專利名稱：：一種定量檢測乙型肝炎病毒特異性細胞毒性t淋巴細胞的方法
技術領域：
：本發明屬于免疫檢測領域，屬于一種利用主要組織相容性復合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)—抗原肽五聚體(Pentamer)技術檢測乙型肝炎病毒(HBV)特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的方法。
背景技術：
：我國是HBV感染的高流行區，慢性HBV感染與肝硬化、原發性肝癌的發生有密切關系，但迄今尚無徹底清除乙型肝炎病毒和治愈慢性乙型肝炎(chronicalhepatitisB,CHB)的藥物和方法。造成慢性HBV持續感染的機制，國內外研究公認的最重要的因素是機體缺乏多克隆、強有力的抗HBV特異性CTL免疫應答反應。HBV感染者產生多克隆特異性的CTL應答是清除病毒，尤其是清除肝細胞內病毒最重要的機制。HBV感染后不同個體的免疫學應答模式不同，其臨床轉歸也不同(ThioCL，ThomasDL，KarackiP，etal.ComprehensiveanalysisofclassiandclassIIHLAantigensandchronichepatitisBvirusinfection.JVirol,2003，77:2083-12087.),這是宿主的HLA等免疫遺傳背景和HBV自身特性共同作用的結果。人類MHC首先發現在白細胞表面，故稱其為人白細胞相關抗原(HLA),編碼HLA的基因群稱為HLA復合體。HLA是人體最復雜的遺傳多態性系統，有幾十個基因座位，每個基因座位又有幾十個等位基因。它能夠獨特地結合細胞內多肽并呈遞至細胞表面，進而激活T淋巴細胞，由此形成T細胞對抗原肽和MHC分子的雙重識別，其意義是使T細胞受體(TCR)只能識別自身MHC分子遞呈的抗原，與特異性CTL密切相關的主要是HLA-A類基因，CTL通過識別HLA-1類分子遞呈的HBV抗原表位識別靶細胞，HLA-I類基因的型別和HBV抗原的序列特點，共同決定某一宿主的抗原遞呈細胞將誘導的HBV特異性CTL應答類型。不同HLA-1等位型的個體可以有不同的抗原表位，與抗原肽結合的頻率亦不同。金士正等(金士正，吳國光，藍欲曉，等.廣東漢族人群人類白細胞抗原-A,B及DRB1基因多態性和單倍型分布.廣東醫學,2006,27:11.)在20012004年8月之間，對3275名廣東漢族登記加入中國造血干細胞捐獻者進行HLA分型，發現人群中最常見的HLA-A基因是HLA-All、A2、A24和A33,分布率分別為32.1%、31.9%、14.2%和11.4%。HLA—A2和A24在我國江蘇地區基因頻率達分別高達50.87%和30.56%(梁文飚，薛敏，潘芹芹，等.中華(江蘇)骨髓庫人群HLA-I類抗原的PCR-SSP分型.中國輸血雜志，2005,3:199-201.)。HBV感染肝細胞后，病毒抗原被蛋白酶裂解成小分子寡肽，并與肝細胞內HLA-I類分子結合成復合物，表達到細胞表面，成為T細胞表位。CTL通過表面的CD8+分子與HLA-I類分子產生粘附，并由TCR識別上述的寡肽表位。已有研究顯示特異性CD8+CTL對清除肝細胞內的乙型肝炎病毒發揮著主要的功能(mainiMK，BoniC，HeeCK,etal.Theroleofvirus-specificCD8+cellsin.liverdamageandviralcontrolduringpersistenthepatitisBvirusinfection.JEXPMed，2000，191:1269-1280.)，然而不同臨床類型的乙型肝炎患者的特異性CTL細胞免疫應答狀況也不相同。在急性自限性乙型肝炎患者體內存在多克隆、多特異性CTL，能識別多個抗原靶位，識別范圍廣，應答性強，而在慢性HBV感染患者中體內常呈現特異性CTL的缺乏，特異性CTL只能識別單一抗原耙位，應答范圍窄而弱(WebsterGJM,ReignatS,BertolettiA,etal.IncubationphaseofacutehepatitisBinman:dynamicofcellularimmunemechanisms.Hepatology,2000,32:1117-1124.KakimiK,LaneTE,WielandS,etal.Blockingchemokineresponsivetogamma-2/interferon(IFN)-gammainducibleproteinandmonokineinducedbyIFN-gammaactivityinvivoreducesthepathogeneticbutnottheantiviralpotentialofhepatitisBvirus-specificcytotoxicTlymphocytes.JExpMed,2001;194:1755-1766.SchuurhuisDH,Ioan-FacsinayA,NagelkerkenB,etal.Antigen-antibodyimmunecomplexesimprovedendriticcellstoefficientlyprimespecificCD8+CTLresponseinvivo.JImmunol,2002;168:2240-2246.)。