專利名稱：：用于液態奶中三聚氰胺現場快速檢測的拉曼光譜法及試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種檢測方法，特別是涉及一種用于液態奶中三聚氰胺現場快速檢測的拉曼光譜法及使用的試劑盒。
背景技術：
：最近相繼在市售的嬰幼兒配方奶粉和液態奶中檢測出含有工業原料三聚氰胺，摻有三聚氰胺的奶粉導致多名嬰幼兒發生泌尿系統疾病，并有死亡病例，這對我國的乳制品生產和奶牛養殖業產生了巨大的影響，也使我國的食品監管能力受到了社會的質疑。在牛奶中摻兌三聚氰胺可以提高牛奶的氮含量，我國現行的奶制品蛋白含量測定中，依然沿用凱氏定氮法，通過牛奶中的氮含量來確定蛋白含量。這就給不法分子以可乘之機，通過添加含氮的廉價工業原料來提高牛奶的氮含量，這樣就可在牛奶中大量摻水。消費者的反應、媒體的強烈關注、政府的高度重視都使這起奶粉污染事件成為了當前社會焦點。加強檢測、盡早發現問題成為關鍵，這一突發事件也檢驗著食品監管部門的能力，如何保障食品安全成為全民共同關注的主要問題。當前，奶及奶制品中"三聚氰胺污染事件"對我國的乳制品生產和奶牛養殖業產生的不良影響是空前的，甚至使我國的食品監管能力受到了社會的質疑。其經濟損失也是巨大的，損失范圍波及到從原料到制成品、從源頭到餐桌的整個鏈條，損失最大的當屬原料乳的收購環節。生鮮奶的保質期僅為4個小時，這意味著，在等待檢驗的生鮮奶超過4小時后就要倒掉。據我國農業部統計數據表明，目前因無法在現場快速檢測三聚氰胺含量而導致每天倒掉的奶多達2000多萬噸，損失巨大！目前，常規檢測三聚氰胺的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)和高效液相色譜-質譜-質譜聯用技術(HPLC-MS-MS)，雖然這些方法可以進行準確的定性及定量分析，但只能在試驗室進行檢測，無法應用于奶站收購現場。盡管日前國家批準發布了《原料乳中三聚氰胺快速檢測液相色譜法》國家標準，但所需要的液相色譜儀現場化操作條件苛刻(流動相，泵)，操作復雜(未配自動進樣器)，耗材成本高(色譜柱昂貴)，分析速度仍然不夠理想。因此，如何實現液態奶中三聚氰胺重復性好、靈敏度高、操作簡便、實驗成本低、能進行現場、快速檢測、易于普及推廣，從奶源上解決三聚氰胺檢測控制問題，是目前急需解決的關鍵技術問題
發明內容本發明所解決的技術問題是提供一種重復性好、靈敏度高、操作簡便、實驗成本低、能進行現場快速檢測、易于普及推廣的液態奶中三聚氰胺現場快速檢測的拉曼光譜法。本發明的另一個目的是提供一種在此檢測方法過程中使用的檢測試劑盒。一種用于液態奶中三聚氰胺現場快速檢測的拉曼光譜法，液態奶樣品用水或pH=2~pH-14的水溶液以110倍的稀釋比例稀釋后，進行離心，吸取離心后中間層的勻質試液于預先加好檢測試劑的2mL的檢測池中，渦旋或搖振均勻，置檢測池于便攜式拉曼光譜儀檢測室中在250-2300cm"的范圍內進行拉曼光譜掃描檢測獲得拉曼光譜圖，依據所獲得的拉曼光譜圖，選用特征頻率下三聚氰胺的拉曼光譜信號，以內標信號為基準，采用歸一化方法，根據三聚氰胺的拉曼光譜信號的相對強度與三聚氰胺含量的線性比例關系，對液態奶樣品中三聚氰胺進行現場快速的定量和定性檢測。本發明的拉曼光譜法，所述水為二次蒸餾水或去離子水；所述pt^2pH-14的水溶液為鹽酸或檸檬酸或氫氧化鉀或氫氧化鈉調制而成。