專利名稱：一種花生或河蝦過敏原快速檢測傳感器的制備及應用的制作方法
技術領域：
一種花生或河蝦過敏原快速檢測傳感器的制備及應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
食品過敏原的安全問題已引起廣泛的關注，其潛在的過敏原性是急需研究 的新課題。過敏癥是在全世界廣泛流行的一類常見變態反應性疾病，由于其癥 狀復雜，種類繁多，危害廣泛且難以根治，成為長期以來醫學界的一大難題。
在過去的20年里，過敏癥發病率顯著上升，隨著轉基因作物的推廣和轉基因食 品的普及，食品過敏原已成為食品安全隱患之一。但由于科技進步、管理水平 和社會發展的不平衡，對食品過敏原的安全問題的理解在不同國家、不同地區 各不相同，公眾對它的認同意識也有較大差異。我國對食品過敏的研究和關注 與國外發達國家相比也有較大差距，但隨著經濟的發展和人民生活水平的提高， 人們對過敏癥的關注和重視大為提高。
花生油料作物是一常見過敏食品。世泰教授在我國常用食品致喘40例分析 中指出，花生等油料作物居過敏原的前列。花生過敏通常會產生嚴重的變態反 應，有時會引起致命性的休克并危及生命。研究表明，食物過敏人群中有30%的 人對花生過敏，花生所引起的過敏嚴重影響了部分人群的生活質量。在英國總 人口中，0.5% 1.0%的人口患有致命危險的食物過敏癥，而0.5%的人口是對堅 果和花生產生過敏的。美國的研究表明，1.1%的美國人對花生過敏，其中包括 占總人口數0.4%的兒童和0.7%的成年人。在法國的一項包括54名新生兒(小于 lld)和71名嬰兒(11d到4個月)調查中發現，8%的兒童對花生的皮試實驗呈現 陽性。中國協和醫科大學變態反應科通過對就診人群的調査表明，北京約4%的 食物過敏患者對花生過敏。與此同時，相對于其他過敏原，如牛奶、雞蛋而言， 花生過敏通常是終生的，只有10%的過敏兒童會隨年齡的增長產生耐受性。
海產品是另一種常見的致敏性食物，它在各個年齡段的人群中都可發生， 沒有年齡的特異性。海產品中蝦類等甲殼類動物在海產品中引起過敏疾病比較 普遍。它的過敏原主要是存在于肌纖維中的一種原肌球蛋白(Penal)，分子量 34 36kD，等電點為4.5，現己確定幾種軟體動物的過敏原均為原肌球蛋白，它們 之間具有交叉反應特性，甲殼類動物的主要過敏原也是原肌球蛋白，但其中還有 其它的含有原肌球蛋白中具致敏特性的蛋白小肽段。我國學者賴荷等報道中國 羅氏蝦除Penal夕卜，還含有分子量為78.2kD、 66.2kD、 46.5kD的幾種過敏原，他們食物過敏在相當大的程度上危害著過敏人群的健康，保護消費者食品安全 已經成為食品安全管理部門及食品生產企業所面臨的重要問題。它是食品安全 領域的 -個重要方面，其檢測日益顯出重要的意義。現在，雖有許多過敏原檢 測方法可供借鑒，但在具體應用上都存在著各自不同的問題。
體內實驗方法(雙盲安慰劑對照的食物攻擊試驗以及皮膚試驗)可提供最為 直接的證據，但由于安全因素等方面的考慮，只有在不得已的情況下在醫院進 行，而且費用昂貴、風險大；與此相比，體外實驗方法，主要包括組胺釋放實 驗，放射過敏原吸附實驗，酶標記過敏原吸附實驗，熒光和化學發光標記的檢 測技術，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，免疫印記試驗及CAP變應原檢測系統等有 著方便，安全等優點，但卻存在著準確性差的缺點。
我們研制的此傳感器是一種壓電免疫傳感器，其原理是石英晶片在振蕩電 路中振蕩時有一個基礎頻率，當樣品中的抗原或抗體與包被在晶片上的抗體或 抗原結合時，由于負載增加，晶片的振蕩頻率會相應減少，其減少值與吸附質 量有相關性。這種相關性可用sauerbrey方程表示，即AF二-KF、AM/A,式中 △F為晶體吸附外來物質后振動頻率的變化(Hz)， K為常數，等于2.26xl(T6， AM 為晶片的質量變化值(g)， A為有效壓電面積(cm2)， F為晶片的基礎頻率(Hz)， 它表明晶體表面的質量變化(AM)與其引起的晶體諧振頻率變化(AF)之間存在 簡單的線性函數關系。如果設法將晶體選擇性地吸附待測物，便能制備壓電傳 感器，先將抗原或抗體涂布在晶體表面，測得一個基礎的頻率F,，然后將其放 到待測氣體或液體中，使其與被測物發生抗原一抗體反應形成復合物，對吸附 被測物后的晶體再進行頻率檢測得到頻率F2，根據頻率變化AF^F2-F,，就可得