CTL一旦被激活，釋放穿孔素、顆粒酶或者誘導Fas與相應配體結合，引起感染的肝細胞損傷或凋亡；也可在特異抗原刺激下產生IFN-y，促進肝細胞對MHC的表達，使肝細胞對CTL的免疫攻擊敏感。上述機制可以直接殺傷受感染的肝細胞，或釋放抗病毒的細胞因子抑制病毒，尤其是在清除肝細胞內HBV共價閉合環狀DNA(cccDNA)中發揮關鍵作用(SeegerC,MasonW.HepatitisBvirusbiology.MicrobiolMolBiolRev，2000;64:51-68.)。因此，對HBV特異性CTL的數量及其功能研究，對探討乙型肝炎的發病機制和新的治療途徑具有重要的意義。對于HBV感染后的轉歸預測以及如何進行臨床干預和阻斷慢性化一直是臨床治療備受關注的問題。現有的干擾素或者核苷類藥物的抗病毒治療都不能有效抑制HBVcccDNA和清除病毒。限制進行現有治療方案的優化和聯合免疫治療的"瓶頸"問題是，缺乏對慢性乙型肝炎免疫病理機制的正確的認識和有價值的檢測指標。鑒于特異性CTL在免疫發病機制和預測療效和預后方面的特殊價值，目前認為HBV特異性CTL檢測是解決臨床這一瓶頸的重要手段和措施。由于外周血中抗原特異性CTL的數量極低，建立特異性強和靈敏度高的CTL檢測方法是近年來的研究熱點。長期以來抗原特異性CTL的檢測是采用51Cr釋放分析法和有限稀釋法等，它們屬于間接檢測抗原特異性CTL功能的方法，尚需要7天以上的體外培養擴增過程，敏感性較低也很難得到與MHC—致的靶細胞。近年來出現的MHC-肽多聚體可以特異性結合抗原特異性的T細胞，能對特異性CD8+的T細胞進行直接計數。但是外周血單個核細胞中HBV特異性CTL的數量低于1%(Sun-LungTsaia,Tzong-HsienLeeb,Rong-NanChien，etal.AmethodtoincreasetetramerstainingefficiencyofCD8+TcellswithMHC-peptidecomplexes:therapeuticapplicationsinmonitoringcytotoxicTlymphocyteactivityduringhepatitisBandCtreatment.JImmunolMethods.2004Febl;285(l):71-87.),且CTL的活化以及生物學效應都嚴格受MHC-I類分子的限制，用低分辯方法作為篩選HLA基因分型的檢測基礎，對數量極低的CTL來說極有可能影響其檢測結果的準確性。MHC—肽五聚體是人工制備的MHC-1肽復合物，每個五聚體的5個MHC-多肽都能識別并與T細胞亞群中特異性CTL結合，與TCR的親和力大大增加，同時標記5個熒光分子，由于其高親和力，使此技術能夠檢測低親和力的T細胞。通過流式細胞儀的熒光檢測和分揀，不僅可以定量地測定T細胞亞群中特異性CTL的頻數，還可以通過計算特異性CDS陽性細胞分泌IFN-Y的比例來了解其功能。該技術簡便、可靠地檢測特異性CTL的數量和殺傷功能的特性，使其成為研究特異性CTL的免疫功能的重要手段。可溶性-MHC五聚體，相對于以往的四聚體而言，其熒光信號更強，隨C分子與病毒抗原表位之間的結合更為緊密，采用FACS技術直接檢測外周血或者肝組織內特異性CD8>T細胞數量，可以準確地反應體內特異性CD8，細胞的實際情況，而檢測技術往往是準確提示患者體內特異性CTL的數量和功能狀態的基礎Hoffmann等認為MHC-PeptideTetramers(MHC-肽四聚體)對TCR的結合，可以導致T細胞立體空間變化，從而競爭抗-CD3特異性的結合(Hoffmann,T.K.,V.S.Donnenberg，U.Friebe-Hoffmann,etal.Competitionofpeptide-MHCclassItetramericcomplexeswithanti-CD3providesevidenceforspecificityofpeptidebindingtotheTCRcomplex.Cytometry.2000.41:321-328.);Galit等發現CD8抗體可以阻斷MHC-PeptideTetramers(MHC-肽四聚體)與TCR的結合(GalitDenkberg，CyrilJ.Cohen,andYoramReiter.CriticalRoleforCD8inBindingofMHCTetramerstoTCR:CD8AntibodiesBlockSpecificBindingofHumanTumor-SpecificMHC-PeptideTetramerstoTCR1.TheJournaloflmmunology，2001，167:270~276.)，并比較了CD3單克隆抗體和CD8單克隆抗體的加入次序對特異性四聚體檢測結果的影響。因此，目前檢測特異性CTL的方法在特異性、敏感性和穩定性都還有待進一步提咼。