本發明的拉曼光譜法，所述稀釋后的液態奶樣品進行離心時，渦旋或搖振0.31分鐘勻質，取勻質后的試液0.8mL1.3mL于1.5mL離心管或3mL~4mL于5mL離心管或6mL~8mL于10mL離心管，置于離心機，于1000~16000r/min轉速下離心1-5分鐘。本發明的拉曼光譜法，所述檢測試劑包括以下用量的試劑-(1)檢測試劑A:銀膠體水溶液50~500nL;(2)檢測試劑B:0.5M5M的可水解出Cl"的電介質水溶液100pL;(3)檢測試劑C:0.5M~2M的堿性溶液10-300^L。其中檢測試劑A銀膠體水溶液按照公知的方法制備即可；檢測試劑B為使銀溶膠凝聚含CT1的電介質水溶液，優選為CaCl2水溶液或MgCl2水溶液或KC1水溶液或NaCl水溶液。檢測試劑C為促使三聚氰胺與銀溶膠結合的堿性溶液，優選為氫氧化鈉水溶液或氫氧化鉀水溶液。本發明的拉曼光譜法，其中所述液態奶樣品離心后中間層的勻質試液的加樣量為50~300pL。優選100~200nL。本發明的拉曼光譜法，所述便攜式拉曼光譜儀的激光光源發射波長為532nm或785nm。目前，美國光納科技公司(OptoTraceTechnologies,Inc.)、必達泰克公司、常州市萊賽光電技術有限公司可提供滿足測試要求的便攜式拉曼光譜儀。一種在所述的拉曼光譜法中使用的檢測試劑盒，包括以下試劑(1)檢測試劑A:銀膠體水溶液；(2)檢測試劑B:0.5M5M的可水解出C"的電介質水溶液；5(3)檢測試劑C:0.5M~2M的堿性溶液10~300|uL。利用本發明時，后期的數據采集及結果分析為(1)選定某一特征頻率下的拉曼信號峰所對應的強度為內標基準，進行譜圖歸一化；(2)用具有背景扣除功能的數據處理軟件進行數據處理，獲得基線平坦的拉曼圖譜，此步驟為基線拉平步驟；(3)數據庫的建立根據拉曼光譜圖中三聚氰胺特征頻率處所對應的信號強度進行大量實際樣品測定，運用數理統計方法建立不同基質樣品拉曼光譜數據庫，獲得空白樣品中相對強度本底值范圍和已知三聚氰胺含量樣品所對應的相對強度值。(4)定性分析根據所建立的數據庫，以空白樣品中相對強度本底值為參照依據，高于此本地底值范圍即為三聚氰胺陽性結果，低于此本地底值范圍即為三聚氰胺陰性結果。(5)定量分析根據所建立的數據庫中己知三聚氰胺含量樣品所對應的相對強度值，或根據特征頻率處三聚氰胺所對應的相對信號強度與其濃度的線性關系做標準曲線，用該標準曲線可對液態奶中三聚氰胺進行定量分析。本發明的拉曼光譜法，樣品前處理簡單，可實現準確的定性和定量分析，實驗耗材成本低廉，可進行現場、快速檢測、易于普及推廣，從而達到對液態奶中三聚氰胺能及時發現和監控管理，克服了目前對化學小分子檢測存在的問題。本發明具有操作簡便(稀釋、離心后即可測試)、靈敏準確(檢出限0.3ppm,測定限l.Oppm)、重現性良好(定量分析，RSD《10%)等優勢，從樣品前處理到出檢測結果，單樣檢測僅需要5~8分鐘，單樣檢測耗材直接成本在IO元人民幣以內。圖1為本發明中便攜式拉曼光譜儀的參數設置圖2是本發明測定步驟中的掃描圖3是本發明結果分析中的譜圖歸一圖4是本發明結果分析中的譜圖平滑圖5是利用本發明測定的三聚氰胺標準品的拉曼光譜圖(標品的濃度是300卯b);圖6是利用本發明測定的液態奶中三聚氰胺的拉曼光譜圖7是三聚氰胺的校準曲線圖，是由不同濃度(如0，2，4，6,8ppm)的三聚氰胺標準品加入到空白液態奶后，掃描得到的拉曼光譜圖經過以內標信號為基準譜圖歸一和基線拉平后，對應某位置的強度作圖得到的。