專利名稱：抗阿莫西林和氨芐西林小鼠單克隆抗體細胞株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株能同時抗阿莫西林和氨芐西林小鼠單克隆抗體，屬于B細胞雜交 瘤技術領域。
背景技術：
抗生素被廣泛的應用于預防和治療家禽家畜的多種微生物感染性疾病。但抗生素 存在嚴重的副作用，長期使用抗生素的危害主要是導致細菌產生抗藥性，將造成抗藥菌株 的擴散、蔓延，甚至使某一特定組織細胞產生抗藥性。超量濫用抗生素，造成抗生素在畜產 品中殘留，并最終以各種途徑匯集于人體，導致人體產生大量耐藥菌株，失去對某些疾病的 抵抗力，引起變態反應、過敏反應，最終對人體器官產生嚴重的毒害。阿莫西林和氨芐西林 屬于廣泛使用的青霉素類抗生素。歐盟、美國和日本等世界上許多發達國家都對其在畜產 品中的最大殘留限量做了明確規定。 目前，對畜產品或動物源性食品中阿莫西林和氨芐西林殘留量的檢測主要采用高 壓液相色譜法和高壓液相色譜_質譜串聯法。這兩種方法雖然靈敏、準確，但檢測時間長、 時效性差、耗資大、技術性要求高，且要有昂貴的儀器，不適合大量樣品的篩選測定，無法滿 足食品安全管理對檢測方法快速、高效的要求。
發明內容
本發明要解決的第一個技術問題是建立阿莫西林和氨芐西林免疫檢測方法不可
缺少的高質量單抗細胞株，從而制備阿莫西林和氨芐西林的單克隆抗體。 為實現上述目的，本發明采取以下技術方案 —株抗阿莫西林和氨節西林小鼠單克隆抗體細胞株，保藏號為CGMCC No. 2674。
小鼠單克隆抗體細胞株CGMCC No. 2674產生的單克隆抗體。
所述細胞株或單克隆抗體用于制備檢測阿莫西林和氨芐西林的試劑的應用。
本發明所涉及小鼠B淋巴瘤細胞雜交瘤，定名為JMAS102，已于2008年9月26日在 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了菌種保藏，并證明存活， 其保藏登記號為CGMCC No. 2674。保存地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究 所，郵編100101。 本發明將阿莫西林分別交聯于兩種不同的大分子蛋白載體KLH和BSA，采用阿莫 西林-KLH交聯物免疫Balb/c小鼠，通過B細胞雜交瘤技術，經過動物免疫、細胞融合、篩選 (BSA交聯物用于單抗的篩選)及亞克隆獲得可以穩定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株，并 制備腹水，Protein G親和純化特異性抗體。 本發明制備出一種針對阿莫西林的單克隆抗體，這株單抗與同是青霉素類抗生素 的氨芐西林的交叉反應為100%，與頭孢菌素類抗生素頭孢唑啉的不存在交叉反應。本發明 可用于快速檢測動物原性食品中阿莫西林和氨芐西林的殘留情況，并可進一步用于開發快 速、準確檢測動物源性食品中阿莫西林和氨芐西林含量的免疫檢測產品。
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本發明的優點是這株細胞可以同時對阿莫西林和氨芐西林起反應(阿莫西林和
氨芐西林同屬于青霉素類抗生素)，而不與頭孢唑啉起反應，(頭孢唑啉屬于P _內酰胺類
抗生素)，從而為開發出檢測光譜青霉素類抗生素殘留的試劑盒提供可能。 下面結合具體實施方式
對本發明作進一步說明，并非對發明的限定，依照本領域
公知的現有技術，本發明的實施方式并不限于此，因此凡依照本公開內容所作出的本領域
的等同替換，均屬于本發明的保護范圍。
具體實施例方式實施例1 :抗原交聯
—.免疫原合成 采用碳二亞胺鹽酸鹽(EDCoHCl)兩步法稱取阿莫西林10-20mg， EDCoHC 50-150mg， NHS (N_羥基琥珀酰亞胺)5_20mg，于一個單口瓶中，加入l_4mL DMF ( 二甲基甲酰 胺)中使充分溶解，放入磁力攪拌器轉子，密封避光，室溫反應10-20hrs，得到阿莫西林反 應液，稱為A液。然后稱取KLH(鑰孔嘁血藍素)10-50mg充分溶解于l_8mL PBS (磷酸鹽緩 沖液)中，稱為B液。然后將A液逐滴加入B液中，密封避光，在2-8t:下攪拌過夜。待上述 反應完成后，將反應液轉移至采用PBS預處理10-32hrs的透析袋中，于2-『C冰箱中，攪拌 下用PBS透析12-72hrs，中間多次換液。將透析后的交聯產物阿莫西林_KLH置于單口瓶 中，冰凍干燥。