發明內容本發明的目的是提供一種能夠提高檢測的特異性、敏感性和穩定性的定量檢測乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法。本發明是基于Hoffmann以及GalitDenkberg等學者的設計思想并加以進一步優化首先在標記試劑的顏色選擇上采用PE標記的MHC-Pentamer和APC標記的CD8單克隆抗體，在多參數流式細胞檢測中，前者為第二熒光通道，后者為第四熒光通道，第二、四通道之間基本沒有熒光補償；再通過調整設門策略等思想，即利用CD3設門來限制目的細胞只能是T淋巴細胞，排除了單核細胞、CD3'CD8+細胞、死細胞的干擾，用于設門的PercpCY5.5標記熒光是目前非特異熒光染色最少、與上述兩種顏色之間熒光補償最小、重疊熒光最少的標記熒光染料；本發明是利用PE標記的MHC-Pentamer，結合流式細胞術的三色標記多參數分析法對HBV特異性CTL進行定量檢測，旨在減少或者避免CD3單抗及CD8單抗對人HBV特異性CTL檢測的影響，目的是提高特異性CTL檢測方法的特異性、敏感性和穩定性。本發明運用人類白細胞抗原(humanleucoyteantigen,HLA)-A0201型陽性或HLA-A2402型陽性者抗凝外周血，按次序分別加入藻紅蛋白(PE)標記的乙型肝炎核心抗原(hepatitisBcoreantigen,HBcAg)18-27MHC-Pentamer或HBcAgll7-125MHC-Pentamer、葉綠素蛋白偶聯物(PerCPCy5.5)標記的小鼠抗人表面抗原分化群3(clusterofdifferentiation,CD3)以及別藻藍蛋白(APC)標記的小鼠抗人CD8，完成T細胞對抗原肽和MHC分子特異性的雙重識別，裂解紅細胞后運用多參數流式細胞分析技術，采用CD3設門策略，定量檢測乙型肝炎患者外周血中HBcAgMHC-Pentamer和CD8雙陽性細胞即乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)頻數。我們選用在我國漢族人群中具有較高表達率的HLA-A2和HLA-A24基因亞型，使用高分辯序列特異引物聚合酶鏈反應技術對受檢標本的HLA等位基因進行分析，再用特異性MHC抗原一肽五聚體的方法直接分析外周血中HBV特異性CTL的頻數，以最大限度地降低因HLA分型中不完全匹配所造成的CTL檢測率偏差的現狀，動態分析HBV感染患者不同病程中HBV特異性CTL頻數差異，揭示HBV患者體內對特異性CTL在病毒清除中的作用。本發明的目的是通過下列技術措施實現的一種定量檢測乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法，該方法是用HLA-A0201型或HLA-A2402型陽性的乙型肝炎病毒感染者的抗凝外周血，分別與不同熒光素標記的主要組織相容性復合物一抗原肽五聚體、小鼠抗人CD3單克隆抗體及小鼠抗人CD8單克隆抗體共孵育；孵育次序依次為先將熒光素標記的主要組織相容性復合物一抗原肽五聚體與外周血共孵育適當時間，離心，棄去上清，洗滌后再加入熒光素標記的小鼠抗人CD3單克隆抗體和小鼠抗人CD8單克隆共孵育適當時間，經裂解紅細胞、離心洗滌、固定細胞后，在流式細胞儀上利用CD3設門技術，定量檢測乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞。所述的方法，其中熒光素標記采用如下方式主要組織相容性復合物一抗原肽五聚體采用藻紅蛋白標記，小鼠抗人CD3單克隆抗體采用葉綠素蛋白偶聯物標記，小鼠抗人CD8單克隆抗體采用別藻藍蛋白標記。所述的方法，其中藻紅蛋白為PE，葉綠素蛋白偶聯物為PerCPCY5.5，藻藍蛋白為APC。所述的方法，其中采用HLA-A0201型陽性的患者抗凝外周血時，主要組織相容性復合物一抗原肽五聚體采用HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體；采用HLA-A2402型陽性的患者抗凝外周血時，主要組織相容性復合物一抗原肽五聚體采用HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體。所述的方法，其中HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體的氨基酸序列為PheLeuProSerAspPhePheProSerVal;HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體的氨基酸序列為GluTyrLeuValSerPheGlyValTrp。所述的方法，其中共孵育溫度均為22-25'C，孵育時間為20min,避光反應。所述的方法，其中洗滌液采用pH為7.2含0.1。/。(w/v)的牛血清白蛋白的PBS。所述的方法，其中設門是采用以下方式進行的根據流式細胞儀的前向散射光和側向散射光雙參數點圖，設R1"門"圈出樣本中淋巴細胞群體，再設R2"門"圈出R1門中CD3陽性的群體，目的是將檢測細胞的范圍縮小到T淋巴細胞，而不是整個的外周血單個核細胞或所有的淋巴細胞，用CellQuest軟件定量分析MHC-抗原肽五聚體-PE及CD8—APC雙陽性細胞的百分率，即為乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的檢測頻數。所述的方法，其中要求在細胞固定后的3h-20h之間的時間范圍內進行流式細胞儀檢測，并獲取30萬個細胞，以保證檢測結果的準確性。