一種光纖生物傳感器探頭及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：：一種光纖生物傳感器探頭及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種光纖生物傳感器探頭及其制備方法，以及一種包含該光纖生物傳感器探頭的檢測系統及其應用。
背景技術：
：免疫學分析方法的發展已有50多年的歷史，繼50年代的免疫熒光(IFA)和60年代的放射免疫(RIA)分析技術之后，用酶來標記抗原或抗體的分析技術在70年代初期就已建立了起來。由于酶的高效生物催化作用，一個酶分子在數分鐘內可以催化幾十甚至幾百個底物分子發生反應，產生了放大作用，使得原來微乎其微的抗原或抗體在數分鐘后就可被識別出來，這種技術被稱為酶聯免疫吸附試驗法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA)，該方法自70年代初期由VANWEEMEN、SCHUARSENGVALL及PERLMARN等相繼分別報道后，現已引起廣泛重視和使用。ELISA法作為免疫診斷中的一項新技術，現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據已經使用的結果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易于自動化操作等特點。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本，因此，也適合于血清流行病學調查。ELISA法不僅可以用來測定抗體，而且也可用于測定體液中的循環抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。近些年來，生物傳感器是一個非常活躍的研究領域，它與生物信息學、生物芯片、生物控制論、仿生學、生物計算機等學科一起，處在生命科學和信息科學的交叉區域。生物傳感器是發展生物技術必不可少的一種先進的檢測方法與監控方法，也是物質分子水平的快速、微量分析方法。它們的共同特征是探索和揭示出生命系統中信息的產生、存儲、傳輸、加工、轉換和控制等基本規律，探討應用于人類經濟活動的基本方法。光纖生物傳感器(opticfiberbiosensor)是一種以光纖傳導和收集光信號進行生物(抗原、抗體、酶、核酸、細胞等)檢測的儀器。它通過檢測生物反應所產生的光，包括光的強度、振幅、相位等參數確定被檢物質的量。夾層光纖傳感器的工作原理類似ELISA反應中的免疫夾心法。具體檢測過程是將末端固定有抗體的光纖浸入待測溶液中，檢測是否有能與之特異性結合的抗原；若待測溶液中含有抗原，就會與光纖末端的抗體特異性結合；再將結合了抗原的光纖浸入含有被酶標記的另一特異性抗體溶液中，酶標的抗體會與抗原特異性結合；最后把光纖端部浸在一個盛有化學發光底物或者熒光底物溶液的容器中，待測溶液中的抗原濃度越高，就有相應多的酶標記的抗體與其結合，光信號也就越強。光纖生物傳感器生物敏感材料(如抗原、抗體等)的固定對于傳感器檢測的靈敏度、穩定性等起著至關重要的作用。目前用于光纖表面生物敏感材料固定的方法多種多樣，主要有①通過三氨基丙基三乙基硅烷等硅烷類物質將光纖表面硅烷化，然后借助雙功能交聯劑戊二醛等，將抗原、抗體等敏感生物材料共價結合到光纖表面。②通過親和素生物素系統放大作用固定。親和素具有4個結合位點，可以和生物素特異性結合并起到放大作用，并且生物素親和素系統不會影響到生物敏感材料的活性，可以有效地提高傳感器的靈敏度。③溶膠凝膠法。應用硅酸鹽、瓊脂等形成的凝膠網格結構，可以將活的生物細胞固定在光纖表面，也能較長時間地保存細胞的活力。其它方法還包括吸附法，運用脂質雙層膜等固定方法。現有的固定方法都存在一些不足或缺陷，還需要尋找更好的修飾方法，運用更佳的材料，進一步提高光纖生物傳感器的性能。
發明內容本發明的目的是提供一種光纖生物傳感器探頭及其制備方法。本發明的另一目的是提供一種包含上述光纖生物傳感器探頭的檢測系統及其在體外定量檢測生物分子中的應用。為實現上述目的，本發明第一方面提供了一種光纖生物傳感器探頭，其特征在于，它是由光纖、共價連接在所述光纖的一個端面上的第一葡聚糖高分子、與所述第一葡聚糖高分子共價連接的第二葡聚糖高分子、和與所述第二葡聚糖高分子共價連接的生物分子組成，其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在30002000000(即葡聚糖T-3T-2000)范圍內，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能與被檢測分子特異性結合。—個優選的實施方案中，所述光纖是石英光纖。在另一個優選的實施方案中，所述生物分子選自抗原或者抗體。在一個較佳的實施方案中，所述第一葡聚糖高分子的分子量選自1000001000000(即葡聚糖T-100T-1000)，所述第二葡聚糖高分子的分子量選自10000IOOOOO(即葡聚糖T-10T-100)。