二.包被原合成 采用混合酸酐法稱取阿莫西林10-20mg，置于一個單口瓶中，加入l-4mL DMF， 將溶液預冷，隨后加入5-20 L三乙胺和5-30 L氯甲酸異丁酯，攪拌混勻，低溫下反應 10-30min，稱為A液。準確稱取10_60mg溶于BSA于l_6mL CB中，稱為B液。然后將A液 逐滴加入B液中，室溫下避光攪拌反應2-10hrs。待上述反應完成后，將反應液轉移至采用 PBS預處理10-32hrs的透析袋中，于2-8。C冰箱中，攪拌下用PBS透析12_72hrs，中間多次 換液。將透析后的交聯產物阿莫西林-BSA置于單口瓶中，冰凍干燥。
實施例2 :單克隆抗體制備
—.免疫小鼠與效價測定 以阿莫西林-KLH交聯物為免疫抗原，免疫Balb/c純系小鼠，按30-150 y g/只小 鼠取抗原，與弗氏完全佐劑等量混合，充分乳化后，小鼠頸背部皮下多點注射。第一次免疫 后3周進行第二次免疫，劑量與第一次相同，采用弗氏不完全佐劑乳化，小鼠頸背部皮下多 點注射。第二次免疫后3周，采用相同劑量的抗原溶于生理鹽水中，腹腔注射。免疫結束后 5-15天，小鼠斷尾采血，分離血清，采用間接ELISA法測定抗血清效價。
間接ELISA法測定抗體效價方法用PBS將阿莫西林-BSA稀釋至l-5iig/ml， 100iU/孔加入酶標板。2-8t:過夜。洗板3次。1-5% BSA封閉液，1-300 ill/孔，室溫孵 育l-3小時，洗板。第三次免疫后一周，小鼠斷尾取血，分離血清，從l : IOOO開始做倍比 稀釋，依次加入各孔，100 ii 1/孔，37t:孵育1小時。洗板3次。每孔加入100 ii 1 HRP標記 的羊抗鼠Ig(H+L) ， 37t:孵育30分鐘。洗板3次。每孔加TMB底物100 y 1，室溫避光顯色 5-15分鐘。每孔加終止液50 iil。酶標儀測定OD值(檢測波長450nm，參考波長:630nm)。
免疫5只Balb/c純系小鼠。每次免疫間隔3周，總計免疫4次。抗血清效價檢測結果見表l，選擇3#小鼠做融合。 表1 :小鼠抗血清效價ELISA檢測結果效價0D of 1#OD of2#OD of 3#OD of4# OD of 5#i ::iooo1. 7180. 9202. 2130. 6460. 280i ::20001. 4400. 5831. 8010. 4380. 178i ::40001. 1330. 3881. 7510. 2960. 151i ::80000. 8150. 2471. 5150. 1860. 123i ::160000. 5460. 1911. 1330. 1370. 098i ::320000. 3510. 1400. 7650. 1300. 102i ::640000. 2470. 1190. 5770. 1090. 099i ::1280000. 2490. 2040. 4330. 1190. 097 二.細胞融合 融合前5-10天復蘇SP2/0細胞，于5-10% FBS(胎牛血清)的RPMI-1640培養基 中傳代培養至所需數量1-5 X 107，必須保證融合時SP2/0的數量及處于對數生長狀態。沖擊 免疫于融合前3-5天取抗原小鼠腹腔注射沖擊免疫，30-150ii g/只小鼠。于融合前一天取 小鼠腹腔巨噬細胞制備滋養細胞板。斷頸處死小鼠，將小鼠浸泡于75%酒精中消毒3-5分 鐘。將小鼠移入超凈臺，腹部向上放置，剪開腹部皮膚，鈍性剝離充分暴露腹膜。剪開腹膜， 吸取l-5ml無血清培養基注入腹腔沖洗2-3遍，將培養基吸入離心管中。1， 000-1， 500rpm 離心5-10分鐘，棄上清，將細胞移入適量完全培養基混勻，制備5塊滋養細胞板。將滋養 細胞懸液加入96孔板。把96孔板放入37。C孵箱，10-24小時后使用。將0. 5-1. 5ml PEG 和5-20ml無血清RPMI-1640置于37。C孵箱預熱。將處于對數生長期的SP2/0收集到50ml 離心管中，計數，取1-5 X 107個骨髓瘤細胞，1， 000-1， 500rpm離心5-10分鐘，棄上清，加入 20-50ml無血清RPMI-1640，洗滌2次。