所述的方法，其中以T淋巴細胞設門，計算R2"門"內MHC-抗原肽五聚體和CD8雙陽性的細胞數，HLA-A0201陽性HBV感染者檢測HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體與CD8雙陽性的細胞為其特異細胞毒性T淋巴細胞頻數，HLA-A2402陽性HBV感染者檢測HBcAgI17-125MHC-抗原肽五聚體與CD8雙陽性的細胞為其特異性細胞毒性T淋巴細胞頻數；特異細胞毒性T淋巴細胞率(％)=MHC抗原肽五聚體和CD8雙陽性的細胞數除以CD8陽性細胞數X100Q/c)。(是看CD8中的比例。CD3只是設門，保證細胞的相對純度)本發明的CTL檢測方法，更換不同的MHC-Pentamer時，可以對不同感染性疾病的特異性CTL進行檢測，如丙型肝炎病毒、巨細胞病毒、艾滋病病毒感染等，具有方法學的通用性。本發明的CTL檢測方法，除了用于檢測外周血中特異性CTL外，也可對不同組織細胞中特異性CTL進行檢測，具有檢測標本的廣泛性。本發明的CTL檢測方法，還可觀察細胞內細胞因子的表達，如IFN-a、IFN-Y、TNF-a、IL-4等，可以同時完成對特異性CTL的數量和功能研究。本發明的術語解釋如下CTL:細胞毒性T淋巴細胞，其特征是表達特異性抗原五聚體的殺傷性T淋巴細胞，即通常所說的MHC-Pentamer/CD8雙陽性細胞，HBV特異性CTL應答是清除病毒，尤其是清除感染肝細胞內病毒最重要的環節。HBcAgl8-27MHC-Pentamer或HBcAgll7-125MHC-Pentamer:主要組織相容性復合物-乙型肝炎核心抗原肽-五聚體，來源屬于商品化的現有技術。孵育即細胞與抗體或標記試劑的反應過程，細胞需要在一定PH和離子強度的反應液中，并維持一定的溫度和時間才能與相應的抗體等結合。洗滌用0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)含0.1%的牛清白蛋白(BSA)，500g離心5min,棄去上清，目的是去除細胞懸液中的細胞碎片或多余的標記抗體及游離的熒光素等。設門是流式細胞檢測技術中的術語，即根據細胞的體積大小和顆粒的多少，或結合細胞顏色的標記技術，圈定出待檢標本中目的細胞群的一種方法。本發明的有益效果.-1.利用流式細胞儀的分揀體系，運用流式細胞術的三色標記、多參數分析法對HBV特異性CTL進行定量檢測，采用CD3(T淋巴細胞的表面標志)設門策略，以純化目的細胞，從而來減少外周血中其它細胞群體的影響，降低了背景染色，使結果更可靠，有效地降低了Pentamer非特異性結合。2.按一定的次序先后加入三種標記試劑，從而避免了由于MHC-Pentamer和CD3抗體競爭結合TCR復合物的可能，同時避免了CD8抗體可以阻斷MHC-Pentamer與TCR的結合的現象，該步驟是本技術的主要特色。3.在標記試劑的顏色選擇上采用PE標記的MHC-Pentamer、PercpCy5.5標記的CD3單克隆抗體和APC標記的'CD8單克隆抗體，在多參數流式細胞檢測中，前者為第二熒光通道，后者為第四熒光通道，第二、四通道之間基本沒有熒光補償，而用于設門的PercpCy5.5-CD3與上述兩種顏色之間也是熒光補償最小，重疊熒光最少的標記熒光。4.直接應用抗凝外周血進行HBV特異性CTL檢測，既不需要分離外周血單個核細胞也不需要體外培養等繁瑣的操作，可以真實地反應各型乙型肝炎患者體內特異性CTL的動態變化以及患者體內對抗原表位特異性CTL頻率的差異，它不僅能夠靜態地評價乙型肝炎患者的特異性細胞免疫功能，而且為開展特異性細胞免疫治療和抗病毒藥物治療的療效評估和動態觀察提供了臨床可行的檢測方法，具有取材方便病人痛苦小而易于接受等優點。5.應用多參數流式細胞術，不僅可以對HBV特異性CTL的數量進行研究，還可以結合特異性CTL的功能分析，能夠更深入地揭示特異性CTL與肝臟病理損傷以及HBV清除的機制。6.檢測結果對臨床的指導作用包括不同HBV感染狀態或臨床類型病人特異性細胞免疫功能的檢測指標；抗病毒治療或免疫治療后的療效評估及預后判斷；抗病毒治療或免疫治療后的免疫評估指標及臨床轉歸的檢測指標。本發明可揭示特異性CTL應答與感染轉歸的關系，建立HBV感染后的轉歸評估，供臨床醫生參考。并可用于探索特異性CTL應答與藥物療效之間的關系，比較慢性乙型肝炎病人不同治療方法對特異性CTL的影響，從而建立乙型病毒性肝炎的治療療效評估。7.本發明方法不僅避免了CD3單克隆抗體和CD8單克隆抗體競爭抑制MHC-五聚體與TCR的結合，還使檢測背景清晰，確保了檢測結果的特異性和敏感性。本發明在更換特異性MHC-肽五聚體后，可廣泛用于臨床多種病毒感染性疾病的特異性CTL檢測，具有檢測方法的通用性。圖l:HBV特異性CTL設門策略圖。圖1A:前向散射光和側向散射光雙參數點圖，其中Rl門中為淋巴細胞群體；圖1B:為CD3設門圖，其中R2門中為T淋巴細胞；圖1C:為未經CD3設門，圖中細胞來自于Rl門，其中右上象限即五聚體和CD8雙陽性細胞中可能含有T淋巴細胞陰性的其它細胞；圖1D:采用CD3設門策略，圖中細胞來自于R1門和R2門，右上象限即五聚體和CD8雙陽性細胞即為特異性CTL。圖2:CD3設門對HBV特異性CTL檢測結果的影響，患者為一例急性乙型肝炎。圖2A:為未用PerCPCy5,CD3單抗標記的CTL檢測結果；圖2B:為用PerCPCy5.-CD3單抗標記后的CTL檢測結果。圖3:標記試劑的加樣次序對HBV特異性CTL檢測結果的影響，患者為同時表達HLA-A0201和HLA-A2402等位基因的雜合子的急性乙型肝炎。