專利名稱：競爭性酶聯受體親和反應篩選雌激素活性化合物技術的制作方法
技術領域：
本發明專利屬于分析測試技術領域，涉及一種快速篩選雌激素活性化合物的技術。本技 術在環境污染物的毒理學研究、化合物代謝產物研究、工業品的毒性評價、藥物篩選及有效 成分分析等方面有廣泛的應用前景。
背景技術：
環境污染物對健康的影響是人們普遍關注的問題。近年來，越來越多的曾被認為"安全" 而廣泛使用的化合物被證明具有雌激素或抗雌激素活性，能夠引起一系列雌激素依賴的生理、 生化過程紊亂，導致實驗或野生動物的胚胎發育異常、生殖能力下降、性別分化異常等現象。 雖然這些化合物對生物體的作用途徑、生物效應各不相同，但一般都需要與雌激素受體發生 相互作用。
在生物體內，雌激素與雌激素受體的相互作用機制一般為首先雌激素與雌激素受體結
合，然后受體蛋白形成二聚體，最后此二聚體與目標基因上的雌激素響應元素(estrogen response element,ERE)結合，激活目標基因的表達，使細胞產生相應生理響應。從雌激素受 體蛋白的N端到C端包括6個不同的結構域，依次命名為A-F，結構域E有配體結合功能，稱為 配體結合區(ligand binding domain, LBD)。為研究方便，通常用異源表達的LBD蛋白研究配 體與受體的相互作用。生物體內主要有兩種不同的雌激素受體蛋白，分別稱為ERa和ER(3。 不同組織中ERa和ER(3的比例不同，對配體的親和活性及轉錄活性也不相同。
由于雌激素活性化合物一般環境劑量低且作用機制復雜，其對生物體的影響難以用傳統 的物理化學測試結果進行準確評估。為此，開發基于雌激素受體——配體相互作用的雌激素 活性化合物快速篩選技術具有重要意義。雖然，已有利用雌激素受體研究化合物的雌激素活 性的報道，但絕大多數報道中均采用氚標記的雌二醇作為競爭配體，通過其與雌激素受體結 合后放射性活度的變化來評價化合物與雌激素受體的結合活性。這種方法雖然準確度高，但 是由于試劑昂貴，且需要進行放射性操作，所以一般實驗室難以進行。目前，與本發明相似 的競爭性酶聯受體親和反應篩選雌激素活性化合物技術未見報道
發明內容
本發明專利是一種基于雌激素受體——配體相互作用的競爭性雌激素活性化合物快速篩 選技術。其基本原理是將測試化合物、固定化17p雌二醇與雌激素受體蛋白ERa-LBD或 ER(3-LBD置于同一反應體系中，使測試化合物、固定化17(3雌二醇競爭性與ERa-LBD或 ER(3-LBD結合，最后通過酶聯反應檢測結合在固定化17P雌二醇上的雌激素受體蛋白數量對 測試化合物的雌激素活性作出評價。
本發明專利是通過下述技術方案而實現的。
1、 雌激素受體蛋白ERa-LBD或ER(3-LBD的制備。將ERa-LBD或ER(3-LBD質粒(100|iL) 轉移到含感受態細胞(10(VL,溶于0.1mol/L的CaCl2)的離心管中，冰浴30分鐘，于42'C水浴 放置90秒，再入冰浴，加入LB液體培養基500(iL，混勻后振蕩培養(100rpm,37。C) 45min， 最后將上述菌液涂固體LB平板，37'C過夜。將ERa-LBD或ERP-LBD質粒轉化的宿主菌接種 于含Amp十(100pg/mLl)的液體LB培養基(5 mL)，過夜培養(37°C， 200轉)。過夜培養物 按4%接種比接種到含八11^+ (100pg/mL) 5ml液體LB培養基，通氣培養(37°C， 200轉)，直 到在600nm下，OD為0.5-0.7時加入IPTG，工作濃度為0.2mmol/L，溫度25。C，振蕩培養時間 為8小時，室溫離心(10000rpm,10min)棄上清。把沉淀重懸于結合緩沖液中(0,5MNaCl， 20 mM Tris-HCl, 5 mM B引唑，pH7.9，每IOO mL培養基10 mL緩沖液)，加入蛋白酶抑制劑，用 超聲波破碎儀破碎細胞(功率450W，工作時間3S，間隔時間3S，總時間6min)。