專利名稱：一種鹽酸克倫特羅的酶促化學發光免疫吸附的測定方法
技術領域：
本發明屬于化學發光免疫檢測技術領域，具體涉及一種用于飼料、尿樣、 動物源食品尤其是動物組織制品和動物尿液中鹽酸克倫特羅的檢測方法。
背景技術：
鹽酸克倫特羅(clenbuterol, CL):又稱瘦肉精、氨哮素、克喘素，是(32-腎上素受體激動劑(簡稱(3-興奮劑)。化學名稱為羥曱叔丁腎上腺素，白色或類 白色的結晶粉末，無臭、味苦，熔點161。C。該藥物可選擇性地作用于腎上腺素 受體，是一種強效激動劑，可引起交感神經興奮，動物食了含有鹽酸克倫特羅 的飼料，能夠改善營養的代謝途徑，促進動物肌肉，特別是骨骼肌蛋白質的合 成，抑制脂肪合成的積累，從而加速動物生長速度，瘦肉相對增加。 一般來"i兌， 飼料中添加適量的鹽酸克倫特羅以后，可使豬等畜禽生長速度、飼料轉化率、 酮體瘦肉率提高10%以上。因此，習慣上稱其為"瘦肉精"。在體內代謝慢，當 給動物用藥90天，宰前停藥5天，仍在尿液、血液、肌肉、和肝臟4全出克倫特 羅。其化學結構穩定，在體內不會破壞分解，以原藥形式排出體外。研究顯示 克倫特羅完全耐受100。C高溫。要經過126。C油煎5分鐘才會破壞減半。因此， 常規烹調對肉食品克倫特羅殘留不起破壞作用。人食入克倫特羅后發生中毒。 臨床表現為心跳加速、四肢顫抖、腹痛頭暈，同時伴有呼吸困難、惡心嘔吐等 癥狀。長期食用，可致染色體畸變，誘發惡性腫瘤。
近年來，動物性產品中鹽酸克倫特羅殘留對人類健康造成的危害以及對生 態食物鏈的破壞，已逐漸引起人類的高度重視。自1986年開始，歐美等發達國 家已嚴禁畜牧業中應用CL,我國農業部、對外經濟貿易合作部、國家出入境檢 疫局也多次發文嚴厲打擊非法使用CL的行為。但仍有人在偷偷使用，市場調查結果顯示CL的檢出率仍很高，個別地區達20%以上。由此可見，開展瘦肉精 殘留檢測技術的研究及產業化的勢在必行。
目前，檢測鹽酸克倫特羅殘留的方法主要有高效液相色i普法(HPLC ), 氣相色譜-質譜(GC-MS)，毛細管區帶電泳法(CE),免疫技術法等。高效液相 色譜法(HPLC),氣相色譜-質譜(GC-MS)，雖然靈敏度高，特異性好，但是 操作繁瑣且費用高。目前用的較多的免疫技術方法為ELISA方法和化學發光免 疫分析(CLIA)方法，ELISA可檢測多個樣品，但是靈敏度和分辨率滿足不了 曰益提高的檢測要求，酶促化學發光免疫吸附測定法是將特異性的抗體或包被 抗原包被成酶促化學發光載體，加入待檢樣品，然后加入酶標抗原或者抗體， 樣品中的待檢物質與酶標抗原或者抗體竟爭性的與發光載體上的抗體或者抗原 結合，經洗滌去除未結和的游離物，加入酶標二抗，洗滌后加入酶促化學發光 底物，再加入酶促化學發光液。根據酶促反應的強度和結合在載體上的抗原或 抗體的量成正相關，和樣品中待檢物質的含量呈負相關，繪制標準曲線，依標 準曲線推算出樣品中待檢物質的濃度。CLIA具有ELISA高通量的優點同時彌補 了 EL1SA靈敏度分辨率低的缺點，是一種更理想的檢測方法。目前市場上尚無 該方法的檢測試劑盒，利用CLIA研制克倫特羅的檢測方法，具有更好的經濟和 社會意義。
發明內容
本發明的目的在于提供一種靈敏度高，檢測范圍寬、操作簡便快速、穩定 性好的鹽酸克倫特羅檢測方法。
為實現本發明的目的，采用如下技術方案
本發明的 一種鹽酸克倫特羅的酶促化學發光免疫吸附的測定方法，首先制 備鹽酸克倫特羅的全抗原或鹽酸克倫特羅的抗體，然后制備酶促化學發光載體， 封裝后貯存備用；
檢測時，在所述酶促化學發光載體上加入待檢樣品，然后加入相對應的鹽 酸克倫特羅的抗體；洗滌去除未結合的游離物后，加入酶標二抗，洗滌后加入酶促化學發光底物，再加入酶促化學發光液；根據酶促反應的強度，繪制標準
曲線，依所述標準曲線推算出鹽酸克倫特羅的濃度；或者
-險測時，在所述酶促化學發光載體上加入待^^羊品，然后加入相對應的酶