圖3A、圖3B:為同時加入MHC/Pentamer-PE、小鼠抗人CD3-PercpCy5.5及小鼠抗人CD8-APC標記后的結果；圖3C、圖3D:為先加入MHC/Pentamer-PE后同時加小鼠抗人CD3-PercpCy5.5及小鼠抗人CD8-APC的結果；其中圖3A、圖3C為HBcAg18-27CTL結果，圖3B、圖3D為HBcAg117-125CTL結果。具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。實施例l:本發明的檢測過程1.HLA-A2、HLA-A24基因亞型標記目的是對乙型肝炎患者進行HLA-A2、HLA-A24基因亞型初篩，檢測按說明書要求進行方法是在對照管中分別加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的小鼠抗人免疫球蛋白Gl(IgGl)-和藻紅蛋白(PE)標記的小鼠抗人IgGl各10iU，試劑均為美國BD公司產品；在檢測管中分別加入小鼠抗人HLA-A2-FITC(試劑為美國BDPharmingen公司產品)10y1和小鼠抗人HLA-A24-PE10u1(試劑為日本MBL公司產品)混勻后22—25'C避光孵育20-30min，以3ml0.01MpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)含0.1%的牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA),500g離心5min，棄去上清，再以每分鐘1000轉速振蕩30秒以重懸細胞；每管各加入lml紅細胞裂解液(美國BD公司產品)，充分混勻后22—25'C避光反應10-12min，以裂解紅細胞并保護及維持白細胞膜的穩定，500g離心5min，棄去上清，再用pH7.2PBS含0.1%的BSA洗滌2次，去除上清。2.FACS分析HLAA2、HLA-A24基因亞型標記好的標本立即在流式細胞儀(FluorescenceActivatedCellSorting,FACS)上檢測，用CeIIQuest軟件分析淋巴細胞表達HLA-A2和HLA-A24分子的百分數，凡HLA-A2表達率》50%或者HLA-A24》80%者則認為是陽性，選取陽性標本進一步作HLA-A0201和HLA-A2402等位基因的高分辨分析，初選陰性的HBV感染者作為實施對象的對照組。3.HLA-A0201和HLA-A2402等位基因序列特異引物聚合酶鏈反應高分辯方法分析(1)模板DNA抽提試劑購自美國QUIGEN公司小提商品化成套試劑盒，貨號為Cat.No.12143，操作嚴格按試劑盒說明書進行，具體為取經過HLA流式細胞術初篩確認的枸櫞酸鈉抗凝全血200u1和20^1蛋白酶K混勻于1.5ml離心管中，再加入AL液200(al，混勻后56'C反應10min,加入200jal無水乙醇，再次混勻后將其移入過濾柱子中，6000g離心lmin，棄去收集管；加入AW1液500(il，6000g離心lmin，棄去收集管，加入AW2液500ial，20000g離心3min進行過柱；將柱子放入1.5ml離心管中，加入20(V1三蒸水，室溫靜置lmin，6000g離心lmin，收集過柱內容，此即為抽提的模板DNA溶液。(2)DNA的濃度測定及純度判定取DNA溶液用三蒸水做適量稀釋，以三蒸水液作空白對照，在紫外分光光度計上讀取A260和A280的光密度值。按下面公式計算濃度DNA濃度Og/ial)-A260X50X稀釋倍數/1000。DNA純度的判定A260/A280比值在1.7-2.0之間為DNA純度良好，如純度小于1.7或大于2.0則視為蛋白質或RNA污染，應重新提取DNA。(3)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增序列特異引物聚合酶鏈反應高分辯方法試劑均為美國Invitrogeng公司提供的商品化成套試劑盒(LocusSSPUniTray，Highresolutionkits,貨號為LOT:008Batch:27463),操作嚴格按廠家以下說明書進行其反應總體積為23ul，包括正向及反向引物各2(2.5pmol/ul)，熱啟動Taq酶0.5"1(5U/U1)，Taq酶緩沖液(10X)2ul，dNTPs0.5y1(lOmM)'PCR專用zK6ul，模板DNAIO"1，將上述反應體系加入96孔中進行PCR反應，每孔5nl，放入PCR儀中，96'Cl分鐘1個循環，96'C25秒、70。C50秒、72'C45秒5個循環，96'C25秒、65。C50秒、72°C45秒21個循環，96'C25秒、55'C60秒、72°C120秒4個循環，循環結束后PCR反應產物在4'C冰箱中保存。(4)PCR產物瓊脂糖凝膠電泳PCR反應結束后將產物進行凝膠電泳，以確定HLA等位基因，首先制備瓊脂糖凝膠稱取lg瓊脂糖，置于三角瓶中，力Q入50mL0.5XTBE緩沖液，隔水加熱全部融化后，取出搖勻，將冷卻至65'C左右的瓊脂糖凝膠液，小心倒入凝膠制備槽中，使凝膠液緩慢展開，直到在整個制備槽中形成均勻的膠層，室溫下靜置30min,待凝固完全后，輕輕拔出樣品槽模板，取PCR產物10ul分別加入膠板的樣品小槽內，準備進行電泳，樣品進膠前電流控制在20mA,樣品進膠后電壓控制在60—80V，電流為40—50mA。