將破碎液離 心后(12000rpm,20min)，依次用3倍體積去離子水，5倍體積NiS04 (0.05 M)， 3倍體積結合緩 沖液平衡His-Bind親和萃取小柱。使上清液以IO mL/h速度流過親和萃取柱。先用10倍體積結 合緩沖液沖洗萃取柱，然后用6倍體積洗滌液(0.5MNaCl,20mMTris-HCl,60mM吲唑，pH 7.9)沖洗。用6倍體積洗脫液(0.5MNaCl,20mMTris-HCl, 1 M d引唑，pH7.9)洗脫，收集洗 脫液，用Tris-HCl (20mM，pH7.5)透析后，用超濾離心管濃縮至20(^1，加入蛋白酶抑制劑， -80"保存。
2、 雌激素受體蛋白ERa-LBD或ER(3-LBD多克隆抗體的制備。用上述經大腸桿菌異源表達 及純化的ERa-LBD或ERP-LBD蛋白免疫動物制備多克隆抗體，具體歩驟如下取兩只健壯的 青藍紫兔，平均體重1.5kg，馴養2周后，注射卡介苗致敏，用劑量約為0.5mg/kg體重的抗原 與弗氏完全佐劑以體積比l:l充分混合，形成穩定的油包水膠體。進行足底及背部多點注射。 四周后進行第一次加強免疫，加強免疫試劑為弗氏不完全佐劑與抗原等體積混合液。此后， 每隔7天加強免疫一次，每次加強免疫前，取兔耳緣靜脈血用雙相免疫擴散方法測定抗體效價。 當抗體的效價達到滿意的結果時，將兔子麻醉，進行頸動脈放血。收集的血液室溫放置l小時， 然后4。C冰箱過夜放置，使血清析出。析出的血清在1500卬m離心10min，使血清和血漿充分 分離。血清中加入NaN3 (NaN3最終濃度為0.02X)，分裝，-20°(3保存。3、競爭性酶聯受體親和反應分析方法的建立。
本方法所用緩沖液有包被液(0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液)，洗滌及稀釋液(0.01mol/L pH7.4磷酸鹽-NaCl緩沖液內含0.05。/。Tween-20,簡稱PBST)，封閉液(取上述稀釋液配制成含 P/。的牛血清清蛋白溶液，臨用前配制)，底物顯色液(準確稱取20mg鄰苯二胺溶于50ml pH5.0, 0.05mol/L的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，臨用前加入80^iLH202)，終止液(2mol/L&304溶液)。
本方法的具體步驟如下
(1) 用250ng/mL的E2-BSA包被酶標板，每孔加入150)jL，室溫放置2h后轉入4t:冰箱孵 育過夜。
(2) 用PBST洗滌，每孔200(JL，洗滌5次，每次1分鐘。
(3) BSA封閉，取稀釋液配制1%的牛血清清蛋白(BSA)溶液，每孔中加入200iJL，置 37'C恒溫箱中60分鐘。
(4) 用PBST洗滌，毎孔200ijL，洗滌5次，每次1分鐘。
(5) 加入待測化合物溶液或np雌二醇標準溶液(0.5-250 ng/mL)，毎孔50mL。
(6) 加入ERa-LBD或ERp-LBD蛋白(100ng/mL)，每孔50pL; 37。C溫育l小時。
(7) 用PBST洗滌，毎孔200ijL，洗滌5次，每次1分鐘。
(8) 力口ERa-LBD或ER卩-LBD蛋白抗體(稀釋64000倍)，毎孔50ijL， 37。C溫育l小時。
(9) 用PBST洗滌，每孔200)JL，洗滌5次，每次1分鐘。
(10) 加二抗(辣根酶標記山羊抗兔IgG)，將二抗稀釋5000倍，每孔加100lJL ， 37'C溫 育1小時。
(11) 用PBST洗滌，每孔200iJL，洗滌5次，每次1分鐘。
(12) 加底物顯色，每孔加入100iJLOPD顯色液，37'C恒溫避光反應20分鐘。
(13) 終止反應，每孔加入50nL終止液，穩定3-5分鐘后，將酶標板放入酶標儀中，490nm 處測定吸光值。
具體實施例方式
