專利名稱：一種快速檢測惡性瘧的膠體金免疫層析試紙的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種瘧疾快速檢測裝置，特別涉及一種快速檢測惡性瘧的膠體金免疫層析試紙， 屬于膠體金快速檢測領域。
背景技術：
瘧疾是瘧原蟲寄生于人體所引起的傳染病，經瘧蚊叮咬或輸入帶瘧原蟲者的血液而感染，可向各 年齡的人傳播。如未及時進行治療，瘧疾可引起通常致命的嚴重疾病臨床上以周期性定時性發作的寒 戰、高熱、出汗退熱，以及貧血和脾大為特點。因原蟲株、感染程度、免疫狀況和機體反應性等差異， 臨床癥狀和發作規律表現不一。寄生于人體的瘧原蟲有四種惡性瘧原蟲(P. falciparum)、間日瘧原 蟲(P. vivax)、三日瘧原蟲(P. malarial)和卵形瘧原蟲(P. ovale),不同的瘧原蟲分別引起間日瘧、三 日瘧、惡性瘧及卵圓瘧。最常見的是惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲。惡性瘧原蟲是到目前為止最致命的一 種瘧疾感染。
癥疾在世界上分布廣泛，據世界衛生組織統計，目前有92個國家和地區處于高度和中度流行， 每年發病人數為1.5億，死于瘧疾者愈200萬人。大多數病例和死亡發生在撒哈拉以南非洲，但是， 亞洲、拉丁美洲、中東以及歐洲部分地區也受到影響。從無瘧疾地區到有瘧疾傳播地區的人群免疫力 極其脆弱，通常面臨延遲或錯誤的瘧疾診斷。
及早、快速準確的診斷是瘧疾預防和治療的關鍵。傳統的診斷方法是通過血涂片顯微鏡檢査來判 斷病人是否感染瘧原蟲，這種方法簡便、經濟、準確率高，缺點是結果判斷受檢驗人員鏡檢水平和視 力疲勞程度等因素的影響，易導致誤診和漏檢，且檢査效率不高，不適于大規模現場調査及短時間內 處理大批量樣本。隨著免疫診斷技術和單克隆抗體技術的發展，瘧疾診斷技術不斷創新，包括酶聯免 疫吸附法、聚合酶鏈式反應法等，上述方法各有所長，但都需專用儀器、專業人員操作，且價格昂貴， 仍不適于瘧疾高發地區的大規模現場調査。
將膠體金免疫分析法引入瘧原蟲檢測為瘧疾的快速診斷提供了一個新的分析檢測途徑。專利 200610165288.3 —種檢測癥原蟲的免疫層析試紙及其制備方法，是以重組瘧原蟲乳酸脫氫酶為抗原免 疫動物獲得多抗，該法采用多抗免疫獲得抗抗體，應用的方法是雙多抗夾心法。本實用新型是用滅活 的惡性瘧原蟲病原體直接免疫小鼠，獲得針對惡性瘧病原體不同位點的配對的單克隆抗體，從而實現 雙抗夾心原理制成試紙，特異性強、靈敏度高，適用于大規模現場檢測。 發明內容
本實用新型針對上述存在的一些問題，提供了一種快速檢測惡性瘧的膠體金免疫層析試紙。為解決上述技術問題，本實用新型是通過以下技術方案實現的 一種快速檢測惡性瘧的膠體金免 疫層析試紙，是由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、惡性瘧原蟲單克隆抗體金標墊、樣品吸液層組成， 底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一 端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和惡性瘧原蟲單克隆抗 體金標墊相互交疊連接，在惡性瘧原蟲單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層。
其中，試驗線由惡性瘧原蟲單克隆抗體I包被，控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成。金標墊 由惡性瘧原蟲單克隆抗體II作為膠體金標記。
樣品吸液層由三層材料疊加組成，第一層為一定規格無紡布層、第二層為玻璃纖維層、第三層為 一定規格無紡布層。
配對的惡性瘧原蟲單克隆抗體的建立是以滅活的惡性瘧原蟲病原體直接免疫BALB/c小鼠，用 SP2/0細胞融合建立瘤株進行篩選，取瘤細胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產生腹水，提取小鼠腹水 純化篩選，獲得能同時與惡性柜原蟲不同位點結合的兩種瘧原蟲單克隆抗體I、 H,其中抗體I用于 包被硝酸纖維素膜上試驗線，另一株種抗體H用于標記單克隆抗體金標墊，實現膠體金雙抗夾心法。
檢測時，血液樣本經蒸餾水或皂素裂解，把檢測試紙的樣品吸液層端放入樣本中(液面不得超過 MAX),或向板式試劑盒加樣口滴加樣品，由于毛細管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，當移動 至惡性瘧原蟲單克隆抗體II金標墊時，樣品中的惡性瘧原蟲與惡性瘧原蟲單克隆抗體金標探針發生特 異結合，當移動至固定有惡性瘧原蟲單克隆抗體I試驗線時，樣品中的惡性瘧原蟲又與試驗線中的癥 原蟲單克隆抗體I相結合，因此其膠體金滯留于試驗線上，試驗線處顯示紅色為陽性；相反如果樣品 中沒有感染惡性瘧原蟲，惡性瘧原蟲單克隆抗體金標探針就不會與試驗線上的惡性瘧原蟲單克隆抗體 I發生特異結合，沒有膠體金滯留，即僅有一條紅色控制線為陰性，這就是雙抗夾心法原理。根據此 原理，兩條線為陽性，一條線為陰性得出判斷。
當移動至羊抗鼠多克隆抗體控制線時，無論樣品中有無感染惡性瘧原蟲，標記的金標探針都會與 己設定好的羊抗鼠多克隆抗體結合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無色帶產生則代表操作有誤, 檢測時樣品液面超過MAX線或試紙已經過期。