具體實施方式實施例1:一種用于液態奶中三聚氰胺現場快速檢測的拉曼光譜法，包括以下具體的歩驟1、液態奶稀釋取lmL液態奶于lOmL塑料離心管中，加入4mL的水溶液，渦旋0.5分鐘，取lmL渦旋好的稀釋液于1.5mL離心管中。2、稀釋液離心置上述裝有1.5mL稀釋液的離心管于便攜式的離心機，于14000r/min轉速下離心4分鐘。3、配制檢測試劑(1)檢測試劑A:銀膠體水溶液；(2)檢測試劑B:1M的CaCb水溶液；(3)檢測試劑C:1M的氫氧化鈉水溶液；4、選用激光光源發射波長為785nm的便攜式拉曼光譜儀進行檢測，其步驟為(1)取樣取300]LiL檢測試劑A于2mL的檢測池中，加入IOOpL檢測試劑B，加入200^L檢測試劑C，小心吸取步驟2中離心勻質液200^L于檢測池中；渦旋或搖振0.30.5分鐘均勻；(2)儀器參數設置(見圖l):激光能量參數選擇200mw，積分時間參數選擇20秒，用此兩個參數調節最佳拉曼峰強度；(3)掃描(見圖2):用拉曼光譜儀在2502300cm'1的范圍內，以8cm"的分辨率掃描測試樣品；于5分鐘內讀取或記錄或保存拉曼光譜測試結果。連續掃描光譜3次，最后得3次掃描光譜的平均光譜。5、結果分析(1)以928cm—1對應峰的強度為單位100，進行譜圖歸一化(見圖3);(2)用數據處理軟件獲得基線平坦的拉曼圖譜(見圖4);(3)根據拉曼光譜圖中700±4cm—1處對應的信號強度來進行定性定量判定，若相對強度在80以上則判定為樣品中三聚氰胺的含量大于等于2ppm，若該處的相對強度低于80則判定為三聚氰胺的含量小于2ppm;若以700±4cm—1處對應的信號最高強度做標準曲線，可根據標準曲線進行液態奶中三聚氰胺的定量測定。)圖5和圖6示出了本發明的方法對三聚氰胺標標準品具有很好的譜圖，在特征頻率下峰值較高，而對液態奶樣品中的三聚氰胺也具有類似的譜圖，故而可以采用此拉曼光譜圖作為三聚氰胺定性或定量的基準。圖7是三聚氰胺的校準曲線圖，由不同濃度(如O,2,4，6，8ppm)的三聚氰胺標準品加入到空白液態奶后，掃描得到的拉曼譜圖經過以內標信號為基準譜圖歸一和基線拉平后，對應某位置的強度作圖得到的。實施例2:一種用于液態奶中三聚氰胺現場快速檢測的拉曼光譜法，包括以下具體的步驟1、液態奶稀釋取lmL液態奶于lOmL塑料離心管中，加入2mL的pI^2的鹽酸溶液，渦旋0.5分鐘，取lmL渦旋好的稀釋液于1.5mL離心管中。2、稀釋液離心置上述裝有1.5mL稀釋液的離心管于便攜式的離心機，于14000r/min轉速下離心4分鐘。3、配制檢測試劑(1)檢測試劑A:銀膠體水溶液；(2)檢測試劑B:0.5M的MgCl2水溶液；(3)檢測試劑C:0.5M的氫氧化鈉水溶液；4、選用激光光源發射波長為785nm的便攜式拉曼光譜儀進行檢測，其步驟為(1)取樣取50iaL檢測試劑A于2mL的檢測池中，加入IOOpL檢測試劑B，加入IO^L檢測試劑C，小心吸取步驟2中離心勻質液50pL于檢測池中；渦旋或搖振0.30.5分鐘均勻；(2)儀器參數設置激光能量參數選擇200mw，積分時間參數選擇20秒，用此兩個參數調節最佳拉曼峰強度；(3)掃描用拉曼光譜儀在2502300cm—1的范圍內，以8cm—1的分辨率掃描測試樣品；于5分鐘內讀取或記錄或保存拉曼光譜測試結果。連續掃描光譜3次，最后得3次掃描光譜的平均光譜。