專利名稱：：一種檢測牛乳中免疫球蛋白lgG含量的試劑盒及預包被酶標板的制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種檢測牛乳球蛋白含量的試劑盒及預包被酶標板的制備方法。
背景技術：
：免疫球蛋白G(IgG)作為牛初乳中一種非常重要的免疫因子，其含量的多少是衡量牛初乳及其產品優劣的一個重要指標。IgG也是免疫乳及其制品的主要功能成分，其含量是免疫乳及其制品質量好壞的最重要標準。對牛乳IgG的檢測還可以評估常乳中是否摻有牛初乳以及判斷牛乳是否摻假。因而，牛乳IgG的檢測對于乳制品的質量控制有著非常重要的意義。目前檢測牛乳中免疫球蛋白lgG的手段主要有以下幾類一、免疫單向擴散、免疫雙向擴散以及火箭免疫電泳，這些方法具有操作簡便、設備要求低的優點，但存在著檢測時間長、精確性差的缺點；二、膠體金免疫層析技術雖然可以快速檢測，但只局限于定性或半定量檢測，無法達到精確檢測的目的；三、高效液相和毛細管電泳雖然能夠快速、精確檢測，但對設備和操作人員的要求極高，不適合常規工廠和普通試驗室分析，普及困難。
發明內容本發明是為了解決現有檢測手段中存在檢測時間長和精確性差或對設備和操作人員的要求極高造成普及困難的缺陷，而提供一種檢測牛乳中免疫球蛋白lgG含量的試劑盒及預包被酶標板的制備方法。本發明檢測牛乳中免疫球蛋白lgG含量的試劑盒是由10嗎的牛免疫球蛋白lgG、1.0mL的辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體稀釋液、50mL的稀釋液、50mL洗滌液、10mL的反應終止液和20mL的顯色液制成；其中辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體稀釋液是將辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體用pH值為8.0的Tris緩沖液稀釋至9000~11000倍；稀釋液為pH值為8.0的Tris緩沖液；洗滌液為Tween20質量濃度為0.05%、pH值為8.0的Tris緩沖液；反應終止液為濃度為2mol/L的硫酸；顯色液按照體積份數由20份的pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、1份的DMSO濃度為2g/L的TMB溶液和0.064份的質量濃度為0.75%的11202水溶液組成。本發明檢測牛乳中免疫球蛋白lgG含量的預包被酶標板按照以下方法制備一、用戊二醛質量濃度為0.8%、pH值為9.6的Tris緩沖液將兔抗牛IgG抗體稀釋400500倍，向酶標板上各孔加入兔抗牛IgG抗體稀釋液10(^L，再將加入抗體稀釋液后的酶標板在37'C的條件下孵育2h或在4"C的條件下用包被液進行包被816小時，再將酶標板各孔洗滌3次；二、向步驟一洗滌后的酶標板各孔加入含有明膠質量濃度為1°/。、pH值為8.0的Tris緩沖液200pL，在37。C的條件下孵育lh后再洗滌3次；三、向步驟二洗滌后的酶標板在-20。C的條件下保溫lh后，再在-2(TO-4(TC的條件下真空冷凍干燥810h;即得到預包被酶標板；其中步驟一和步驟二的洗滌為向酶標板上各孔加入250^LTween20質量濃度為0.05%、pH值為8.0的Tris緩沖液，靜置3分鐘后，再將孔內的溶液吸盡。本發明的試劑盒具有以下優點1、簡化了酶聯免疫吸附法檢測牛乳中免疫球蛋白lgG過程的操作步驟，縮短了檢測時間，單次檢測時間僅需34小時，而免疫單向擴散法和火箭免疫電泳法的檢測時間通常需要至少8小時和24小時，同時試劑盒的檢測結果靈敏度可達到ng級；2、試劑盒的檢測范圍在100~1000ng/mL之間，試劑盒的檢測靈敏度達30ng/mL，在檢測時組內變異系數為1.86%~4.22%，組間變異系數為3.82%9.86%，回收率為98.07%~105.36%，具有很好的可重復性和可靠性；3、操作人員不需要特殊培訓，易于普及。本發明制備的預包被酶標板具有以下優點本發明的酶標板縮短免疫吸附法檢測免疫球蛋白lgG的檢測時間，可在34小時完成檢測分析，簡化了操作，提高檢測準確性；將本發明制備的預包被酶標板和本發明的試劑盒配合使用檢測牛乳中免疫球蛋白lgG含量，使用方便，對操作人員沒有特殊要求，有效縮短了檢測時間，檢測結果準確，檢測費用低，單次檢測成本為5元左右。具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方4式間的任意組合。