將效價已達到要求，已沖擊免疫的免疫小鼠摘眼球放 血，斷髓處死，浸泡于75%的酒精中消毒3-5分鐘，無菌剪開腹腔，暴露腹膜，取出脾臟，放 入平皿中，將脾臟置于200目鋼網上，加少量RPMI-1640，研磨，制成單個脾細胞懸液，將脾 細胞懸液移入50ml離心管中，加RPMI-1640至20_40ml， 1， 000-1， 500rpm離心5_10分鐘， 洗滌2遍。骨髓瘤細胞和脾細胞充分混合，加RPMI-1640， 1， 000-1， 500rpm離心5-10分鐘， 倒盡上清。緩緩加入37。C預熱的PEGO. 5-1. 5ml，在30-60秒加完，作用30-60秒。向融合 體系中加入無血清培養基5-20ml以終止PEG的作用，先慢后快，第一個lml加1_3分鐘，第 二個lml加1-3分鐘，其余3-18ml在3-5分鐘內加完。1， 000-1， 500rpm離心5-10分鐘，棄 上清，加入10-30ml的含有5-20% FBS的RPMI-1640，輕輕吹打混勻。將細胞加入5塊已鋪 有滋養細胞的96孔板中。融合后第二天加入HAT選擇性培養基。每天觀察細胞形態，在加 入HAT后3-5天后，融合的細胞會有克隆形成，此時用負壓吸引器吸出1/3-1/2培養基，加 入新的HAT培養基。根據細胞生長狀態，在篩選前再換液l-3次，篩選前一天必須換液。一 般在融合后8-15天，未融合的骨髓瘤細胞和其他細胞早已全部死亡，融合細胞克隆生長， 可在細胞鋪滿孔低的1/2或2/3時進行篩選。采用ELISA法進行篩選。亞克隆前一天制備 小鼠腹腔巨噬細胞滋養板。取需要亞克隆的細胞輕輕吹打，制成單細胞懸液，加入計數板計
數，計算細胞密度。按每板ioo個細胞，取所需的體積，加入適量完全培養基中，充分混勻后
加入96孔板。 三.篩選陽性克隆及亞克隆 陽性克隆的ELISA篩選方法用包被緩沖液將阿莫西林-BSA稀釋至1_5 y g/ml，100 ii 1/孔加入酶標板。2-8t:過夜。洗板3次。1-5% BSA封閉液，100-300 y 1/孔，室溫
l-3小時，洗板。取單克隆孔中的細胞培養上清，加入篩選板，iooia/孔，37t:孵育i小時。
洗板3次。每孔加入100 ii 1 HRP標記的羊抗鼠Ig(H+L) ， 37。C孵育30-60分鐘。洗板3次。 每孔加晶美TMB底物100 ii 1，室溫避光顯色5-15分鐘。每孔加終止液50 iU。酶標儀測定 OD值(檢測波長450nm，參考波長630nm)。
四.雜交瘤細胞亞型檢測 雜交瘤細胞亞型檢測方法用PBS將Goat anti mouse Ig(H+L)稀釋至1-5 ii g/ ml，100iil/孔加入酶標板。2-8。C過夜。洗板3次。1-5% BSA封閉液，100-300 yl/孔，室 溫l-3小時，洗板。取篩選好的雜交瘤細胞培養上清，每孔100ia，加入一條酶標板中(豎 條A-H，8孔)，37t:孵育60分鐘。洗板3次。向A_H孔，每孔分別加入HRP標記的抗亞型 抗體，順序為IgM， IgGl， IgG2a， IgG2b， IgG3， IgA， k即pa禾P lambda,每孔100 ii 1，37。C孵育 30-60分鐘。洗板3次。每孔加晶美公司TMB底物100 y 1，室溫避光顯色5_15分鐘。每孔 加終止液50 iil。酶標儀測定OD值(檢測波長450nm，參考波長630nm)。
融合后得到5株可以分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株，亞型檢測結果表2。
表2:雜交瘤亞型檢測結果
Code of mAb clonesIsotype
01IgGl/K
02IgGl/K
03IgGl/K
04IgG2a/K
05IgGl/K 實施例3 :單克隆抗體的生產和親和純化
—.單抗的生產 為保證抗體的純度，采用無血清培養基(Hyclone產品，目錄號SH30800)，培養雜 交瘤細胞。按常規培養細胞(細胞密度為5-10乂105時傳代培養，接種密度1-2X10"，擴 增至1L后，不再更換培養基，直至IO天左右后，雜交瘤細胞全部死亡，離心收集上清，上清
中即含有高度特異性的抗體。