在一個更佳的實施方案中，所述第一葡聚糖高分子的分子量為500000(即葡聚糖T-500)，所述第二葡聚糖高分子的分子量為40000(即葡聚糖T-40)。本發明第二方面提供了一種制備上述光纖生物傳感器探頭的方法，該方法的步驟如下a)將第一葡聚糖高分子與光纖的一個端面共價連接；b)將第二葡聚糖高分子與步驟a)中的共價連接到光纖端面上的第一葡聚糖高分子共價連接；c)將生物分子與步驟b)中的共價連接到第一葡聚糖高分子上的第二葡聚糖高分子共價連接；其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在30002000000(即葡聚糖T-3T-2000)范圍內，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能與被檢測分子特異性結合。在一個優選的實施方案中，該方法的步驟如下a)對光纖的一個端面進行羥基化處理，所述光纖優選石英光纖；b)將步驟a)得到的光纖端面上的羥基(優選硅羥基)通過Y-(2，3-環氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(GOPS)改性，與第一葡聚糖高分子共價連接(該第一葡聚糖高分子優選葡聚糖T-500);c)將步驟b)得到的光纖端面第一葡聚糖高分子上的醇羥基通過環氧氯丙烷(表氯醇)改性，與第二葡聚糖高分子共價連接(該第二葡聚糖高分子優選葡聚糖T-40);d)將步驟c)得到的光纖端面第二葡聚糖高分子上的醇羥基通過改性，與生物分子共價連接。本發明第三方面提供了一種光纖生物傳感器檢測系統，它包括至少一個上述光纖生物傳感器探頭、暗盒、以及光信號接收與處理裝置，其中，所述光纖生物傳感器探頭固定有生物分子的一端與暗盒連接，另一端與光信號接收與處理裝置連接。在一個優選的實施方案中，所述暗盒包含位置調節裝置，其上設有試劑池。在一個更優選的實施方案中，所述試劑池包括待測樣品池、酶標分子池、底物池、以及洗滌池。本發明第四方面涉及所述光纖生物傳感器檢測系統在體外定量檢測中的應用。在一個實施方案中，通過本發明所述光纖生物傳感器檢測系統可以定量檢測待測樣品(如血清或血漿)中的被檢測分子(如抗原或者抗體)。本發明光纖生物傳感器探頭使用了兩層葡聚糖高分子修飾共價固定光纖端面的生物分子(例如抗原或者抗體)，其優點在于①檢測靈敏度高；②葡聚糖保水性好，使得結合上去的生物分子(如抗體)不易失活變性；③經過兩層葡聚糖高分子修飾的光纖端面親水性好，可降低蛋白吸附，降低了檢測背景值。圖1顯示了光纖生物傳感器探頭端面示意圖。其中，DextranT-500代表第一葡聚糖高分子，DextranT-40代表第二葡聚糖高分子，Ab代表生物分子(抗體)。圖2顯示了光纖生物傳感器檢測系統示意圖。其中，1為光纖，2為固定有生物分子(抗體)的光纖端面，3為光信號接收與處理裝置，4為暗盒，5為位置調節裝置，6為待測樣品池，7、9為洗滌池，8為酶標分子池，10為底物池。圖3顯示了SCCA1抗原檢測標準工作曲線(實施例2)。圖4顯示了SCCA1抗原檢測標準工作曲線(實施例3)。圖5顯示了SCCA1抗原檢測標準曲線(實施例4，ELISA雙抗體夾心法)。具體實施方案具體而言，本發明提供了一種光纖生物傳感器探頭，它是由光纖、共價連接在所述光纖的一個端面上的第一葡聚糖高分子、與所述第一葡聚糖高分子共價連接的第二葡聚糖高分子、和與所述第二葡聚糖高分子共價連接的生物分子組成，其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在30002000000(即葡聚糖T-3T-2000)范圍內，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能與被檢測分子特異性結合。術語"光纖"也可稱之為"光導纖維"，是一種利用光在石英或塑料制成的纖維中的全反射原理而達成的光傳導工具。所述光纖可以是單模光纖(纖芯直徑812iim)，也可以是多模光纖(纖芯直徑5062.5iim);可以是單芯光纖，也可以是多芯光纖(例如4芯、6芯、8芯、10芯、12芯或14芯等)。在一個優選的實施方案中，本發明所述光纖為石英光纖，更優選是多模石英光纖。在另一優選的實施方案中，所述光纖的一端或兩端拋光。本發明所述葡聚糖高分子可以直接通過市售獲得，常見的葡聚糖規格(種類)包括但不限于，葡聚糖T-3(DextranT_3，分子量3000)、葡聚糖T_5(DextranT-5，分子量5000)、葡聚糖T-10(DextranT_10，分子量10000)、葡聚糖T_20(DextranT_20，分子量20000)、葡聚糖T-40(DextranT_40，分子量40000)、葡聚糖T-70(DextranT-70，分子量70000)、葡聚糖T-100(DextranT-IOO，分子量100000)、葡聚糖T-110(DextranT-110，分子量110000)、葡聚糖T-200(DextranT_200，分子量200000)、葡聚糖T-500(DextranT_500，分子量500000)、葡聚糖T-700(DextranT_700，分子量700000)、葡聚糖T-1000(DextranT-IOOO，分子量1000000)葡聚糖T-2000(DextranT-2000，分子量2000000)等。