本發明專利是一種基于雌激素受體——配體相互作用的競爭性雌激素活性化合物快速篩 選技術。其基本雌激素活性評價依據是將測試化合物對雌激素受體蛋白ERa-LBD或ER卩-LBD 的競爭性結合能力與內源性雌激素17(3雌二醇對ERa-LBD或ERP-LBD的競爭性結合能力相對 比，從而得出測試化合物相對于17(3雌二醇的雌激素活性，用相對親和力系數表示。具體實施 方式如下
(1)將被測化合物溶液以10的指數倍稀釋，用上述競爭性酶聯受體親和反應分析方法初步測定其與雌激素受體結合的濃度范圍。
(2) 在一塊96孔酶標板上將被測化合物倍比稀釋，用上述競爭性酶聯受體親和反應分析 方法測定其與雌激素受體結合的標準曲線，同時平行測定17(3雌二醇的競爭性結合標準曲線。
(3) 分別根據標準曲線計算被測化合物和17(3雌二醇與受體蛋白的IC5o值(K^值是導致 與固定化17卩雌二醇結合的雌激素受體下降50%所需競爭化合物的濃度)。
(4) 計算被測化合物的相對親和力系數。相對親和力系數- (np雌二醇的IC5o值)/ (被 測化合物的IC5Q值)。相對親合力系數越大，表示化合物與雌激素受體的親合能力越高。
(5)通過與高通量的移液、點樣系統結合，本方法可以實現對化合物雌激素活性的高通量篩 選。
權利要求
1、一種競爭性酶聯受體親和反應篩選雌激素活性化合物技術。其特征是所述的受體蛋白為重組人雌激素受體配體結合區域蛋白，所述抗體為重組人雌激素受體配體結合區域蛋白的多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗。
2、 根據權利要求1所述的重組人雌激素受體配體結合區域蛋白為帶組氨酸標簽的重組 人雌激素受體a亞型配體結合區域蛋白，和重組人雌激素受體e亞型配體結合區域蛋白。其 特征是在誘導劑(IPTG)濃度為0.2mM，培養溫度25'C，誘導時間為8h的優化表達條件下， 重組蛋白在大腸桿菌中異源表達。
3、 根據權利要求1所述的競爭性酶聯受體親和反應篩選雌激素活性化合物技術，其特 征是將測試化合物、固定化17(3雌二醇與雌激素受體蛋白ERa-LBD或ER(3-LBD置于同一反 應體系中，使測試化合物、固定化17(3雌二醇競爭性與ERa-LBD或ERl3-LBD結合，最后通 過酶聯反應檢測結合在固定化17(3雌二醇上的雌激素受體蛋白數量對測試化合物的雌激素活 性作出評價。
4、 根據權利要求1所述的競爭性酶聯受體親和反應篩選雌激素活性化合物技術，其特 征是包被緩沖液為pH 9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液；樣品稀釋液為0.2 M PBS緩沖液，pH 7.4， 含0.05% Tween-20;底物緩沖液為pH 5.0的磷酸鹽一檸檬酸緩沖液；顯色底物為鄰苯二胺； 氧化劑為過氧化氫；終止液為2mol/L硫酸。
全文摘要
本發明屬于分析測試技術領域，涉及一種快速篩選雌激素活性化合物的技術。其基本原理是將測試化合物、固定化17β雌二醇與雌激素受體蛋白ERα-LBD或ERβ-LBD置于同一反應體系中，使測試化合物、固定化17β雌二醇競爭性與ERα-LBD或ERβ-LBD結合，最后通過酶聯反應檢測結合在固定化17β雌二醇上的雌激素受體蛋白數量。其基本雌激素活性評價依據是將測試化合物與17β雌二醇對雌激素受體蛋白ERα-LBD或ERβ-LBD的競爭性結合能力相對比，從而對測試化合物的雌激素活性作出評價。本技術在環境污染物的毒理學研究、化合物代謝產物研究、工業品的毒性評價、藥物篩選及有效成分分析等方面有廣泛的應用前景。
文檔編號G01N33/566GK101413960SQ20081022781
公開日2009年4月22日 申請日期2008年12月1日 優先權日2008年12月1日
發明者史建波, 周群芳, 時國慶, 江桂斌 申請人:中國科學院生態環境研究中心