專利名稱：檢測萊克多巴胺藥物殘留的膠體金試紙卡的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于獸藥殘留的免疫化學速測技術領域，具體涉及一 種檢測試紙卡。
背景技術：
萊克多巴胺(Ract叩amine )屬于(3-興奮劑。|3-興奮劑是營養重 分配劑一種，是一類結構和功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙 醇胺類衍生物，它可以加快畜禽生長速度，降低酮體脂肪含量，提高 痩肉率。在歐盟P-興奮劑已被禁止用于家禽的生長促進劑，我國在《禁 止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》中也有明文規定。但 由于萊克多巴胺屬于非處方藥，且價格遠低于克侖特羅，因此其非法 應用者不斷增多。本方法為萊克多巴胺單克隆抗體酶聯免疫快速檢測 試劑盒，可用于尿樣、動物組織(肌肉、肝臟等)中的殘留檢測。
目前萊克多巴胺殘留常用的檢測方法有兩種。 一種是色譜分析， 如氣相色譜法(GC),由于復雜的儀器設備和繁瑣的過程，不適合現 場監控和大量樣本篩查。另一種為免疫學方法，如酶聯免疫吸附法 (ELISA)。它的缺點是檢測時間長，費用較高，不利于在基層單位 推廣使用。而且，這兩種方法都需要專業技術人員進行操作。
實用新型內容
本實用新型的目的在于針對上述不足提供一種敏感度高、成本 低、操作簡單、檢測時間短的試紙卡。
本實用新型的試紙卡包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣 品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊，與常規試紙卡不同的是， 其中的結合物釋放墊不是完全覆蓋在樣品吸收墊之下，而是部分區域 覆蓋于樣品吸收墊之下，優選結合物釋放墊的二分之一區域覆蓋于樣
品吸收墊之下。
這樣做的好處是可以延長檢測結果觀察時間，樣品吸收墊也可以 將檢測液體充分吸收與金標抗體完全接觸充分反應，再層析至反應膜 上進行反應，可以有效的減少誤差。還可以防止檢測樣本中一些干擾 成份使金標抗體中的蛋白失去活性，影響金標抗體與包被原的結合。
所述反應膜上分別包被有萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物構成的檢 測線印跡"I "和包被羊抗鼠IgG構成的質控線印跡"I "。從而可 以用于萊克多巴胺殘留的檢測。
本實用新型試紙卡的底板為可PVC板或者是其它硬質而不吸水 的材料；反應膜可為硝酸纖維素膜或者醋酸纖維素膜；樣品吸收墊可 由玻璃棉或聚酯材料制成；結合物釋放墊可由纖維制成，結合物釋放 墊層包被有抗體-膠體金結合物。在樣品吸收墊與結合物釋放墊及吸 水層上覆蓋有保護膜，在玻璃棉和纖維層一側約0.4cm處噴制樣品標 記線。
偶聯萊克多巴胺金標載體蛋白可用卵血清蛋白、或人血清白蛋 白、牛血清白蛋白、血藍蛋白等，在反應膜上的檢測線印跡和質控線 的對照印跡組合排列可為"II "。
本實用新型具有有益的積極效果，萊克多巴胺快速檢測試紙卡具 備下列各項有點
l.特異性強，敏感度高。萊克多巴胺快速檢測試紙卡以膠體金標 記高親和力的單克隆為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子 之間無價健形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金對 單克隆特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，快速 檢測試紙卡具有較高的特異性和敏感性。可檢測5ng/ml。
2.搡作簡便快速。使用快速檢測試紙卡時無需任何其它試劑，只 要將樣品用滴管滴入試劑卡孔內，滴加3滴(約100微升)，加后計時, 5~8min內觀察結果。
3.顯示檢測結果形象、直觀準確。快速檢測試紙卡以顯示紅線色