標鹽酸克倫特羅得到的鹽酸克倫特羅全抗原；洗滌去除未結合的游離物后，加 入酶促化學發光底物，再加入酶促化學發光液；根據酶促反應的強度，繪制標 準曲線，依所述標準曲線推算出鹽酸克倫特羅的濃度。 所述的制備酶促化學發光載體，具體如下
用0.05M pH 9.5的碳酸鹽緩沖液為包被所述的鹽酸克倫特羅的全抗原的稀 釋液，或用0.05M pH 9.5的碳酸鹽緩沖液為包被所述的鹽酸克倫特羅的抗體的 稀釋液，將所述的稀釋后的鹽酸克倫特羅的全抗原或所述的稀釋后的鹽酸克倫 特羅的抗體包被在所述微孔板上，于4。C放置24h，再用0.05MpH7.2的磷S吏緩 沖液配制的1 %牛血清白蛋白溶液進行封閉。
所述的制備酶促化學發光載體，進一步包括如下步驟在經過封閉拍干后 37。C干燥箱兩小時烤干后，加干燥劑真空包裝制備而成。
所述的酶標二抗為酶標抗鹽酸克倫特羅抗體。
所述的酶促化學發光液為魯米諾、異魯米諾或鳥嘌呤-過氧化氫-鈷(II)。
所述的酶促化學發光液為輝光型。
所述的酶促化學發光液進一步含有相應的增強劑。
所述的酶促化學發光底物為過氧化氫或過氧化脲溶液。
所述的過氧化脲溶液是將過氧化脲溶解于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，其 中，過氧化脲和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的質量體積比為0.3g: 1000ml。
本發明采用竟爭性的固相酶促化學發光免疫吸附檢測原理，通過化學交聯 的方法將鹽酸克倫特羅半抗原與具有免疫原性的蛋白載體交聯形成人工合成全 抗原作為包被抗原，或者與具有催化作用的酶交聯形成酶標抗原。將鹽酸克倫
特羅特異性的抗體或包被抗原包被酶促化學發光載體，加入待檢樣品，然后加 入酶標抗原或者抗體，樣品中的克倫特羅與酶標抗原或者抗體竟爭性的與發光 載體上的抗體或者抗原結合，經洗滌去除未結合的游離物，再加入酶促化學發光底物，再加入酶促化學發光液。根據酶促反應的強度和結合在載體上的抗原 或抗體的量成正相關，和樣品中克倫特羅的含量呈負相關，繪制標準曲線，依 標準曲線推算出CL的濃度。
本發明方法靈敏度高，檢測范圍寬、操作簡便快速、穩定性好，因而具有 廣闊的應用前景。
圖1是本發明的鹽酸克倫特羅的酶促化學發光免疫吸附的^r測方法的原理
圖2是本發明的鹽酸克倫特羅的酶促化學發光免疫吸附的檢測方法的一個 優選實施例的檢測標準曲線圖。
具體實施例方式
為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例以及附圖，進一步闡述本 發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。 實施例一各種原料的制備
(1) 免疫抗原的制備
采用重氮偶合反應，CL分子上的氨基在亞硝酸鈉與鹽酸的作用下形成重氮 鹽，此重氮鹽在堿性條件下與牛血清白蛋白(BSA)上的酚羥基反應，形成以 偶氮鍵相聯的結合物免疫原；同法合成酶標抗原。然后將合成產物置入pH 7.4 10mM磷酸鹽緩沖液4。C攪拌透析2天，每天換液2次，以去除未結合的CL和 其它小分子物質，透析后真空冷凍干燥，-20°(2密閉保存。采用紫外分光光度法 掃描測定CL-BSA中的CL濃度以及BSA濃度進行鑒定。半抗原與蛋白質分子 的結合比計算公式為結合比=(OD值偶聯物-OD值蛋白質)/OD值CL分子量。
(2) 特異性抗體的制備
(D動物免疫選4^6周齡，雌性，BALB/C小鼠，將CL-BSA重氮偶聯抗 原與福氏完全佐劑等量混合、乳化，經腹部皮下多點注射，進行基礎免疫。4周后進行第二次免疫，抗原劑量同基礎免疫，抗原與福氏不完全佐劑混合、乳化， 對小鼠進行加強免疫。8周后，進行第三次免疫，免疫條件同第二次。第三次免
疫后第7~ 10天，測定抗體效價，取脾細胞。
②細胞融合脾細胞按10: 1比例與Sp2/0瘤細胞進行細胞融合，培養 G)雜交瘤細胞克隆化采用有限稀釋法分別與CL-OVA呈陽性反應的雜交