具體實施方式一本實施方式檢測牛乳中免疫球蛋白lgG含量的試劑盒是由10叱的牛免疫球蛋白lgG、l.OmL的辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體稀釋液、50mL的稀釋液、50mL洗滌液、10mL的反應終止液和20mL的顯色液制成；其中辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體稀釋液是將辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體用pH值為8.0的Tris緩沖液稀釋至900011000倍；稀釋液為pH值為8.0的Tris緩沖液；洗滌液為Tween20質量濃度為0.05%、pH值為8.0的Tris緩沖液；反應終止液為濃度為2mol/L的硫酸；顯色液按照體積份數由20份的pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、1份的DMSO濃度為2g/L的TMB溶液和0.064份的質量濃度為0.75%的11202水溶液組成。本實施方式的辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體購于美國sigma畫aldrich公司。具體實施方式二本實施方式與具體實施方式一的不同點為辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體稀釋液是將辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體用pH值為8.0的Tris緩沖液稀釋至10000倍。其它與具體實施方式一相同。用本實施方式的試劑盒測定牛乳中免疫球蛋白lgG含量的方法按如下步驟進行一、樣品處理取待測液態乳樣在6'C、離心速度為5000r/min的條件下離心30min，取10mL的下層脫脂乳樣，用雙蒸水稀釋至1000mL，再從稀釋后的溶液中取10mL溶液，再用雙蒸水稀釋至1000mL，混勻后從再次稀釋后的溶液中取100pL樣品溶液，用pH8.0Tris緩沖液稀釋至lmL，得到處理好的樣品；二、抗原添加取預包被好的酶標板，以其中一孔不加任何溶液作為空白對照孔，以另一孔加入100pL、pH8.0Tris緩沖液作為陰性對照孔，將濃度為100ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、750ng/mL和1000ng/mL的IgG標準溶液分別加入酶標板中，每個孔的IgG標準溶液加入量為100^，再將步驟一處理好的樣品溶液加入酶標板的其余各孔，每個孔的加入量為lOO(iL，然后在37。C的條件下孵育lh，再洗滌5次；三、酶標抗體添加酶標抗體采用10000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體，每孔加入酶標抗體100pL，空白對照孔不加酶標抗體，在37。C的條件下孵育lh，然后洗滌5次；四、添加酶促反應底物向酶標板各孔添加顯色液100pL，在37"C5的條件下孵育812min;五、加終止液待標準品的100ng/mL、125ng/mL和250ng/mL三孔有明顯的梯度藍色，并且500ng/mL、750ng/mL禾B1000ng/mL三孔沒有出現藍色時，每孔加入濃度為2mol/L的H2S0450pL;六、酶標儀檢測以空白對照孔校領，450nm波長檢測；七、標準曲線繪制以牛IgG標準品濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得出線性方程(y=0.5417Lnx-2.3222，R2為0.998，x-標準樣品的濃度，y:酶標儀檢測得到的吸光值)；八、樣品中IgG含量的計算根據所得的線性方程，計算出樣品溶液中IgG的含量，然后用樣品溶液中IgG的含量乘以樣品稀釋的倍數，最終得出樣品中IgG的含量；其中步驟二和步驟三的洗滌為向酶標板上各孔加入含有Tween20質量濃度為0.05°/。、pH值為8.0的Tris緩沖液250pL，靜置3分鐘后，將孔內的溶液吸盡；步驟四的顯色液按照體積份數由20份的pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、1份的DMSO(二甲基亞砜)濃度為2g/L的TMB(3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺)溶液和0.064份的濃度為0.75%的&02水溶液組成。