"I "及"II "印跡作為檢測的陽性和陰性標記，即在硝酸纖維素膜上顯 示一條紅線"I "印跡表示在被檢測樣品液中含有萊克多巴胺，兩條紅 線"ll"印跡表示在被檢測樣品中不含萊克多巴胺，結果判定形象、直 觀、準確、簡單明了，不容易出現陰性和假陽性誤判。
4. 成本低，投資少。使用快速檢測試紙條，不需另配儀器設備及 其他試劑，使現場檢測一步到位，成本低廉，投資少，見效快。
5. 易于大范圍推廣應用。快速檢測試紙卡操作簡單，人人都可操 作，能較好滿足不同層次人員的需要，如專業化驗、海關檢疫、衛生 防疫、質量監測、動物產品加工、集化養殖到個體養殖等，具有廣闊 的巿場前景和較大的經濟、社會效益。
圖l為萊克多巴胺快速檢測試紙卡結構示意圖，其中，1、樣品吸 收墊；2、結合物釋放墊；3、反應膜；4、吸水墊；5、檢測線；6、 質控線；7、底板；
圖2為萊克多巴胺快速檢測試紙卡俯視結構示意圖，其中8-l和8-2 是覆蓋在試紙卡兩端的保護膜，9為標記線；
圖3為萊克多巴胺快速檢測試紙卡陰性(圖3."、陽性(圖3.b)、 無效(圖3.c)顯色示意圖，其中T質控區，C為檢測區。
具體實施方式
實施例l試紙條的組裝
參見圖l、圖2:樣品吸收墊l用玻璃棉制成，結合物釋放墊層2 為吸附有萊克多巴胺的金標載體蛋白標記物的纖維層，根據可按下面 制備方法，制備包被有萊克多巴胺金標抗體纖維層，簡稱萊克多巴胺 膠體金標記物，3為反應膜層，本實施例采用硝酸纖維素膜，4吸水 墊為吸水材料層制成，5為檢測區包被有萊克多巴胺-載體蛋白偶聯 物，6為質控區包被有羊抗鼠IgG構成指質控線，7為PVC背襯為支持 層，用塑料薄片條制成，在PVC背襯上按順序粘附硝酸纖維素膜、吸水墊、結合物釋放墊和樣本墊，將樣本墊覆蓋在結合物釋放墊二分之
一處，8-l為白色保護膜，覆蓋在樣品吸收墊和結合物釋放墊上，在 樣品吸收墊和結合物釋放墊交界處對應保護膜8-l位置偏向于樣品吸 收墊一方0.5cm處印有標記線9， 9的右端印有箭頭及max字樣，濾紙 層4即為吸水層(手柄端)上覆蓋有淺藍色保護膜8-2。
要制成萊克多巴胺快速檢測試紙卡首先需制備偶聯萊克多巴胺 載體蛋白，制備檢測線，制備膠體金，用于制備金標抗體纖維，其次 須制備羊抗鼠IgG抗體，用于制作質控線。以下是相關材料的制備方 法
1.萊克多巴胺載體蛋白的偶聯
l.l制備萊克多巴胺半抗原
萊克多巴胺半抗原6g萊克多巴胺，12g琥珀酸酐和8.7ml三乙 基氨用100ml吡啶溶解。回流一小時。減壓蒸餾去溶劑，殘余物用5 %NaHC03水溶液溶解，用乙醚洗滌兩次，然后用H2S04進行酸化(pH 到2.0)，用水洗滌固形物(為三氯乙基半琥珀酸酯)兩次，用氯仿-乙烷使其結晶(產量約75%,熔點(88℃~89℃)。取2.5g半琥珀酸 酯溶于6.5ml亞硫酰氯中，65℃加熱30分鐘。減壓蒸發，干燥l小時 (高度真空條件下)。將上述產物溶于15mlN，N-二甲基-乙酸乙酰胺 中，室溫攪拌2小時。65匸真空蒸發后，用異丙醇使結晶析出來，用 溶于二甲基甲酰胺中的鋅和醋酸解離三氯乙酯，得到萊克多巴胺-半琥動酸酯。
1.2萊克多巴胺半抗原與載體蛋白的偶聯
取EDC100mg，用pH8.0的10mmol/LPBS液1.5mL使之充分溶 解(I液)。取萊克多巴胺半琥珀酸酯25mg，用0.5mlDMF溶解(II 液)。取HSA80mg，溶于2ml 10mmol/L PBS ( PH8.0 )液中(III液)。 將II液與III液混合，在磁力攪拌下逐滴加入I液(余下0.5ml)。室溫 下避光攪拌l小時，逐滴加入余下的I液。4度攪拌12小時。靜置
10小時(4度)。用蒸餾水使之充分透析(約48小時)。 1.3萊克多巴胺-載體偶聯物的鑒定
將載體蛋白、萊克多巴胺半抗原、萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物 用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4 PBS調零，用 紫外分光光度計在波長200-800nm范圍內掃描，得到載體蛋白、萊克 多巴胺半抗原、萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物的吸收曲線。三者出現 不同的吸收曲線，表明萊克多巴胺與載體蛋白偶聯成功。