其余同實施例l。實施例3:一種用于液態奶中三聚氰胺現場快速檢測的拉曼光譜法，包括以下具體的步驟1、液態奶稀釋取lmL液態奶于lOmL塑料離心管中，加入IOmL的pH-10的氫氧化鉀溶液，渦旋0.5分鐘，取lmL渦旋好的稀釋液于1.5mL離心管中。2、稀釋液離心置上述裝有1.5mL稀釋液的離心管于便攜式的離心機，于14000r/min轉速下離心4分鐘。3、配制檢測試劑(1)檢測試劑A:銀膠體水溶液；(2)檢測試劑B:5M的KC1水溶液；(3)檢測試劑C:2M的氫氧化鉀水溶液；4、選用激光光源發射波長為785nm的便攜式拉曼光譜儀進行檢測，其步驟為(1)取樣取500iaL檢測試齊ljA于2mL的檢測池中，加入IOOnL檢測試劑B,加入300pL檢測試劑C，小心吸取步驟2中離心勻質液300^L于檢測池中；渦旋或搖振0.30.5分鐘均勻；(2)儀器參數設置激光能量參數選擇200mw，積分時間參數選擇20秒，用此兩個參數調節最佳拉曼峰強度；(3)掃描用拉曼光譜儀在2502300cm"的范圍內，以8cnTi的分辨率掃描測試樣品；于5分鐘內讀取或記錄或保存拉曼光譜測試結果。連續掃描光譜3次，最后得3次掃描光譜的平均光譜。其余同實施例l。試驗例l:使用本發明實施例l的檢測方法，采用美國光納科技公司(OptoTraceTechnologies,Inc.)生產的便攜式拉曼光譜儀，對各種市售液態奶樣品進行三聚氰胺檢測，并用傳統的實驗室分析方法高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜-質譜-質譜聯用技術(HPLC-MS-MS)進行對比，分析結果見表l、表2、表3。表1.純牛奶中三聚氰胺分析結果對比編號產品名稱HPLC(PPm)HPLC/MS/MS(PPm)Raman(a.u.)定性定量(ppm)M08-879利樂包純奶1914.8154陽性7.4M08-880利樂包純奶<268陰性1.3M08-882利樂包純奶5.35.986陽性2.6M08-884利樂包純奶17.616.4158陽性7.7M08-886利樂包純奶4.44.888陽性2.7M08-889利樂包純奶5.36.190陽性2.9M08-891利樂包純奶14.813.9130陽性5.7M08-902純牛奶87.7128陽性5.5M08-904純牛奶7.87.7132陽性5.8M08-907純牛奶8.78.7144陽性6.7M08-910純牛奶8.57.3113陽性4.5M08-914純牛奶10.49.2151陽性7.2M08-952純牛奶32.489陽性2.7M08-954純牛奶7.26.8117陽性4.8M08-957未來星活力型純牛奶3.54.287陽性2.7M08掘3未來星活力型純牛奶3.54.383陽性2.49M08-謂5未來星活力型純牛奶2.69.883陽性2.4M08-1010未來星活力型純牛奶4.75.498陽性3.4M08-1011未來星活力型純牛奶45.292陽性M08-1013未來星活力型純牛奶5.96.8109陽性4.2M08-1018未來星活力型純牛奶6.26.6103陽性3.8M08-1022未來星活力型純牛奶<2<263陰性1M08-1023純牛奶<2<259陰性0.7M08-腦雞蛋味早餐奶<2<256陰性0.5表2.酸牛奶分析結果對比HPLCLC/MS緒Raman定量編號產品名稱(ppm)Cppm)(a.u.)