當指示前沿移動至距離膠板1一2cm處，終止電泳，將電泳后的膠板在溴乙錠染色液中染色后，在波長為254nm的紫外燈下，觀察瓊脂糖凝膠中的DNA條帶，DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶者，與標準條帶的電泳圖譜進行比對，確認為HLA-A0201型或HLA-A2402型陽性結果的病人作為本發明檢測的實施對象。4.HBV特異性CTL標記在確定患者HLA等位基因為A0201型或HLA-A2402型以后，按以下次序對樣本進行CTL的特異性標記取HLA等位基因為A0201型患者的新鮮肝素抗凝外周血300ul，加入PE標記的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)18-27MHC-PentamerlO(il，其氨基酸序列為PheLeuProSerAspPhePheProSerVal，如為HLA-A2402型陽性患者的抗凝外周血則加入PE標記的HBcAg117-125MHC-Pentamer10(il(試劑均為英國Proimmune公司產品)，其氨基酸序列為GluTyrLeuValSerPheGlyValTrp，混合在流式檢測專用試管中，22-25'C避光孵育20min，500g離心5min，棄去上清，用pH7.2PBS含0.1%的BSA洗滌1次，再加入PerCPCy5.5標記的CD3單克隆抗體(美國BD公司產品)20pl和APC標記的小鼠抗人CD8單克隆抗體(美國BeckmanCoulter公司產品)20jal，對血液中的T細胞進行特異性標記；混勻后22-25'C避光孵育20min,最后加入3ml紅細胞裂解液(美國BD公司產品)，充分混勻后室溫避光10-12min，(目的是裂解紅細胞并保護及維持白細胞膜的穩定)500g離心5min，棄去上清，用pH7.2PBS含0.1%的BSA洗滌2次，目的是徹底去除上清中裂解的紅細胞碎片及游離的熒光標記試劑，在上述標記試管中加入1%多聚甲醛500ul,目的是固定標記好的白細胞，防止白細胞裂解，4'C保存直至FACS檢測。5.HBV特異性CTL定量分析用流式細胞儀檢測時，根據前向散射光和側向散射光雙參數點圖，按照細胞大小和顆粒多少，先設Rl"門"來圈定出淋巴細胞，再設R2"門"圈出R1"門"中的CD3陽性群體(目的是將檢測細胞的范圍縮小到T淋巴細胞，而非整個的PBMC或所有的淋巴細胞)，用CellQuest軟件統計分析CD8—APC和MHC-Pentamer—PE雙陽性細胞的百分率，即為HBV特異性CTL的檢測頻數，特異細胞毒性T淋巴細胞率(％)-MHC-Pentamer和CD8雙陽性的細胞數除以CD8陽性細胞數X100Y。。固定后的細胞會有一個皺縮的過程，因此，要求在固定后的3h-20h之間的時間范圍內上流式細胞儀檢測，由于外周血中特異性CTL的數量極少，應獲取30萬個細胞以保證結果的準確性。(CD8陽性細胞總數包括圖的右上象限與右下象限的總和)以下比較實施例采用的檢測方法與步驟除了在比較項目上作相應的改變，其余均同實施例1。比較實施例1.FACS檢測時設門與檢測圖形及結果的關系禾IJ用流式細胞儀前向散射光(FSC)和側向散射光(SSC)雙參數點圖，根據細胞的體積大小和顆粒的多少，設Rl"門"先圈出標本中的淋巴細胞群體，目的是排除單核細胞、粒細胞、死細胞、細胞碎片等，再設R2"門"圈出R1"門"中的CD3陽性細胞即為T淋巴細胞，目的是排除B淋巴細胞、NK細胞等，通過CellQuest軟件統計Rl門和R2門中MHC-Pentamer-PE和CD8—APC雙陽性細胞的百分率，作為HBV特異性CTL陽性細胞，以此來限定特異性CTL只是來自于T淋巴細胞，而并非是其它群體細胞與MHC-Pentamer或單克隆抗體的非特異性結合，見圖1A-圖1B;在本實施例中，比較了用或不用CD3設門對特異性CTL檢測結果的差異，經使用優化的設門策略后，去除了T淋巴細胞以外可能與Pentamer結合的其它細胞，明顯提高檢測頻數的特異性，見圖1C-圖1D。比較實施例2.不加CD3單抗對結果的影響目前國內外學者通常使用同時標記MHC-Pentamer和小鼠抗人CD8兩種試劑來檢測特異性CTL，并沒有注意到非CD3陽性細胞與MHC-Pentamer的結合對檢測結果的影響；本實施例中首先比較了加或不加CD3熒光抗體對CTL頻數的差異，結合設門策略，明顯增加了CTL結合的特異性，見圖2A-圖2B，由圖2A左上象限可見，不經CD3染色時，無法采用CD3設門策略，其Pentamer非特異性染色細胞多，檢測背景較深，經CD3設門后的圖2B左上象限情況則明顯改善其非特異性染色細胞較少，背景清晰，圖形美觀。比較實施例3.標記試劑的加入次序對結果的影響由于特異性CTL在外周血中的含量非常低，相對于其它特異性CTL檢測方法而言，MHC-Pentamer是比較敏感的檢測方法，為避免CD3單克隆抗體或CD8單克隆抗體阻斷MHC-肽五聚體與TCR的結合，進一步觀察加樣次序是否對實驗結果的特異性和敏感性有影響，在本實施例中我們對同一份標本分別按以下不同的加樣次序對試驗方法進行優化，其中孵育溫度均為22-25'C，每個步驟的孵育時間為20min,病例數為6例慢性乙型肝炎患者的血清樣本。