瘤細胞林進行3次克隆，選取ELISA篩選陽性率達到100%的細胞抹且OD450 最高的細胞林。
④細胞的保存在克隆和擴增時及時地將細胞抹凍存在液氮罐中。細胞按 原始細胞庫，種子細胞庫和生產細胞庫三級管理辦法保存。每株細胞均做備份 分別凍存在不同的液氮罐中。
腹水制備將細胞抹復蘇后，培養于含15%胎牛血清的DMEM培養液中 進行擴增。然后接種于用降植烷處理過的BALB/C小鼠腹腔內，每只小鼠腹腔 內注射0.5x107細胞/ml。 7天后小鼠開始產生腹水。釆用單次處死采集的方法收 集腹水，保證腹水的均一性。最多從一只小鼠中可以獲得6ml左右的腹水。
⑥抗體的分離純化利用飽和硫酸胺分段鹽析法對腹水進行粗純。粗純的 抗體經透析除鹽后過Protein G柱子純化。先用結合^爰沖液平衡Protein G層析柱 然后加入混合有結合緩沖液的粗純抗體溶液，經結合、洗滌和洗脫收集洗脫樣 品中和后，將樣品放在0.02PB, pH7.4的緩沖液透析過夜，透析液再離心 12000rpm, 20min。取上清即為純化抗體。
(3 )酶促化學發光載體的包被選用0.05M pH 9.5碳酸鹽緩沖液為包被抗 原稀釋液，4°C 24h包被于微孔板，0.05MpH 7.2的PBS配制的1%BSA溶液進 行封閉，抗體稀釋液選用Tris-HCl緩沖體系加入10%d 、牛血清。
(4)酶促化學發光液的制備選用魯米諾ii液中添加有相應的增強劑制備 而成。
(5 )酶促化學發光底物的制備稱取0.3g過氧化脲溶于1000ml磷酸氫二鈉 -檸檬酸緩沖液中，充分溶解。實施例二包被鹽酸克倫特羅全抗原的S^1化學發光免疫吸附的檢測方法
如圖1A所示，包被鹽酸克倫特羅全抗原的酶促化學發光免疫吸附的檢測方 法的原理為將鹽酸克倫特羅抗原包被為酶促化學發光栽體，加入待檢樣品，然 后加入酶標抗體，樣品中的克倫特羅抗體與酶標抗體竟爭性的與發光載體上的 抗原結合，經洗滌去除未結和的游離物，加入酶標二抗，洗滌后加入酶促化學 發光底物，加入酶促化學發光液。根據酶促反應的強度和結合在載體上的抗原 的量成正相關，和樣品中克倫特羅的含量呈負相關，繪制標準曲線，依標準曲 線推算出CL的濃度。具體操作如下
1) 量取所需體積的包被液，按比例加入所需的抗原，搖勻；取所需數量未 使用過的發光板，拍板一次；將多道加樣器調整至100微升，裝上槍頭， 每孔100微升進行包被；加完包被液的板子封上封板膠，置于4"冰箱中 過夜；次日用洗液洗板一次，拍干；每孔加入120微升封閉溶液，封上 封板膠，置于4。C冰箱中過夜；次日拍干，置于37。C恒溫箱中2小時； 將包被好的微孔板放入鋁箔袋中，放干燥劑封口。制得發光板。
2) 抗體稀釋液選用Tris-HCl緩沖體系加入10%小牛血清。量取所需體積的 抗體稀釋液加入所需量的克倫特羅抗體搖勻即制得克倫特羅抗體工作
液；
3) 量取所需量的酶標二抗稀釋液，加入所需量的酶標抗體搖勻即制得酶標 抗體工作液；
4) 去克倫特羅純品使用0.01M PH 7.0的PB配制成O.l、 0.3、 0.9、 2.7、 8.1ng/ml的溶液作為標準品。
5) 往發光板微孔中加入標準溶液或試樣液20pl/孔，然后加入克倫特羅抗體 工作液100pl/孔，用蓋板膜封板，37。C恒溫反應30min。
6) 倒出孔中液體，將發光板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。加滿洗 液，15s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復操作共洗板5次。
7) 酶標記物加入酶標記物100pl/孑L,用蓋板膜封板，37。C恒溫反應30min。 耳又出發光板，如前述洗板5次；8) 每孔加入過氧化氫、魯米諾各50W，輕輕振蕩混勻，置于化學發光儀器 上5 ~ 10min內讀數；