二 . Protein G親禾口純化 用于抗體純化的Protein G層析柱(Bio-Rad，伯樂)用3_5倍柱床體積平衡緩沖 液(10mM PBS， pH7.4)預平衡。將收集的上清用一次性0. 22 y m濾器過濾后經蠕動泵上樣 至Protein G層析柱中。收集流出液，繼續用平衡緩沖液洗柱以徹底去除雜蛋白， 一直洗到 基線。更換洗脫緩沖液(0. 1M甘氨酸，pH2.3)，用含適量中和緩沖液的收集管收集洗脫峰。 純化抗體用過量O. 01M PBS，pH7. 4透析過夜。透析抗體超濾濃縮，濃度> lmg/ml。濃縮后 抗體經10， 000rpm，2-8t:離心5_15分鐘去除沉淀。抗體中可加入防腐劑分裝凍存。
實施例4 :單抗親和力測定 將阿莫西林-BSA分別制成2 ii g/ml 、 1 ii g/ml和0. 5 ii g/ml的PBS溶液，包板，
62-『C過夜。洗板后加入已知濃度，且進行倍比稀釋的單抗純品，37t:孵育1小時，洗板，加 入羊抗鼠IgG-HRP，37t:孵育30-60分鐘，洗板，顯色，用酶標儀讀取各孔0D值。以單抗不同 濃度的對數值為橫坐標，以其相應的OD值為縱坐標，繪制出包被抗原不同濃度的三條反應 曲線，取曲線上趨于平坦段的OD值為OD-IOO，查出其0D-50點的單抗濃度[Ab] t，故可以得 到[Ab]t， [Ab， ]t和[Ab"]t三個值，按下面公式計算Ka值:
<formula>formula see original document page 7</formula>
這樣每個單抗可以測得三個Ka值，平均值既是親和常數Ka。 5株單抗親和力測定結果見表3。 表3 :抗體親和力測定結果
克隆序號親和力
012. 304X 109
023. 759X 109
034. 7X109
043. 89X109
052. 17X109 實施例5 :單抗交叉反應測定 分別以阿莫西林、氨芐西林和頭孢唑啉的BSA交聯物包被酶標板，l-5ii g/ml， 100iU/孔，2-8t:過夜。洗板后加入已知濃度，且進行倍比稀釋的單抗純品，37t:孵育1小 時，洗板，加入羊抗鼠IgG-HRP， 37t:孵育30-60分鐘，洗板，顯色，用酶標儀讀取各孔OD值。
經交叉反應檢測，本抗體與氨芐西林的交叉反應為100%，與頭孢唑啉無交叉反應。 由于阿莫西林和氨芐西林均為小分子物質，只具有一個表位，5株雜交瘤所針對的 位點是同一個，故選擇并保藏了親和力最好的細胞株03號。小鼠B淋巴瘤細胞雜交瘤，定 名為JMAS102，已于2008年9月26日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)進行了菌種保藏，并證明存活，其保藏登記號為CGMCC No. 2674。保存地址為北京 市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101。
權利要求
一株抗阿莫西林和氨芐西林小鼠單克隆抗體的細胞株，保藏號為CGMCCNo.2674。
2. 權利要求1所述的小鼠單克隆抗體細胞株CGMCC No. 2674產生的單克隆抗體。
3. 權利要求l所述的細胞株CGMCC No. 2674用于制備檢測阿莫西林和氨芐西林的試劑 的應用。
4. 權利要求2所述的單克隆抗體用于制備檢測阿莫西林和氨芐西林的試劑的應用。
全文摘要
本發明涉及一株能同時抗阿莫西林和氨芐西林小鼠單克隆抗體細胞株，屬于B細胞雜交瘤技術領域。一株抗阿莫西林和氨芐西林小鼠單克隆抗體細胞株，保藏號為CGMCC No.2674。本發明制備出一種針對阿莫西林的單克隆抗體，這株單抗與同是青霉素類抗生素的氨芐西林的交叉反應為100％，與頭孢菌素類抗生素頭孢唑啉的不存在交叉反應。本發明可用于快速檢測動物原性食品中阿莫西林和氨芐西林的殘留情況，并可進一步用于開發快速、準確檢測動物源性食品中阿莫西林和氨芐西林含量的免疫檢測產品。
文檔編號G01N33/577GK101735987SQ20081022604
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月4日 優先權日2008年11月4日
發明者丁海勤, 云環, 劉晨, 盧曉宇, 史秋磊, 張朝暉, 徐超一, 李小林, 王金花, 韓深, 高啟祥 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局;北京市晶美基因谷科技有限公司