專利名稱：氨基酸診斷/測定試劑(盒)及氨基酸的濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定氨基酸濃度
的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
氨基酸含量的測定在醫學/食品/工業/農業/環境中都是比較重要的測定項目。 現有的測定方法有色譜法、電化學法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計等方法，這 些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設備成本較高等缺點。 氨基酸不是單純的一種物質，用氨基酸分析儀可直接測定出1 7種氨基酸(儀器 價格昂貴，不能普遍使用)，對于醫學/食品/工業/農業/環境中來說，多數情況下，都是 很多種氨基酸同時存在，所以需要測定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示， 只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。 大量食肉或饑餓時尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基 酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能 衰竭、Reye綜合征、或某些因素造成蛋白質分解加速的疾病，遺傳性疾病所導致的代謝異常 均可使尿中氨基酸氮增加。 酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業產品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法 簡便、成本低的特點。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環擴增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction) 技術，監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨基 酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，采用 該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行氨基酸濃度測定， 而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明氨基酸濃度測定方法如下 氨基酸+水+氧氨某酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫
氨+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氡酶丙氨酸+水+輔酶
這種方法應用氨基酸氧化酶(amino-acid oxidase ;EC 1. 4. 3. 2 ;EC 1. 4. 3. 3)酶 (偶)聯丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 1)酶促反應連續監測法。氨 基酸氧化酶作為作用酶，功能為將氨基酸酶解產生氨。丙氨酸脫氫酶作為循環酶丙氨酸脫 氫酶的酶促作用使氨變回丙氨酸(一種氨基酸)，使丙氨酸(氨基酸)不斷地被重復循環利 用。丙氨酸脫氫酶又作為顯色酶，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型 輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度， 通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算氨基酸的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單 劑還是三劑，如下成分關系的本發明氨基酸診斷/測定試劑(盒)較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L
' 6000U/L 8000U/L
丙酮酸 12mmol/L 本發明的氨基酸診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸。 試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩定劑、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶。
還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置可 試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸。
試劑2 緩沖液、穩定劑、丙氨酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩定劑、氨基酸氧化酶。 還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的 位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定氨基酸濃度的方法，其還原型輔酶可以是 NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑 500mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 氨基酸氧化酶 6000U/L
丙氨酸脫氫酶 8000U/L
丙酮酸 12,1/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方
向為負反應(下降反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 實施例二
本實施例的氨基酸診斷 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩定劑
還原型輔酶
丙酮酸
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩定劑
測定試劑為雙試劑，包括
鹽酸緩沖液 100mmol/L 50mmol/L
0. 25,1/L 12mmol/L
鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 500,1/L 6000U/L 8000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為 2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
實施例三 本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩定劑 還原型輔酶 丙酮酸 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 穩定劑
100,1/L 50mmol/L 0. 25,1/L 12mmol/L
100,1/L 500,1/L
丙氨酸脫氫酶 8000U/L
試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500mmol/L 氨基酸氧化酶 6000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定氨基酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起
始吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑
2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘左
右，檢測時間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 申請人:經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到本發明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0009 ;吸光度時間反應曲線應呈下 降曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達40mmol/L ;試劑測試的不準確 度，其相對偏差不超過±3% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(CV)《2% ;試劑 的靈敏度可達O. 08±0. 04 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩定一年；——本發 明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩定期長，足以便于推廣應用。
權利要求
一種利用酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法技術的氨基酸濃度測定方法，其方法如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫氨+丙酮酸+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶丙氨酸+水+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出氨基酸的濃度大小測定結果。
2. —種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液 穩定劑 還原型輔酶<formula>formula see original document page 2</formula>丙酮酸試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸組成雙劑試劑； 試劑1，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、氨基酸氧化 酶、丙氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸在試劑1或試劑 2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶、丙酮酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、丙氨酸脫氫 酶組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、氨基酸氧化酶組成。還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙氨酸 脫氫酶、丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩定劑 l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法技術的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定氨基酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、丙酮酸、氨基酸氧化酶、丙氨酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
文檔編號G01N33/48GK101750338SQ20081023568
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月10日 優先權日2008年12月10日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司