2. 抗萊克多巴胺克隆抗體的制備
2.1動物免疫
將免疫原注入到Balb/c小鼠體內，免疫劑量為80pg/只，使其產 生多克隆抗體。細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按5:1 比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，釆用間接竟爭ELISA法測定細胞上 清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直接到得 到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
2.2細胞凍存和復蘇
將萊克多巴胺的單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成lxl()S個/ml 的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37'C 水洛中速融，離心去除凍存液后，移入培養瓶內培養。
2.3單克隆抗體的制備與純化
將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.4ml/只，7天后腹腔注射萊 克多巴胺的單克隆雜交瘤細胞株c-l-l 5"05個/只，7天后釆集腹水。 用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，純化后的腹水放入-2(TC環境保存。
3. 萊克多巴胺金標抗體和金標標記物的制備
3.1膠體金的制備
用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置磁力加熱棒攪拌 器上攪拌煮沸，每100ml 0.01。/Q氯金酸加入2ml 1。/。檸檬酸三鈉，繼續 煮沸，至液體呈紅色時停止加熱，冷卻至室溫后補足失水。制備好的膠體金外觀應純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期為一個月。 萊克多巴胺單克隆抗體-膠體金標記物的制備
在磁力攪拌下，用0.1M碳酸鉀調膠體金的pH值至8.2，按 l-2嗎/ml抗體膠體金加入抗體萊克多巴胺抗體，繼續攪拌混勻30min， 加入10% BSA至終濃度為1°/。，靜置30min。 12000rpm、4。C離心30min， 棄上清液，沉淀用復溶緩沖液洗滌兩次，用初始膠體金體積1/20的 復溶緩沖液將沉淀重懸，置fC備用，保存60天。
復溶緩沖液用含牛血清白蛋白(BSA) 0.02 0.1%，吐溫-20 0.05~0.2%,維生素C(Vit-C)0.r/。， 0.02MpH9.0的硼酸復溶緩沖液。
4. 羊抗鼠IgG抗體的制備
羊抗鼠抗抗體的制備以山羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫 原對無病原體山羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。
5. 萊克多巴胺快速檢測試紙卡實施檢測原理
當萊克多巴胺檢測試紙卡的樣品吸收墊端滴加待測樣品溶液后， 待檢溶液通過金標抗體棉中的金標抗體一起向反應膜擴散，并最終滲 入濾紙中，擴散過程中檢測萊克多巴胺可與金標抗體相結合，進而封 閉金抗體上萊克多巴胺的抗原結合點，阻止金標抗體與反應膜上偶聯 萊克多巴胺色載體蛋白的檢測印跡結合，不能顯示檢測印跡，而羊抗 鼠IgG抗體則可與金標抗體結合，質控區顯色，形成一條紅色對照印 跡"1"，呈一條印跡為陽性，相反樣本溶液中無萊克多巴胺則不能 阻止金標抗體與纖維素膜上偶聯萊克多巴胺的載體蛋白檢測印跡結 合，檢測區顯示紅色印跡"I "，同樣羊抗鼠IgG抗體也與金標抗體結 合，質控區也顯示紅色對照印跡"I "，形成兩條紅線"II "陰性標 記，如果纖維素膜上沒有紅色標記顯示，則試紙卡無效。 5.萊克多巴胺快速檢測試紙卡檢測實施列操作方法 5.1樣本前處理