定性(ppm)M08掘l草莓味酸酸乳<2<264陰性UM08—1113瓶裝香蕉味酸牛奶<2<255陰性0.4M08-1117瓶裝草莓味酸牛奶<2<254陰性0.4蘭-U18瓶裝香蕉味酸牛奶<2<256陰性0.5M08-1120冠益乳桑葚果粒酸牛奶<2<257陰性0.6M08-1121冠益乳桑葚果粒酸牛奶<2<258陰性0.6M08-1122黃桃果粒杯酸酸牛奶<2<257陰性0.6M08-1123木糖醇杯酸酸牛奶<2<255陰性0.4M08-1124冠益乳原味杯酸酸牛奶<2<256陰性0.5M08-1125葡萄+藍莓杯酸酸牛奶<2<255陰性0.4M08-1126草莓果粒杯酸酸牛奶<2<257陰性0.5M08-1127LABS黃桃果粒杯酸酸牛奶<2<259陰性0.7M08-1128LABS葡萄果粒杯酸酸牛奶<2<254陰性0.4表3.生鮮奶分析結果對比編號種類HPLC測定結果(ppm)Ranmii(a.u.)定性定量(ppm)M08掘原奶0.0260陰性0.5M08-002原奶0.16661陰性0.5M08-003原奶0.23961陰性0.5M08-005原奶0.1860陰性0.5M08-006原奶0.5968陰性1.0M08-007原奶0.0557陰性0.3M08-008原奶0.1854陰性0.1M08-009原奶0.1561陰性0.5M08-010原奶0.08756陰性0.3M08-011原奶0.0160陰性0.5M08-012原奶0.06659陰性0.4M08-013原奶0.01856陰性0.3M08-014原奶0.01457陰性0.3M08-015原奶0.05362陰性0.610<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>試驗例2:采用本發明實施例1的檢測試劑和檢測方法，使用必達泰克公司生產的便攜式拉曼光譜儀，對生鮮奶盲樣進行三聚氰胺檢測，與傳統的液相色譜-質譜-質譜聯用技術(HPLC-MS-MS)檢測，分析結果見表4。表4.生鮮奶盲樣分析結果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>試驗例3:使用本發明實施例l的檢測試劑和檢測方法，采用美國光納科技公司(OptoTraceTechnologies,Inc.)生產的便攜式拉曼光譜儀，參加了科技部會同質檢總局、農業部、衛生部等部門聯合組織的對生鮮奶中三聚氰胺盲樣進行現場定性測試考試，現場公示的分析結果見表5。表5.生鮮奶盲樣現場定性測試考試結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>試驗例4:使用本發明實施例l的檢測試劑和檢測方法，采用美國光納科技公司(OptoTraceTechnologies,Inc.)生產的便攜式拉曼光譜儀，參加了科技部會同質檢總局、農業部、衛生部等部門聯合組織的對生鮮奶中三聚氰胺盲樣進行現場定量測試考試，現場公示的分析結果見表6。表6.生鮮奶盲樣現場定量測試考試結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>以上所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，并非對本發明的范圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護范圍內。