(1)先加入小鼠抗人CD3-PercpCy5.5后同時加入MHC/Pentamer-PE和小鼠抗人CD8-APC;(2)先加入小鼠抗人CD8-APC后同時加入MHC/Pentamer-PE和小鼠抗人CD3-PercpCy5.5;(3)先加入MHC/Pentamer-PE后同時加入小鼠抗人CD3-PercpCy5.5和小鼠抗人CD8-APC:(4)先加入小鼠抗人CD3-PercpCy5.5和小鼠抗人CD8-APC后加入MHC/Pentamer-PE;(5)同時加入MHC/Pentamer-PE、小鼠抗人CD3-PerCPCy5.5和小鼠抗人CD8-APC。加樣次序對特異性CTL結果的影響歸納為通過對熒光素標記的HBcAg18-27MHC-Pentamer、CD3單抗和CD8單抗按照不同的加樣次序進行組合，其特異性CTL檢測頻數見附表1，采用SPSS11.0統計軟件對表中CTL頻數分析發現加樣次序對CTL檢測結果有明顯影響，其中先加APC-CD8組CTL頻數0.050±0.0405依次低于先加CD3-PerCPCy5.5組0.082±0.062和先加MHC-Pentamer組0.345±0.092;分別將該2組與先加入MHC-Pentamer組相比差異具有統計學意義(分別為,=-7.567,尸=禱/，W.肌尸-O，),上述結果提示CD3單抗和CD8單抗都可以抑制MHC-Pentamer與TCR的結合，其中以CD8單抗對MHC-Pentamer的競爭抑制作用更明顯，從而使特異性CTL頻數明顯下降；同時加入MHC-Pentamer-PE、小鼠抗人CD3-PerCPCy5.5及小鼠抗人CD8—APC組其CTL頻數0.203±0.045低于先加入MHC-Pentamer-PE后同時加入小鼠抗人CD3-PerCPCy5.5及小鼠抗人CD8-APC組0.305±0.084,同樣具有統計學差異(t=2.892，P=0.034)，再次證實CD3單抗和CD8單抗對MHC-Pentamer的抑制作用；因此，我們采用先加入PE標記的MHC-Pentamer與檢測樣品共孵育20min后，再加入小鼠抗人CD3-PerCPCy5.5和小鼠抗人CD8-APC孵育20min的標記方法，作為臨床檢測HBV特異性CTL的使用方案。部分結果見圖3。表1:加樣次序對HBV特異性CTL的影響(6例慢性乙型肝炎的血清樣本)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>比較實施例4.不同MHC-肽Pentamer復合物對實驗要求的差異本發明顯示，不同HLA等位基因患者的外周血，對HBV特異性CTL檢測條件相似，它們同樣受到標記試劑的加樣次序以及CD3設門的影響，圖3顯示的是同時表達HLA-A0201和HLA-A2402雜合子的一例急性乙型肝炎患者外周血，其標記試劑的加樣次序和設門策略對HBV特異性CTL檢測結果影響的實例。比較實施例5.不同的HLA基因亞型及HBV感染與否樣本的比較實驗除HLA基因型陰性的樣本分別采用PE標記的HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體及PE標記的HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體檢測外，其他樣本操作方法同實施例1,結果見表2。由表2可見(1)在HLA基因亞型的比較實驗中，我們設立了三組檢測對照即HLA-A0201或HLA-A2402陽性的健康人(無HBV感染)、HLA-A2或HLA-A24陰性的健康人和HLA-A2或HLA-A24陰性的乙型肝炎患者(包括急性或者慢性)，上述三組對照樣本都檢測不到這2個表位的CTL。經SPSS11.0統計軟件將上述樣本結果與HLA分型對應的急性乙型肝炎或慢性乙型肝炎患者的結果比較分析，P值均大于0.05;說明不同MHC的HBV特異性CTL沒有交叉，表明我們所建立的MHC-抗原肽五聚體的檢測方法具有很好的特異性。(2)HLA-A0201或HLA-A2402陽性的急性乙型肝炎患者，相對應的特異性CTL均為高表達，說明急性乙型肝炎患者體內較高的特異性CTL,有利于病毒的及時清除。(3)HLA-A0201或HLA-A2402陽性的慢性乙型肝炎患者體內特異性CTL頻數明顯低于急性乙型肝炎，差異具有統計學意義(兩者分別為t=3.279,P=0.008和t=-3.405，P-0.027(前者表示A0201，后者為A2402),這種特異性CTL的低下，可能是造成病毒持續感染的重要原因之表2.不同類型樣本HBV特異性CTL檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表中第l，2，3，4各組之間相比P值均大于0.05;第7，8，9，IO各組之間相比P值均大于0.05，均未見統計學差異。其它沒有統計意義數值是1組和2組比1=-2.569,P=0.062，1組和3組比t=-1.24，P=0.283，1組和4組比t=-0.749，P=0.495，2組和3組比t=0.877，P=0.43;7組和8組比t=-2.419，P=0.075，7組和9組比t=-1.668,P-0.171,7組和10組比t;1.270，P=0.245，8組和9組比t=1.367，P=0.243。