專利名稱：：檢測人前列腺癌中17β一羥基類固醇脫氫酶7表達量的試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，具體地說，本發明涉及一種檢測人前列腺癌樣本中1713—羥基類固醇脫氫酶7(1713-HSD7)mRNA表達量的實時熒光定量PCR試劑盒。
背景技術：
：前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤之一。根據資料顯示，前列腺癌發病率和病死率存在明顯的地區差異，美國、北歐、西歐和澳洲是前列腺癌的高發地區，而亞洲和北非是相對低發地區。但前列腺癌低發地區從20世紀70年代起發病率也有大幅度上升的趨勢.。過去，我國前列腺癌發病率較低，但隨著人均壽命的延長、膳食結構的改變及診斷技術的進步，其發病率在逐年提高，已躍居為男性泌尿生殖系統惡性腫瘤的第三位。臨床目前的診斷技術主要有前列腺的腫瘤標志物、直腸指檢(DRE)、影像學檢查和前列腺穿剌活檢等。目前前列腺特異性抗原(PSA)作為一種無創簡便的檢測手段已被廣泛應用于前列腺癌的診治。然而一個理想的前列腺癌腫瘤標志物應具有前列腺特異性、能夠早期診斷腫瘤并能夠同良性前列腺增生癥相鑒別、便于檢測和隨訪等特點。顯然這些并不是PSA就能夠全部滿足的，因此，尋找更多的腫瘤標志物，對于前列腺癌的早期診斷和治療有重要意義。人17P-羥基類固醇脫氫酶(17P-HSD7)是一個膜相關還原酶，它是催化低生物活性的雌酮生成為與高生物活性的雌二醇的關鍵酶之一，并能轉化雙氫睪酮為5a-雄烷-313，1713-二元醇，其催化還原的部位為底物17位點或3位點的酮基團。1713-HSD7對黃體酮和20a—羥基孕酮次要的313-HSD樣活性也被檢測到。人17P-HSD7存在于生成類固醇的組織和一些周緣組織，象肝、肺和胸腺，除了性激素外17P-HSD7也有其它的底物，在膽固醇的生物合成中，1713-HSD7起酮類固醇還原酶作用。將酵母甾酮轉化為酵母甾醇。1713-HSD7作為性激素代謝的關鍵酶之一與前列腺癌的發生與發展有著密切的關系，其表達量在在前列腺癌的病程中呈現規律的變化，因此檢測17P-HSD7的表達量對于前列腺癌的早期診斷，治療，預后評估都有著潛在的價值。傳統的基因檢測技術主要運用聚合酶鏈反應(PCR)或逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)的方法大量擴增待測基因，然后通過溴化乙錠染色和瓊脂糖凝膠電泳定量待測基因。以上方法有著極高的高靈敏度，但基于PCR反應的特點，反應終點的產物量往往無法正確反映反應初始階段DNA的含量，因此定量不夠精確，同時其檢測的分辨率也不高，DNA的量的差異如果低于五倍，往往檢測不出。
發明內容本發明的目的是提供一種檢測人前列腺癌樣本中1713—羥基類固醇脫氫酶7(17P-HSD7)mRNA表達量的實時熒光定量PCR試劑盒。本發明的試劑盒包含2X逆轉錄反應液，20X逆轉錄酶，DEPC-H20，2XPCR反應液，20X檢測用引物、熒光探針，標準品。其中2X逆轉錄反應液含有RT緩沖液、DEPC-H20、Oligo(dT)、dNTPs、Rnasin。其中2XPCR反應含有PCR緩沖液，MgCl2，dNTPs，Taq酶。所述的檢測用引物包括17P-HSD7上游引物序列5'-GCGAAGATGCGAAAGGTGG-3'17P-HSD7下游引物序列5'-CATGTTCCTGCACGCCAAAC-3'GAPDH上游引物序列5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'GAPDH下游引物序列5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'所述的熒光探針包括17P-HSD7熒光探針5'-FAM-GAAAGGTGGTTTTGATCACCG-TAMRA-3'GAPDH熒光探針5'-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA-3'本發明中，2X逆轉錄反應液，2XPCR反應液，DEPC-H20保存于4t:;20X逆轉錄酶，20X檢測用引物、熒光探針保存于_20°C。標準品為人前列腺癌細胞系LNCaP的cDNA。