到待測物的量。
發明內容
本發明的目的是提供一種花生或河蝦過敏原快速檢測傳感器的制備及應 用，本發明以抗原抗體免疫反應和壓電型傳感技術為基礎，建立了食品過敏原 的壓電型免疫傳感快速檢測方法，成功建立了快速、特異、靈敏的檢測花生或 河蝦過敏原的檢測傳感器。
本發明的技術方案 一種花生或河蝦過敏原快速檢測傳感器的制備方法 以抗原抗體免疫反應和壓電型傳感技術為基礎，建立了食品過敏原的壓電
型免疫快速檢測傳感器，該檢測傳感器由CHI400C型電化學工作站，三電極體 系鉑電極作為輔助電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，金電極需經修飾作為修 飾電極、再經包被抗體作為工作電極，金電極修飾和包被抗體的過程為； (1)電極的清洗
金電極是傳感器的主要元件；0=4mm金電極用Piranha溶液清洗10min， 保證金電極表面的清潔和高疏水性，然后依次用水和乙醇各清洗3次，利用三電極系統在電化學工作站儀器CHI400C上進行掃描驗證；將清洗過的電極在
0.5mol/L的H2SO4溶液中于-0.8V 0.9V范圍內進行循環伏安掃描至穩定，掃描 后的電極再用超純水清洗十凈，晾干后在4"C條件下保存待用； (2)電極的修飾
向檢測反應池中分別注入濃度為20mM戊二醛的50%乙醇溶液、濃度為 20mM的L-半胱氨酸L-Cys的50%乙醇溶液和濃度為20mM的1， 6-己二硫醇 (HDT)的50%乙醇溶液，室溫下靜置L5h，然后用超純水清洗0.5h，晾干后 將電極放入2.5mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)4+0.1mol/L KNO3+0.01mol/L PBS溶 液中于-lV lV范圍內循環伏安掃描至穩定，掃描后的電極再用超純水清洗干 凈后繼續浸泡在納米金溶膠中自然沉積，于室溫下過夜；
所述納米金溶膠的配置用新制雙蒸水配制lOOmL質量濃度為0.01%氯金 酸溶液，置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸，在100r/min磁力攪拌下， 迅速加入預先在37。C保溫的質量濃度1%檸檬酸三鈉溶液4.5mL，保持溫度和轉 速不變，繼續攪拌加熱15min，直至溶液呈現清亮的酒紅色，室溫冷卻，4'C冰 箱保存備用；
G)電極的包被抗體
花生或河蝦經正己垸4。C浸提過夜，冷凍離心，收集上清液；用30%-50% 飽和度硫酸銨沉淀的蛋白質組分溶解在PBS中，分別加硫酸至pH 5.2或pH4.5 等電點，離心后沉淀物溶解在PBS中，分別得花生過敏原或河奸過敏原；
花生或河蝦過敏原免疫得到檢測抗體；修飾后的電極超純水沖洗后浸泡 30min，花生抗體用PBS緩沖液以1:4000稀釋或河蝦抗體用PBS緩沖液以1:6000 稀釋，作為包被液，包被溫度4°C，包被時間3h，包被后的電極用超純水沖洗 后浸泡30min，再在ly。BSA37"C下浸泡3h，超純水清洗。
所述方法制備的花生或河蝦過敏原快速檢測傳感器的應用方法
(1)待測液制備
(a)花生或含花生樣品待測液制備
稱取花生或含花生樣品30g，按重量體積比g/mL為1 : IO浸入正己烷中脫 脂，4'C浸提過夜，冷凍離心，收集上清蛋白浸液；10mL蛋白浸液緩慢加至質 量終濃度30%飽和硫酸銨，4t:下靜置過夜，離心使沉淀，對上層清液再緩慢加 至質量終濃度50°/。飽和硫酸銨，靜置30min，離心，將30%-50%飽和度沉淀的 蛋白質組分溶解在PBS中，加硫酸至pH5,2等電點，離心后沉淀物溶解在PBS 中，裝入透析袋對蒸餾水透析4h，期間換透析液一次，然后轉至PBS中繼續透 析，即得花生過敏原待測液；取待測液lmL加入傳感器反應池中進行檢測；