動物組織(雞肉、雞肝、豬肉、豬肝)樣本稱取1.0士0.05g勻質過的組織樣本于離心管中，加入lmlPB緩沖液，蓋緊瓶蓋在微沸的水 洛鍋中水洛10min,取出后靜置回至室溫后，取100微升進行點樣檢 測。檢測限為5ng/g。
尿液樣本處理
尿樣本 一般可以直接檢測，當尿液呈渾濁狀態則釆用濾紙過濾 處理后，取100微升進行點樣檢測。
5.2用試紙卡檢測
將樣品用滴管滴入試劑卡孔內，滴力口3滴，加后計時，5 8min內 觀察結果。超過10min樣品檢測判讀無效。
5.3檢測結果分析
萊克多巴胺在樣品中濃度高于5ng/ml時，膠體金標記的萊克多 巴胺抗體與萊克多巴胺全部結合，從而在檢測區內因為竟爭反應不會 與萊克多巴胺偶聯物結合而不出現紅色條帶。陰性樣品在檢測過程中 由于缺少抗體抗原竟爭反應，將會在檢測區與質控區內出現紅色條 帶。
陽性；當質控區顯示一條紅色條帶，而檢測區不顯色，快速檢測 試紙卡以顯示紅線色"1"，判為陽性，如圖3中間圖所示。
陰性當質控區顯示一條紅色條帶，檢測區同時也顯示出一條紅 色條帶，且檢測區顏色接近或淺于質控區時，快速檢測試紙卡以顯示 紅線色為"11"，判為陰性。如圖3左圖所示。
無效當質控區不顯示出紅色條帶，則無論檢測區顯示出紅色條 帶與否，該試紙卡判為無效。如圖3右圖所示。
權利要求1.一種檢測萊克多巴胺藥物殘留的膠體金試紙卡，包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊，其特征在于，結合物釋放墊的部分區域覆蓋于樣品吸收墊之下。
2、 如權利要求1所述的試紙卡，其特征在于，結合物釋放墊的 二分之一區域覆蓋于樣品吸收墊之下。
3、 如權利要求l或2所述的試紙卡，其特征在于，所述反應膜 上具有包被有萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物構成的檢測線印跡"I " 和包被羊抗鼠IgG構成的質控線印跡"I "。
4、 如權利要求3所述的試紙卡，其特征在于，所述的檢測線與 質控線平行。
5、 如權利要求3所述的試紙卡，其特征在于，檢測線位于距離 結合物釋放墊一側0.4cm處。
6、 如權利要求1或2所述的試紙卡，其特征在于，在試紙卡的 兩端分別覆蓋有保護膜。
7、 如權利要求l或2所述的試紙卡，其特征在于，所述底板為PVC板，所述反應膜為硝酸纖維素膜。
8、 如權利要求1或2所述的試紙卡，其特征在于，所述的樣品 吸收墊由玻璃棉或聚酯材料制成。
9、 如權利要求l或2所述的試紙卡，其特征在于，所述的結合 物釋墊層由纖維制成。
10、 如權利要求1或2所述的試紙卡，其特征在于，所述的結合 物釋放墊層包被有抗體-膠體金結合物。
專利摘要本實用新型提供了一種檢測試紙卡，包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊，結合物釋放墊的部分區域覆蓋于樣品吸收墊之下。在反應膜層上具備包被有萊克多巴胺-載體蛋白偶聯物構成的檢測線和包被有羊抗鼠IgG構成指質控線；結合物釋放墊包被有萊克多巴胺的膠體金標記物。采用本實用新型試紙卡是可以延長檢測結果觀察時間，樣品吸收墊也可以將檢測液體充分吸收與金標抗體完全接觸充分反應，再層析至反應膜上進行反應，可以有效的減少誤差。還可以防止檢測樣本中一些干擾成份使金標抗體中的蛋白失去活性，影響金標抗體與包被原的結合。
文檔編號G01N33/558GK201181297SQ200820078839
公開日2009年1月14日 申請日期2008年1月30日 優先權日2008年1月30日
發明者萬宇平, 何方洋, 馮才偉, 馮才茂, 吳小平, 亮 朱, 汪善良, 沈建忠, 趙正苗 申請人:北京望爾生物技術有限公司;北京望爾康泰生物技術有限公司