本發明試劑盒具有如下特點近年來不斷完善的實時定量PCR技術，在PCR反應體系中加入了熒光基團，利用熒光信號的積累監控整個PCR的進程，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA精確定量。由于只對指數期反應的產物進行檢測和熒光基團的信號放大作用，它克服了傳統PCR的定量不精確，分辨率低的缺點。本發明建立了利用T叫man技術檢測17P-HSD7表達的方法，并經檢測患者表明該方法切實可行。由于本方法采用了PCR擴增技術，使得1713-HSD7表達的檢測敏感性大大提高，使得臨床實踐中可以在極少的標本中獲得足夠的信息，而且由于熒光探針的應用使得特異性也大大提高，降低了常規PCR擴增的假陽性率。本方法所設計的引物、探針以及檢測結果可以為熒光定量PCR檢測試劑盒的開發提供可靠的依據。在本發明中，采用了目前特異性最高的的熒光探針雜交定量PCR檢測技術，在保持高敏感性的前提下能盡量減少假陽性干擾。在實時熒光定量PCR檢測技術出現之前，人們對PCR模板的無法精確定量，都是通過PCR產物電泳，再將電泳結果進行計算機圖像處理，根據電泳條帶的亮度來確定最終PCR產物的量，即使PCR條件以最優化，電泳及后續步驟的操作的不穩定因素仍會給結果分析帶來影響。實時熒光定量PCR技術的出現，臨床檢驗中可以真正地做到對PCR模板的精確定量，這種定量不僅保持了常規PCR的高靈敏性，而且由于特異性熒光探針雜交技術的應用，使得被檢測基因的特異性大大提高。本發明試劑盒使用方法如下每次檢測應設立陽性和陰性對照。標準品可做陽性對照，也可使用自行制備的前列腺癌DNA樣本，陰性對照用DEPC-H20即可。逆轉錄總體積20iil，其中2ii1待測RNA，10iU2X逆轉錄反應液，1yl20X逆轉錄酶，7ii1DEPC-H20。25°C10分鐘，37。C120分鐘。擴增在熒光定量PCR以上進行，總體積為lOiU，其中2iU檢測樣品，5iU2XPCR反應液，0.5iU20X檢測用引物、熒光探針，2.5iUDEPC-H20。反應條件95。C104分鐘變性，95t:15秒、60。C1分鐘進行40個循環。圖1是HSD17B7標準曲線。圖2是GAPDH標準曲線。具體實施例方式本發明結合具體實施例做進一步說明。應理解，實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發明范圍。實施例1熒光定量RT-PCR檢測人前列腺癌樣本中17P-HSD7的表達量—、實驗材料Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；匪LV逆轉錄酶，TaqDNA聚合酶，OligodT購自美國Promega公司；7900HT熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。二、引物及探針設計與合成以17P-HSD7，GAPDH全長cDNA序列為模板，使用PrimerExpress2.0軟件分析T叫Man引物和探針位點，選取最佳組合。檢測用引物17P-HSD7上游引物序列5'-GCGAAGATGCGAAAGGTGG-3'17P-HSD7下游引物序列5'-CATGTTCCTGCACGCCAAAC-3'GAPDH上游引物序列5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'GAPDH下游引物序列5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'熒光探針17P-HSD7熒光探針5'-FAM-GAAAGGTGGTTTTGATCACCG-TAMRA-3'GAPDH熒光探針5'-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA-3'均由Invitrogen公司合成。三、標準曲線的繪制取標準品按十倍梯度進行稀釋，濃度依次為5000ng/iil，500ng/iil，50ng/ia，5ng/iU，0.5ng/iil，各取2iil，在10ia總反應體積內用7900HT熒光定量PCR儀進行擴增檢測，反應條件為95°C10分鐘變性，95t:15秒、6(TC1分鐘進行40個循環。通過檢測得到的Ct值繪制標準曲線。