9) 結果判定所獲得的每個濃度標準溶液和樣本發光度值的平均值(B)除 以第一個標準(0標準)的發光度值(B0)再乘以100%，即百分發光度值。
百分吸光度值(％) =B/B0x 100% B—標準溶液或樣本溶液的平均發光度值 B0—0ng/ml標準溶液的平均發光度值 以標準品百分發光率為縱坐標，以克倫特羅標準品濃度(ng/ml)的對數為 橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分發光率代入標準曲線中，從標準曲線 上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中克倫特羅實際濃 度。
實施例三包被鹽酸克倫特羅抗體的il^化學發光免疫吸附的檢測方法
如圖1B所示，為包被鹽酸克倫特羅抗體的酶促化學發光免疫吸附的檢測方 法的原理，將鹽酸克倫特羅特異性的抗體包被為酶促化學發光載體，加入待檢 樣品，然后加入酶標抗原，經洗滌去除未結合的游離物，加入酶促化學發光底 物，再加入酶促化學發光液。根據酶促反應的強度和結合在載體上的抗原的量 成正相關，和樣品中克倫特羅的含量呈負相關，繪制標準曲線，依標準曲線推 算出CL的濃度。具體操作如下
1) 量取所需體積的包被液，按比例加入所需的抗體，搖勻；取所需數量未 使用過的發光板，拍板一次；將多道加樣器調整至IOO微升，裝上槍頭， 每孔100微升進行包被；加完包被液的板子封上封板膠，置于4。C冰箱中 過夜；次日用洗液洗板一次，拍干；每孔加入120微升封閉溶液，封上 封板膠，置于4。C冰箱中過^^;次日拍干，置于37。C恒溫箱中2小時； 將包被好的微孔板放入鋁箔袋中，放干燥劑封口。制得發光板。
2) 酶標抗原稀釋液選用Tris-HCl緩沖體系加入10%小牛血清。量取所需體積的抗原稀釋液加入所需量的酶標抗原搖勻即制得酶標抗原工作液；
3) 克倫特羅純品使用0.01M PH7.0的PB配制成0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/ml
的溶液作為標準品。
4) 往發光板微孔中加入標準溶液或試樣液20|111/孔，然后加入酶標工作液 100pl/孔，用蓋板膜封板，37。C恒溫反應30min。
5) 倒出孔中液體，將發光板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。加滿洗 液，15s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復操:作共洗一反5次。
6) 每孔加入過氧化脲、異魯米諾各50pl，輕輕振蕩混勻，置于化學發光儀 器上5~ 10min內讀數
以第一個標準(O標準)的發光度值(B0)再乘以100%,即百分發光度值。
百分吸光度值(％) =B/B0xl00% B—標準溶液或樣本溶液的平均發光度值 BO—Ong/ml標準溶液的平均發光度值 如圖2所示，以標準品百分發光率為縱坐標，以克倫特羅標準品濃度(ng/ml) 的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖，得到的標準曲線為y=-38.79x+37.36, R2=0.999 。將樣本的百分發光率代入標準曲線中，乂人標準曲線上讀出樣本所對 應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中克倫特羅實際濃度。
最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本 發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的 普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而 不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