權利要求1.一種用于液態奶中三聚氰胺現場快速檢測的拉曼光譜法，其特征在于液態奶樣品用水或pH＝2～pH＝14的水溶液以1～10倍的稀釋比例稀釋后，進行離心，吸取離心后中間層的勻質試液于預先加好檢測試劑的2mL的檢測池中，渦旋或搖振均勻，置檢測池于便攜式拉曼光譜儀檢測室中在250～2300cm-1的范圍內進行拉曼光譜掃描檢測獲得拉曼光譜圖，依據所獲得的拉曼光譜圖，選用特征頻率下三聚氰胺的拉曼光譜信號，以內標信號為基準，采用歸一化方法，根據三聚氰胺的拉曼光譜信號的相對強度與三聚氰胺含量的線性比例關系，對液態奶樣品中三聚氰胺進行現場快速的定量和定性檢測。2.根據權利要求1所述的拉曼光譜法，其特征在于所述水為二次蒸餾水或去離子水；所述pH-2pH-14的水溶液為鹽酸或檸檬酸或氫氧化鉀或氫氧化鈉調制而成。3.根據權利要求1或2所述的拉曼光譜法，其特征在于所述稀釋后的液態奶樣品進行離心時，渦旋或搖振0.31分鐘勻質，取勻質后的試液0.8mL~1.3mL于1.5mL離心管或3mL4mL于5mL離心管或6mL~8mL于10mL離心管，置于離心機，于1000~16000r/min轉速下離心l-5分鐘。4.根據權利要求1的拉曼光譜法，其特征在于所述檢測試劑包括以下用量的試劑(1)檢測試劑A:銀膠體水溶液50~500(2)檢測試劑B:0.5M5M的可電離出C1"的電介質水溶液100^L;(3)檢測試劑C:0.5M~2M的堿性溶液10~300^L。5.根據權利要求4的拉曼光譜法，其特征在于所述檢測試劑B為CaCl2水溶液或MgCl2水溶液或KC1水溶液或NaCl水溶液。6.根據權利要求4的拉曼光譜法，其特征在于所述檢測試劑C為氫氧化鈉水溶液或氫氧化鉀水溶液。7.根據權利要求1的拉曼光譜法，其特征在于所述液態奶樣品離心后中間層的勻質試液的加樣量為50-300^L。8.根據權利要求7的拉曼光譜法，其特征在于所述加樣量為100~200)iL。9.根據權利要求1的拉曼光譜法，其特征在于所述便攜式拉曼光譜儀的激光光源發射波長為532nm或785nm。10.—種在權利要求l所述的拉曼光譜法中使用的檢測試劑盒，其特征在于包括以下試劑:(1)檢測試劑A:銀膠體水溶液；(2)檢測試劑B:0.5M5M的可電離出C1"的電介質水溶液；(3)檢測試劑C:0.5M2M的堿性溶液。全文摘要一種用于液態奶中三聚氰胺現場快速檢測的拉曼光譜法，液態奶樣品用水或pH＝2～pH＝14的水溶液以1～10倍的稀釋比例稀釋后，進行離心，吸取離心后中間層的勻質試液于預先加好檢測試劑的2ml的檢測池中，渦旋或搖振均勻，置檢測池于便攜式拉曼光譜儀檢測室中在250～2300cm<sup>-1</sup>的范圍內進行拉曼光譜掃描檢測獲得拉曼光譜圖，依據所獲得的拉曼光譜圖，選用特征頻率下三聚氰胺的拉曼光譜信號，以內標信號為基準，采用歸一化方法，根據三聚氰胺的拉曼光譜信號的相對強度與三聚氰胺含量的線性比例關系，對液態奶樣品中三聚氰胺進行現場快速的定量和定性檢測。本發明的方法，樣品前處理簡單，可實現準確的定性和定量分析，實驗耗材成本低廉，可進行現場快速檢測、易于普及推廣。文檔編號G01N21/65GK101477051SQ20081022508公開日2009年7月8日申請日期2008年10月28日優先權日2008年10月28日發明者張孝芳,鄒明強,陳彥長,馬寒露,齊小花申請人:中國檢驗檢疫科學研究院