或(b)河蝦或含河蝦樣品
稱取去頭去殼的新鮮河蝦或河蝦樣品30g，組織搗碎后浸提，等電點沉淀的pH值為4.5;其他步驟同(a)花生的處理，得河蝦過敏原待測液；取待測液lmL 加入傳感器反應池中進行檢測；
(2)檢測利用二電極系統在電化學工作站儀器CHI400C上進行檢測，在 檢測反應池中加入過敏原待測液，檢測時間為500s。
相關性用sauerbrey方程表示，即AF二-KF、AM/A，式中AF為晶體吸附 外來物質后振動頻率的變化(Hz)， K為常數，等于2.26x10—6， AM為晶片的質 量變化值(g)， A為有效壓電面積(cm2)， F為晶片的基礎頻率(Hz)。
本發明的有益效果本發明以抗原抗體免疫反應和壓電型傳感技術為基礎， 建立了食品過敏原的壓電型免疫傳感快速檢測方法，成功建立了快速、特異、 靈敏的檢測花生或河蝦過敏原的檢測傳感器。
圖l花生過敏原濃度-頻率變化的曲線圖。
圖2河蝦過敏原濃度-頻率變化的曲線圖。
具體實施例方式
實施例1:花生過敏原的檢測
1、 前處理
稱取花生30g，熱燙去紅衣，組織搗碎機搗碎得花生粉末。將花生粉末按l
:10 (W/V)浸入正己垸中脫脂。用預冷的PBS、 B-巰基乙醇和EDTA.2Na混合 溶液將花生脫脂粉高速搗碎10min， 4"C下靜置過夜，浸提液冷凍離心后去沉淀， 收集上清液。取10mL花生蛋白浸液緩慢加入30%飽和硫酸銨，4t:下靜置過夜， 離心所得沉淀即為30%飽和度硫酸銨沉淀組分。對上清液緩慢加至50%硫酸銨， 靜置30min，離心得到50%飽和度硫酸銨沉淀。將30%-50%飽和度沉淀的蛋白 質組分溶解在PBS中，力[]"/c(v/v)的硫酸溶液至pH 5.2(花生過敏原Arah2等電 點)，離心后沉淀物溶解在PBS中。將其裝入透析袋對蒸餾水透析4h，期間換透 析液一次，然后轉PBS中繼續透析過夜。
2、 花生過敏原快速檢測傳感器的使用方法
常溫下，向反應池中加入lmL 15mMHDT，包被90min，倒掉HDT溶液后 用超純水沖洗，加超純水浸泡30min，再加納米金吸附110min，倒去納米金后 用超純水沖洗后浸泡30min，取花生抗體5|iL稀釋4000倍，4'C條件下包被3h， 超純水沖洗后浸泡30min， 1%BSA在37。C下浸泡3h，純水沖洗后倒置放入冰箱， 半小時后加入所得待測液，檢測時間為500s。
3、 檢測結果
花生蛋白的最低檢測限為0.2pg/mL。 實施例2:河蝦過敏原的檢測 1、前處理
稱取去頭去殼的新鮮河蝦或河蝦樣品30g，組織搗碎后浸提，等電點沉淀的 pH值為4.5;其他步驟同上述花生的處理①，得河蝦過敏原待測液
2、 河蝦過敏原快速檢測傳感器的使用方法
常溫下，向反應池中加入lmll5mM HDT，包被90min,倒掉HDT溶液后 用超純水沖洗，加超純水浸泡30min，再加納米金吸附110min，倒去納米金后 用超純水沖洗后浸泡30min，河蝦抗體5iiL稀釋6000倍，4。C條件下包被3h， 超純水沖洗后浸泡30min， 1%BSA在37'C下浸泡3h，純水沖洗后倒置放入冰箱， 半小時后加入所得待測液，檢測時間為500s。
3、 檢測結果河蝦蛋白的最低檢測限為0.03pg/mL。
權利要求
1、一種花生或河蝦過敏原快速檢測傳感器的制備方法，其特征在于以抗原抗體免疫反應和壓電型傳感技術為基礎，建立了食品過敏原的壓電型免疫快速檢測傳感器，該檢測傳感器由CHI400C型電化學工作站，三電極體系鉑電極作為輔助電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，金電極需經修飾作為修飾電極、再經包被抗體作為工作電極，金電極修飾和包被抗體的過程為；(1)電極的清洗金電極是傳感器的主要元件；金電極用Piranha溶液清洗10min，保證金電極表面的清潔和高疏水性，然后依次用水和乙醇各清洗3次，利用三電極系統在電化學工作站儀器CHI400C上進行掃描驗證；將清洗過的電極在0.5mol/L的H2SO4溶液中于-0.8V～0.9V范圍內進行循環伏安掃描至穩定，掃描后的電極再用超純水清洗干凈，晾干后在4℃條件下保存待用；(2)電極的修飾向檢測反應池中分別注入濃度為20mM戊二醛的50％乙醇溶液、濃度為20mM的L-半胱氨酸L-Cys的50％乙醇溶液和濃度為20mM的1，6-己二硫醇HDT的50％乙醇溶液，室溫下靜置1.5h，然后用超純水清洗0.5h，晾干后將電極放入2.5mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)4+0.1mol/L