權利要求
1、一種鹽酸克倫特羅的酶促化學發光免疫吸附的測定方法，其特征在于，首先制備鹽酸克倫特羅的全抗原或鹽酸克倫特羅的抗體，然后制備酶促化學發光載體，封裝后貯存備用；檢測時，在所述酶促化學發光載體上加入待檢樣品，然后加入相對應的鹽酸克倫特羅的抗體；洗滌去除未結合的游離物后，加入酶標二抗，洗滌后加入酶促化學發光底物，再加入酶促化學發光液；根據酶促反應的強度，繪制標準曲線，依所述標準曲線推算出鹽酸克倫特羅的濃度；或者檢測時，在所述酶促化學發光載體上加入待檢樣品，然后加入相對應的酶標鹽酸克倫特羅得到的鹽酸克倫特羅全抗原；洗滌去除未結合的游離物后，加入酶促化學發光底物，再加入酶促化學發光液；根據酶促反應的強度，繪制標準曲線，依所述標準曲線推算出鹽酸克倫特羅的濃度。
2、 根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述的制備酶促化學發 光載體，具體如下用0.05M pH 9.5的碳酸鹽緩沖液為包被所述的鹽酸克倫特羅的全抗原的稀 釋液，用0.05M pH 9.5的碳酸鹽緩沖液為包被所述的鹽酸克倫特羅的抗體的稀 釋液，將所述的稀釋后的鹽酸克倫特羅的全抗原或所述的稀釋后的鹽酸克倫特 羅的抗體包^皮在所述孩i孔板上，于4。C放置24h，再用0.05MpH7.2的磷酸緩沖 液配制的1 %牛血清白蛋白溶液進行封閉。
3、 根據權利要求2所述的測定方法，其特征在于，所述的制備酶促化學發 光載體，進一步包括如下步驟在經過封閉拍干后，37。C干燥箱兩小時烤干后， 加干燥劑真空包裝制備而成。
4、 根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述的酶標二抗為酶標抗鹽酸克倫特羅抗體。
5、 根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述的酶促化學發光液 為魯米諾、異魯米諾或鳥嘌呤-過氧化氬-鈷(II)。
6、 根據權利要求5所述的測定方法，其特征在于，所述的酶促化學發光液的發光類型為輝光型。
7、 根據權利要求5所述的測定方法，其特征在于，所述的酶促化學發光液 進一步含有相應的增強劑。
8、 根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，所述的酶促化學發光底 物為過氧化氫或過氧化脲溶液。
9、 根據權利要求8所述的測定方法，其特征在于，所述的過氧化脲溶液是 將過氧化脲溶解于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，其中，過氧化脲和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的質量體積比為0.3g: 1000ml。
全文摘要
本發明公開了一種鹽酸克倫特羅的酶促化學發光免疫吸附的測定方法，在包被了鹽酸克倫特羅的全抗原的酶促化學發光載體上加入待檢樣品，然后加入鹽酸克倫特羅抗體；洗滌，加入酶標二抗，洗滌后加入酶促化學發光底物，再加入酶促化學發光液；或者在包被了鹽酸克倫特羅抗體的酶促化學發光載體上加入待檢樣品，然后加入酶標鹽酸克倫特羅全抗原；洗滌，加入酶促化學發光底物，再加入酶促化學發光液；根據酶促反應的強度，繪制標準曲線，依所述標準曲線推算出鹽酸克倫特羅的濃度。本發明的方法靈敏度高，檢測范圍寬、操作簡便快速、穩定性好，因而具有廣闊的應用前景。
文檔編號G01N33/543GK101446587SQ20081022040
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月25日 優先權日2008年12月25日
發明者丁煥中, 周炬華, 曾振靈, 李紹旭 申請人:曾振靈;丁煥中;周炬華;李紹旭