用本實施方式的試劑盒和免疫透射比濁法對同一牛初乳產品進行檢測，測定其免疫球蛋白IgG含量，每組試驗5個重復(n=5)，檢測結果如表l所示，用T檢驗對結果進行比較，免疫透射比濁法和本實施方式試劑盒測定免疫球蛋白IgG含量差異不顯著(P>0.05)，表1的數據說明本實施方式的試劑盒檢測結果具有良好準確性。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>取3種不同濃度的牛初乳樣品溶液，分別在其中再加入3種不同濃度的IgG標準溶液，混勻，共制成9個待測樣品。按照試劑盒樣品檢測步驟分別測定牛初乳樣品溶液、混合溶液中IgG的含量并據此計算試劑盒的回收率，試驗結果見表2所示，表2說明用本實施方式制備的試劑盒測定IgG的回收率為98.07%105.36%，這說明本實施方式的試劑盒可靠性良好。表2待測樣序號樣品溶液中IgG含量(ng/mL)加入標準IgG含量(ng/mL)IgG實測值(ng/mU回收率(％)1162.491100273.726104.282192.985100302.273103.173181.227100296.301105.364162.491200372.242102.695192.985200394.203層.316181.227200379.32199.507162.491400567.160100.838192.985400581.54098.079181.2274005W.759101.64本實施方式的試劑盒檢測靈敏度達到ng級。具體實施方式三本實施方式檢測牛乳中免疫球蛋白lgG含量的預包被酶標板按照以下方法制備一、用戊二醛質量濃度為0.8%、pH值為9.6的Tris緩沖液將兔抗牛IgG抗體稀釋500倍，向酶標板上各孔加入兔抗牛IgG抗體稀釋液100pL，再將加入抗體稀釋液后的酶標板在37°C的條件下孵育2h或在4°C的條件下采用包被液進行包被816小時，再將酶標板各孔洗滌3次；二、向步驟一洗滌后的酶標板各孔加入含有明膠質量濃度為1%、pH值為8.0的Tris緩沖液200pL，在37。C的條件下孵育lh后再洗滌3次；三、向步驟二洗滌后的酶標板在-20'C的條件下保溫lh后，再在-2(TC-4(TC的條件下真空冷凍干燥8~10h;即得到預包被酶標板；其中步驟一和步驟二的洗滌為向酶標板上各孔加入250pLTween20質量濃度為0.05%、pH值為8.0的Tris緩沖液，靜置3分鐘后，再將孔內的溶液吸盡。本實施方式的兔抗牛IgG抗體購于美國sigma-aldrich公司。本實施方式步驟一中包被液的用量為每孔90110pL。具體實施方式四本實施方式與具體實施方式三的不同點為步驟一將兔抗牛IgG抗體稀釋450倍。其它步驟及參數與具體實施方式三相同。本實施方式的酶標板測試后在450nm的波長下吸光值最高，此時抗原抗體的比例最合適，能夠滿足抗原濃度為1000ng/mL時的抗體需要。具體實施方式五本實施方式與具體實施方式三的不同點為步驟一所用酶標板為96孔。其它步驟及參數與具體實施方式三相同。具體實施方式六本實施方式與具體實施方式四的不同點為:步驟一中在4'C的條件下包被1014小時。其它步驟及參數與具體實施方式四相同。具體實施方式七本實施方式與具體實施方式四的不同點為步驟一中在4。C的條件下包被12小時。其它步驟及參數與具體實施方式四相同。具體實施方式八本實施方式與具體實施方式七的不同點為步驟一中包被液為含有戊二醛質量濃度為0.8%、pH值為9.6的Tris緩沖液。其它步驟及參數與具體實施方式七相同。本實施方式用含有戊二醛質量濃度為0.8%、pH值為9.6的Tris緩沖液進行包被增強了兔抗牛IgG抗體對酶標板的包被效果。具體實施方式九本實施方式與具體實施方式九的不同點為步驟三中在-25r-35。C的條件下真空冷凍干燥S.59.5h。其它步驟及參數與具體實施方式九相同。具體實施方式十本實施方式與具體實施方式九的不同點為步驟三中在-30^的條件下真空冷凍干燥9h。其它步驟及參數與具體實施方式九相同。具體實施方式十一本實施方式與具體實施方式十一的不同點為步驟三中真空冷凍干燥的真空度為24Pa。其它步驟及參數與具體實施方式十一相同。具體實施方式十二本實施方式檢測牛乳中免疫球蛋白lgG含量的預包被酶標板按照以下方法制備一、用戊二醛質量濃度為0.8%、pH值為9.6的Tris緩沖液將兔抗牛IgG抗體稀釋500倍，向酶標板上各孔加入兔抗牛IgG抗體稀釋液100nL,再將加入抗體稀釋液后的酶標板在4'C的條件下采用包被液進行包被12小時，再將酶標板各孔洗滌3次；二、向步驟一洗滌后的酶標板各孔加入含有明膠質量濃度為1%、pH值為8.0的Tris緩沖液200pL，在37'C的條件下孵育2h后再洗滌3次；三、向步驟二洗滌后的酶標板在-2(TC的條件下保溫lh后，再在-30'C的條件下真空冷凍干燥9h;即得到預包被酶標板；其中步驟一和步驟二的洗滌為向酶標板上各孔加入250(iLTween20質量濃度為0.05%、pH值為8.0的Tris緩沖液，靜置3分鐘后，再將孔內的溶液吸盡。