由于采用上述技術方案，本實用新型所提供的一種快速檢測惡性瘧的膠體金免疫層析試紙具有這 樣的有益效果，即特異性強，靈敏度高，易儲存，無須專門技術人員操作，而且結果易讀。
圖l為檢測試紙的主視結構圖2為檢測試紙的側視結構圖3為陰性結果圖圖4為陽性結果圖。
圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗線，5、單克隆抗體 金標墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、 MAX線。 具體實施例
根據圖l、圖2所示，本實用新型為一種快速檢測惡性瘧的膠體金免疫層析試紙，是由底板(7)、 吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、惡性瘧原蟲單克隆抗體金標墊(5)、樣品吸液層(6)組成，底板 中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線(4)和一條多克隆抗體控制線(3),底板一端 端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和惡性瘧原蟲單克隆抗體 金標墊相互交疊連接，在惡性瘧原蟲單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層。
1. 經細胞培養方法獲得惡性瘧病原體，滅活備用。
2. 瘧原蟲配對單克隆抗體的制備
(1) 用重組的惡性瘧原蟲抗原免疫BALB/c小鼠。用SP20細胞融合建立瘤株進行篩選，取瘤細 胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產生腹水。
(2) 提取小鼠腹水純化篩選，獲得能同時與惡性瘧原蟲不同位點結合的兩種惡性瘧原蟲單克隆 抗體i、 n,抗體I用于包被硝酸纖維素膜上試驗線，抗體II可用于雙抗夾心法的膠體金標 記。
3. 膠體金的制備及與瘧原蟲單克隆抗體的結合
(1) 取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到90 95C加入適量枸櫞酸三納繼續加熱攪拌至 沸騰5分鐘，冷卻后避光保存備用。
(2) 把惡性瘧原蟲單克隆抗體標記的膠體金液，吸附纖維材料上，干燥后備用。
4. 制膜機制膜利用電腦控制傳動速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
5. 試紙條組合按公知技術組合。
6. 使用方法檢測時，血液樣本經蒸餾水或皂素裂解，把檢測試紙的樣品吸液層端放入樣本中(液 面不得超過MAX線)，或向板式試劑盒加樣口滴加樣品，l分鐘后取出試紙平放，由于毛細管和虹吸作 用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，5分鐘時觀察結果。
7. 結果判斷兩條紅色線時為陽性；只有一條紅色控制線時為陰性。
權利要求1. 一種快速檢測惡性瘧的膠體金免疫層析試紙，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、惡性瘧原蟲單克隆抗體金標墊(5)、樣品吸液層(6)組成，底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和惡性瘧原蟲單克隆抗體金標墊相互交疊連接，在惡性瘧原蟲單克隆抗體金標墊上壓有樣品吸液層。
2. 根據權利要求1所述的一種快速檢測惡性瘧的膠體金免疫層析試紙，其特征在于硝酸纖維素膜上 有兩條線， 一條由惡性癥原蟲單克隆抗體I包被的試驗線和一條多克隆抗體控制線。
3. 根據權利要求1所述的一種快速檢測惡性瘧的膠體金免疫層析試紙，其特征在于金標墊是由惡性 瘧原蟲單克隆抗體II作為膠體金標記。
4. 根據權利要求1所述的一種快速檢測惡性瘧的膠體金免疫層析試紙，其特征在于控制線是由羊抗 鼠多克隆抗體包被而成。
5. 根據權利要求1所述的一種快速檢測惡性瘧的膠體金免疫層析試紙，其特征在于樣品吸液層由三 層材料疊加組成，第一層為一定規格無紡布層、第二層為玻璃纖維層、第三層為一定規格無紡布 層。
專利摘要一種快速檢測惡性瘧的膠體金免疫層析試紙，底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條瘧原蟲單克隆抗體I試驗線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，底板一端為吸水層，另一端為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水層和金標墊相互交疊連接，在金標墊上壓有樣品吸液層。以滅活的惡性瘧原蟲病原體直接免疫BALB/c小鼠，用SP2/0細胞融合建立瘤株進行篩選，取瘤細胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產生腹水，提取小鼠腹水純化篩選，獲得能同時與惡性瘧原蟲不同位點結合的兩種瘧原蟲單克隆抗體I、II，其中抗體I用于包被硝酸纖維素膜上試驗線，另一株種抗體II用于標記單克隆抗體金標墊。本裝置特異性強，靈敏度高，易儲存，無須專門技術人員操作，而且結果易讀。
文檔編號G01N33/577GK201269878SQ200820122568
公開日2009年7月8日 申請日期2008年9月22日 優先權日2008年9月22日
發明者萬積成 申請人:萬積成