序列表〈110〉南京醫科大學第一附屬醫院〈120〉一種定量檢測乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法<160>2<210〉1〈211〉10〈212〉PRT<213>HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體<400>PheLeuProSerAspPhePheProSerVal1510<210>1<211>9〈212〉PRT<213>HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體<400>GluTyrLeuValSerPheGlyValTrp1權利要求1.一種定量檢測乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法，其特征在于，用HLA-A0201型或HLA-A2402型陽性的乙型肝炎病毒感染者的抗凝外周血，分別與不同熒光素標記的主要組織相容性復合物—抗原肽五聚體、小鼠抗人CD3單克隆抗體及小鼠抗人CD8單克隆抗體共孵育；孵育次序依次為先將熒光素標記的主要組織相容性復合物—抗原肽五聚體與外周血共孵育適當時間，離心，棄去上清，洗滌后再加入熒光素標記的小鼠抗人CD3單克隆抗體和小鼠抗人CD8單克隆共孵育適當時間，經裂解紅細胞、離心洗滌、固定細胞后，在流式細胞儀上利用CD3設門技術，定量檢測乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞。2、根據權利要求1所述的方法，其中熒光素標記采用如下方式主要組織相容性復合物一抗原肽五聚體采用藻紅蛋白標記，小鼠抗人CD3單克隆抗體采用葉綠素蛋白偶聯物標記，小鼠抗人CD8單克隆抗體采用別藻藍蛋白標記。3、根據權利要求2所述的方法，其特征在于藻紅蛋白為PE，葉綠素蛋白偶聯物為PerCPCY5.5,藻藍蛋白為APC。4、根據權利要求1所述的方法，其特征在于采用HLA-A0201型陽性的患者抗凝外周血時，主要組織相容性復合物一抗原肽五聚體采用HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體；采用HLA-A2402型陽性的患者抗凝外周血時，主要組織相容性復合物一抗原肽五聚體采用HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體。5、根據權利要求4所述的方法，其中HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體的氨基酸序列為PheLeuProSerAspPhePheProSerVal;HBcAg117-125MHC-抗原肽五聚體的氨基酸序列為GluTyrLeuValSerPheGlyValTrp。6、根據權利要求1所述的方法，其特征在于共孵育溫度均為22-25'C，孵育時間為20min，避光反應。7、根據權利要求1所述的方法，其特征在于洗滌液采用pH為7.2含0."/。(w/v)的牛血清白蛋白的PBS。8、根據權利要求1所述的方法，其特征在于設門是采用以下方式進行的根據流式細胞儀的前向散射光和側向散射光雙參數點圖，設R1"門"圈出樣本中淋巴細胞群體，再設R2"門"圈出RI門中CD3陽性的群體，目的是將檢測細胞的范圍縮小到T淋巴細胞，而不是整個的外周血單個核細胞或所有的淋巴細胞，用CellQuest軟件定量分析MHC-抗原肽五聚體-PE及CD8一APC雙陽性細胞的百分率，即為乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的檢測頻數。9、根據權利要求1所述的方法，其特征在于要求在細胞固定后的3h-20h之間的時間范圍內進行流式細胞儀檢測，并獲取30萬個細胞，以保證檢測結果的準確性。10、根據權利要求1或8所述的方法，其特征在于以T淋巴細胞設門，計算R2"門"內MHC-抗原肽五聚體和CD8雙陽性的細胞數，HLA-A0201陽性HBV感染者檢測HBcAg18-27MHC-抗原肽五聚體與CD8雙陽性的細胞為其特異細胞毒性T淋巴細胞頻數，HLA-A2402陽性HBV感染者檢測HBcAgl17-125MHC-抗原肽五聚體與CD8雙陽性的細胞為其特異性細胞毒性T淋巴細胞頻數；特異細胞毒性T淋巴細胞率(％)=MHC抗原肽五聚體和CD8雙陽性的細胞數除以CD8陽性細胞數X100°/。。全文摘要本發明屬于免疫檢測領域，公開了一種定量檢測乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞的方法。該方法用HLA-A0201型或HLA-A2402型陽性的乙型肝炎病毒感染者的抗凝外周血，按一定順序分別與不同熒光素標記的主要組織相容性復合物—抗原肽五聚體、小鼠抗人CD3單克隆抗體及小鼠抗人CD8單克隆抗體共孵育適當時間，經裂解紅細胞、離心洗滌、固定細胞后，在流式細胞儀上利用CD3設門技術，定量檢測乙型肝炎病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞。本發明能提高檢測特異性CTL的特異性、敏感性和穩定性。文檔編號G01N33/576GK101424692SQ20081024372公開日2009年5月6日申請日期2008年12月12日優先權日2008年12月12日發明者萬玉峰,源劉,山盧,周東輝,孔練花,軍李,邢益平,韓亞萍,黃祖瑚申請人:南京醫科大學第一附屬醫院