KNO3+0.01mol/L PBS溶液中于-1V～1V范圍內循環伏安掃描至穩定，掃描后的電極再用超純水清洗干凈后繼續浸泡在納米金溶膠中自然沉積，于室溫下過夜；所述納米金溶膠的配置用新制雙蒸水配制100mL質量濃度為0.01％氯金酸溶液，置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸，在100r/min磁力攪拌下，迅速加入預先在37℃保溫的質量濃度1％檸檬酸三鈉溶液4.5mL，保持溫度和轉速不變，繼續攪拌加熱15min，直至溶液呈現清亮的酒紅色，室溫冷卻，4℃冰箱保存備用；(3)電極的包被抗體花生或河蝦經正己烷4℃浸提過夜，冷凍離心，收集上清液；用30％-50％飽和度硫酸銨沉淀的蛋白質組分溶解在PBS中，分別加硫酸至pH5.2或pH4.5等電點，離心后沉淀物溶解在PBS中，分別得花生過敏原或河蝦過敏原；花生或河蝦過敏原免疫得到檢測抗體；修飾后的電極超純水沖洗后浸泡30min，花生抗體用PBS緩沖液以1:4000稀釋或河蝦抗體用PBS緩沖液以1:6000稀釋，作為包被液，包被溫度4℃，包被時間3h，包被后的電極用超純水沖洗后浸泡30min，再在1％BSA37℃下浸泡3h，超純水清洗。
2 如權利要求1所述方法制備的花生或河蝦過敏原快速檢測傳感器的應用方法，其特征是(1) 待測液制備(a) 花生或含花生樣品待測液制備-稱取花生或含花生樣品30g，按重量體積比g/mL為1 : IO浸入正己烷中脫 脂，4"C浸提過夜，冷凍離心，收集上清蛋白浸液；10mL蛋白浸液緩慢加至質 量終濃度30%飽和硫酸銨，4"C下靜置過夜，離心使沉淀，對上層清液再緩慢加 至質量終濃度50%飽和硫酸銨，靜置30min，離心，將30%-50%飽和度沉淀的 蛋白質組分溶解在PBS中，加硫酸至pH5.2等電點，離心后沉淀物溶解在PBS 中，裝入透析袋對蒸餾水透析4h，期間換透析液一次，然后轉至PBS中繼續透 析，即得花生過敏原待測液；取待測液lmL加入傳感器反應池中進行檢測；(b) 河蝦或含河蝦樣品 稱取去頭去殼的新鮮河奸或河奸樣品30g，組織搗碎后浸提，等電點沉淀的pH值為4.5;其他步驟同(a)花生的處理，得河蝦過敏原待測液；取待測液lmL 加入傳感器反應池中進行檢測；(2) 檢測利用三電極系統在電化學工作站儀器CHI400C上進行檢測，在 檢測反應池中加入過敏原待測液，檢測時間為500s。
全文摘要
一種花生或河蝦過敏原快速檢測傳感器的制備及應用，屬于生物技術領域。本發明以抗原抗體免疫反應和壓電型傳感技術為基礎，建立了食品過敏原的壓電型免疫快速檢測傳感器，該檢測傳感器由CHI400C型電化學工作站，三電極體系鉑電極作為輔助電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，金電極需經修飾作為修飾電極、再經包被抗體作為工作電極所組成。當樣品中的抗原或抗體與包被在工作電極晶片上的抗體或抗原結合時，由于負載增加，晶片的振蕩頻率會相應減少，其減少值與吸附質量有相關性。解決了現有檢測方法如ELISA、PCR的操作繁瑣，往往需要酶標反應物，檢測時間長，很難滿足現場快速檢測等缺點，成功建立了快速、特異、靈敏的檢測花生或河蝦過敏原的檢測傳感器。
文檔編號G01N27/327GK101458222SQ200810242878
公開日2009年6月17日 申請日期2008年12月26日 優先權日2008年12月26日
發明者孫秀蘭, 煒 寧, 平 張, 朱衛娟, 沈麗燕, 和 錢, 顧曉峰 申請人:江南大學