本實施方式步驟一中包被液為含有戊二醛質量濃度為0.8%、pH值為9.6的Tris緩沖液。本實施方式步驟三的真空冷凍干燥的真空度為3Pa。用本實施方式的方法制備六塊酶標板，將其中三塊置于37。C溫箱中放置，其它的在4t:的條件下保存，每天取一塊在溫箱中保存的酶標板與一塊在4°C8保存的酶標板一同檢測同一抗原，配合具體實施方式二的試劑盒使用，以此來證實酶標板和試劑盒的穩定性，由T檢驗結果可知，37。C溫箱放置三天的酶標板和4'C存放的酶標板測定免疫球蛋白IgG含量差異不顯著(P>0.05)，說明本實施方式制備的酶標板穩定性良好，可以在fC存放半年。用具體實施方式二的試劑盒與本實施方式制備的酶標板配合使用測定牛乳中免疫球蛋白lgG含量的方法按如下步驟進行一、樣品處理取待測液態乳樣在6'C、離心速度為5000r/min的條件下離心30min，取10mL的下層脫脂乳樣，用雙蒸水稀釋至1000mL，再從稀釋后的溶液中取10mL溶液，再用雙蒸水稀釋至1000mL，混勻后從再次稀釋后的溶液中取100pL樣品溶液，用pH8.0Tris緩沖液稀釋至lmL，得到處理好的樣品；二、抗原添加取預包被好的酶標板，以其中一孔不加任何溶液作為空白對照孔，以另一孔加入lOO(iL、pH8.0Tris緩沖液作為陰性對照孔，將濃度為100ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、750ng/mL和1000ng/mL的IgG標準溶液分別加入酶標板中，每個孔的IgG標準溶液加入量為100pL，再將步驟一處理好的樣品溶液加入酶標板的其余各孔，每個孔的加入量為100pL，然后在37"C的條件下孵育lh，再洗滌5次；三、酶標抗體添加酶標抗體采用10000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體，每孔加入酶標抗體100pL，空白對照孔不加酶標抗體，在37'C的條件下孵育lh，然后洗滌5次；四、添加酶促反應底物向酶標板各孔添加顯色液100pL,在37。C的條件下孵育812min;五、加終止液待標準品的100ng/mL、125ng/mL和250ng/mL三孔有明顯的梯度藍色，并且500ng/mL、750ng/mL和1000ng/mL三孔沒有出現藍色時，每孔加入濃度為2mol/L的H2S045(HiL;六、酶標儀檢測以空白對照孔校領，450nrn波長檢測；七、標準曲線繪制以牛IgG標準品濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得出線性方程(y=0.5417Lnx-2.3222，R2為0.998，x=標準樣品的濃度，y-酶標儀檢測得到的吸光值)；八、樣品中IgG含量的計算根據所得的線性方程，計算出樣品溶液中IgG的含量，然后用樣品溶液中IgG的含量乘以樣品稀釋的倍數，最終得出樣品中IgG的含量；其中步驟二和步驟三的洗滌為向酶標板上各孔加入含有Tween20質量濃度為0.05%、pH值為8.0的Tris緩沖液250^，靜置3分鐘后，將孔內的溶液吸盡；步驟四的顯色液按照體積份數由20份的pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、1份的DMSO(二甲基亞砜)濃度為2g/L的TMB(3，3',5,5'-四甲基聯苯胺)溶液和0.064份的質量濃度為0.75%的&02水溶液組成。用10倍稀釋的雞血清、lmg/mL的大豆分離蛋白、10倍稀釋的豆漿、1mg/mL的干酪素溶液以及lmg/mL的乳清濃縮蛋白溶液代替抗原溶液加入酶標板上各孔中反應，陰性對照組采用稀釋液，陽性對照組采用100ng/mL標準牛IgG溶液，其它操作步驟與正常檢測相同，檢測結果如表3所示，表3的數據能夠看出陰性對照組與IO倍稀釋的雞血清組間差異不顯著(P>0.01)，陽性對照組與lmg/mL的乳清濃縮蛋白溶液組間差異不顯著(P>0.01)，而lmg/mL的大豆分離蛋白組、IO倍稀釋的豆漿組、lmg/mL的干酪素溶液組與陰性對照組、陽性對照組組間差異顯著(PO.Ol)。這表明本實施方式制備的酶標板和具體實施方式二的試劑盒所用的抗體具有較好的特異性。