一個盒體(10)，盒體(10)內有采用重組表達的H5亞型豬流感病毒血凝素HA1蛋白為包被抗原的密封包裝的檢測板(1)，作為洗滌和稀釋使用的20倍濃縮的洗滌液或樣品稀釋液(2)，陰性血清對照(3)，陽性血清對照(4)，酶結合物工作液(5)，顯色液A(6)，顯色液B(7)，終止液(8)和操作說明書(9)；上述液體試劑均分裝在小瓶內。用于包被密封包裝的檢測板的重組表達的H5亞型豬流感病毒血凝素HA1蛋白保留了H5亞型豬流感病毒血凝素蛋白的抗原活性，用于檢測H5亞型豬流感病毒的血凝素特異性抗體。
文檔編號G01N33/569GK201319032SQ200820166369
公開日2009年9月30日 申請日期2008年10月20日 優先權日2008年10月20日
發明者周繼勇, 可 尹, 焰 顏 申請人:浙江大學