四、樣本檢測采集10例前列腺癌患者的癌組織待測樣本和1例健康男性的前列腺樣本，用Trizol試劑提取細胞總RNA，取2iilRNA在20iil反應體積內用OligodT進行逆轉錄，之后分別用1713-HSD7和GAPDH的引物，熒光探針在7900HT熒光定量PCR儀進行擴增檢測，反應條件為95°C10分鐘變性，95t:15秒、6(TC1分鐘進行40個循環。得到每個樣本針對17P-HSD7禾口GAPDH的Ct值。五、樣品檢測結果檢測結果用待測樣本和健康樣本的比值(Ratio)表示，計算公式如下Ratio=2_AACt=2(Ct，h_Ct，g)control-(Ct，h_Ct，g)test其中(Ct，h-Ct，g)control表示健康組樣本17P-HSD7Ct值與GAPDHCt的差值；(Ct，h-Ct，g)test表示待測樣本17P-HSD7Ct值與GAPDHCt的差值，Ct，h表示17P-HSD7Ct值，Ct，g表示GAPDH基因Ct值。檢測結果顯示，本方法可以真正地做到對PCR模板的精確定量，該定量不僅保持了常規PCR的高靈敏性，而且被檢測基因的特異性明顯提高。表1為檢測結果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用做參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講述內容之后，本領域技術人員可以對本發明做各種改動或修改，這些形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求檢測人前列腺癌中17β一羥基類固醇脫氫酶7表達量的試劑盒，其特征是所述的試劑盒含有2×逆轉錄反應液，20×逆轉錄酶，焦碳酸乙二酯處理的水，2×聚合酶鏈反應液，20×檢測用引物、熒光探針，標準品，其特征是2×逆轉錄反應液含有逆轉錄緩沖液、焦碳酸乙二酯處理的水、寡聚(dT)、dNTPs、RNA酶抑制劑，2×聚合酶鏈反應液含有聚合酶鏈緩沖液、耐熱DNA聚合酶，MgCl2，dNTPs。2.根據權利要求l所述的檢測人前列腺癌中1713—羥基類固醇脫氫酶7表達量的試劑盒，其特征是，所述的20X檢測用引物、熒光探針含有1713—羥基類固醇脫氫酶7上游引物、下游引物、熒光探針，3-磷酸甘油醛脫氫酶上游引物、下游引物、熒光探針，其中1713—羥基類固醇脫氫酶上游引物序列為5'-GCGAAGATGCGAAAGGTGG-3'1713—羥基類固醇脫氫酶下游引物序列為5'-CATGTTCCTGCACGCCAAAC-3'1713—羥基類固醇脫氫酶熒光探針為5z-FAM-GAAAGGTGGTTTTGATCACCG-TAMRA-3'3_磷酸甘油醛脫氫酶上游引物序列為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'3_磷酸甘油醛脫氫酶下游引物序列為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'3_磷酸甘油醛脫氫酶熒光探針為5'-FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-TAMRA-3'。3.根據權利要求l所述的檢測人前列腺癌中1713—羥基類固醇脫氫酶7表達量的試劑盒，其特征是，所述的標準品為人前列腺癌細胞系LNCaP的cDNA。全文摘要本發明屬于生物
技術領域：
，涉及一種檢測人前列腺癌樣本中17β一羥基類固醇脫氫酶7(17β-HSD7)mRNA表達量的實時熒光定量PCR試劑盒。本試劑盒含有2×逆轉錄反應液，20×逆轉錄酶，焦碳酸乙二酯處理的水，2×聚合酶鏈反應液，20×檢測用引物、熒光探針，標準品。本發明建立了利用Taqman技術檢測17β-HSD7表達的方法，并經檢測實踐表明，本發明試劑盒及檢測方法切實可行。由于本方法采用了PCR擴增技術，使得17β-HSD7表達的檢測敏感性大大提高，可以在極少的標本中獲得足夠的信息，由于熒光探針的應用使得特異性也大大提高，降低了常規PCR擴增的假陽性率。文檔編號G01N21/64GK101760525SQ20081020754公開日2010年6月30日申請日期2008年12月26日優先權日2008年12月26日發明者姜梅,李瑤,毛裕民,謝毅申請人:復旦大學