表3干擾物吸光值陰性對照組(n=4)0.047±0.004a陽性對照組(n=8)0.197±0.006bIO倍稀釋的雞血清(n=8)0.050±0.004almg/mL的大豆分離蛋白(n=8)0.060±0.003eIO倍稀釋的豆漿(n=8)0.089±0.005d1mg/mL的干酪素溶液(n=8)0.111±0.006elmg/mL的乳清濃縮蛋白溶液(n=8)0.199±0.012b注Duncan,a=0.01.字母在同一列數據中，相同則表示差異不顯著，不同則表示差異顯著。取一個牛初乳粉樣品，用稀釋液將其稀釋成lUg/mL的樣品溶液。將其樣品溶液分別加入到本實施方式制備酶標板上的24孔中，根據所得到的實驗結果計算樣品溶液中IgG的含量，并計算出標準差，數據如表4所示，表4看出通過實驗得出樣品溶液中IgG的含量為240.166±9.652ng/mL。本實施方式制備的酶標板和具體實施方式二的試劑盒配合使用檢測的靈敏度為標準差的3倍，艮卩30ng/mL。表4樣品溶液中IgG的含量f±(ng/mL)240.166±9.652檢測次數(n)24變異系數(cv)%4.02試劑盒靈敏度(ng/mL)3010權利要求1、一種檢測牛乳中免疫球蛋白1gG含量的試劑盒，其特征在于檢測牛乳中免疫球蛋白1gG含量的試劑盒是由10μg的牛免疫球蛋白1gG、1.0mL的辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體稀釋液、50mL的稀釋液、50mL洗滌液、10mL的反應終止液和20mL的顯色液制成；其中辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體稀釋液是將辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體用pH值為8.0的Tris緩沖液稀釋至9000～11000倍；稀釋液為pH值為8.0的Tris緩沖液；洗滌液為Tween20質量濃度為0.05％、pH值為8.0的Tris緩沖液；反應終止液為濃度為2mol/L的硫酸；顯色液按照體積份數由20份的pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、1份的DMSO濃度為2g/L的TMB溶液和0.064份的質量濃度為0.75％的H2O2水溶液組成。2、一種檢測牛乳中免疫球蛋白lgG含量的預包被酶標板的制備方法，其特征在于檢測牛乳中免疫球蛋白lgG含量的預包被酶標板按照以下方法制備一、用戊二醛質量濃度為0.8%、pH值為9.6的Tris緩沖液將兔抗牛IgG抗體稀釋至400500倍，向酶標板上各孔加入兔抗牛IgG抗體稀釋液100^iL，再將加入抗體稀釋液后的酶標板在37'C的條件下孵育2h或在4"C的條件下用包被液進行包被816小時，再將酶標板各孔洗滌3次；二、向步驟一洗滌后的酶標板各孔加入含有明膠質量濃度為1%、pH值為8.0的Tris緩沖液200pL，在37t:的條件下孵育lh后再洗滌3次；三、向步驟二洗漆后的酶標板在-2(TC的條件下保溫lh后，再在-2(TC-40。C的條件下真空冷凍干燥810h;即得到預包被酶標板；其中步驟一和步驟二的洗滌為向酶標板上各孔加入250pLTween20質量濃度為0.05%、pH值為8.0的Tris緩沖液，靜置3分鐘后，再將孔內的緩沖液吸盡。3、根據權利要求2所述的檢測牛乳中免疫球蛋白lgG含量的預包被酶標板的制備方法，其特征在于步驟一將兔抗牛IgG抗體的稀釋450倍。4、根據權利要求3所述的檢測牛乳中免疫球蛋白lgG含量的預包被酶標板的制備方法，其特征在于步驟一中包被液為含有戊二醛質量濃度為0.8%、pH值為9.6的Tris緩沖液。全文摘要一種檢測牛乳中免疫球蛋白1gG含量的試劑盒及預包被酶標板的制備方法，它涉及了一種檢測牛乳免疫球蛋白含量的試劑盒及預包被酶標板的制備方法。它解決了現有檢測手段中存在檢測時間長和精確性差或對設備和操作人員的要求極高造成普及困難的缺陷。本發明的試劑盒是由免疫球蛋白1gG標準品、辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG抗體、稀釋液、洗滌液、反應終止液和顯色液制成。本發明的預包被酶標板按照以下方法制備一、稀釋抗體，包被；二、加入緩沖液，孵育；三、冷凍干燥；即得到制備好的預包被酶標板。本發明的試劑盒和制備的酶標板配合使用具有使用方便，對操作人員沒有特殊要求，有效縮短了檢測時間，檢測結果準確的優點。文檔編號G01N33/543GK101477122SQ200810209860公開日2009年7月8日申請日期2008年12月31日優先權日2008年12月31日發明者剛吳,姜瞻梅,波田,霍貴成申請人:東北農業大學