適用于本發明的葡聚糖高分子的分子量在30002000000(即葡聚糖T-3T-2000)范圍內，優選在100001000000(即葡聚糖T-10T-1000)范圍內。本發明中的第一葡聚糖高分子(本文中也稱為第一層葡聚糖高分子)的分子量應高于第二葡聚糖高分子(本文中也稱為第二層葡聚糖高分子)的分子量。在一個優選的實施方案中，所述第一葡聚糖高分子的分子量為所述第二葡聚糖高分子的分子量的2-20倍，更佳為5-15倍。在另一個優選的實施方案中，所述第一葡聚糖高分子的分子量選自100000IOOOOOO(即葡聚糖T-100T-1000)，所述第二葡聚糖高分子的分子量選自10000100000(即葡聚糖T-10T-100)。在一個更優選的實施方案中，所述第一葡聚糖高分子的分子量選自200000700000(即葡聚糖T-200T-700)，所述第二葡聚糖高分子的分子量選自2000070000(即葡聚糖T-20T-70)。在一個還要優選的實施方案中，所述第一葡聚糖高分子的分子量為500000(即葡聚糖T-500)，所述第二葡聚糖高分子的分子量為40000(即葡聚糖T-40)。本發明光纖生物傳感器探頭在光纖端面依次共價連接兩層葡聚糖高分子，使得在單位面積共價連接的生物分子(優選抗原或者抗體)數量增加，傳感器探頭的靈敏度也相應提高；此外，葡聚糖保水性好，使得結合上去的生物分子(如抗體)不易失活變性；并且，由于經過兩層葡聚糖高分子修飾的光纖端面親水性好，可降低蛋白吸附，也降低了檢測背景值。本發明另一方面提供了一種制備光纖生物傳感器探頭的方法，該方法的步驟如下a)將第一葡聚糖高分子與光纖的一個端面共價連接；b)將第二葡聚糖高分子與步驟a)中的共價連接到光纖端面上的第一葡聚糖高分子共價連接；c)將生物分子與步驟b)中的共價連接到第一葡聚糖高分子上的第二葡聚糖高分子共價連接；其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在30002000000(即葡聚糖T-3T-2000)范圍內，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能與被檢測分子特異性結合。具體而言，首先，對所述光纖(優選石英光纖)的一個端面進行羥基化處理，例如可以使用NaOH、HC1依次對光纖端面羥基化處理，或者也可以使用甲醇、甲醇與濃鹽酸的混合溶液、^02與NH4OH的混合溶液依次對光纖端面羥基化處理。上述這些羥基化處理方法是本領域中熟知的，本領域技術人員能夠根據具體情況選擇合適的反應條件和試劑濃度來實現光纖端面的羥基化。本領域技術人員還可采用其他常規方法來對光纖的端面進行羥基化處理。在對光纖端面進行羥基化處理后，再將光纖端面上的羥基(優選硅羥基)通過諸如Y-(2，3-環氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(GOPS)及其衍生物等硅烷偶聯劑改性，共價連接第一葡聚糖高分子(優選葡聚糖T-500)，從而形成第一(層)葡聚糖高分子；然后，將光纖端面第一葡聚糖高分子上的醇羥基通過諸如表氯醇(環氧氯丙烷)、表溴醇等鹵代環氧化合物改性，共價連接第二葡聚糖高分子(優選葡聚糖T-40)，從而形成第二(層)葡聚糖高分子；最后，將光纖端面第二葡聚糖高分子上的醇羥基通過改性(較佳的是通過丁二酸酐將醇羥基衍生化為羧基，羧基再衍生化為活性酯)，與生物分子(優選抗原或者抗體)共價連接。應當注意，上述步驟中實現共價連接的方式和試劑是本領域技術人員容易確定的。合適的偶聯劑可以選自，包括但不局限于多元醇化合物，如乙二醇、二乙二醇、丙二醇、三乙二醇、四乙二醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、二丙二醇、2，2，4-三甲基-1，3-丙二醇、聚丙二醇、甘油等；聚環氧化合物，如乙二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、甘油多縮水甘油醚、二甘油多縮水甘油醚、多甘油多縮水甘油醚、丙二醇二縮水甘油醚、聚丙二醇二縮水甘油醚和縮水甘油醚；聚胺化合物，如乙二胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、四亞乙基五胺、五亞乙基六胺和聚乙烯亞胺，及其無機或有機鹽；聚異氰酸酯化合物，如2，4_甲苯二異氰酸酯和己二異氰酸酯；鹵代環氧化合物，如表氯醇、表溴醇等；硅烷偶聯劑，如Y-氨基丙基三甲氧基硅烷、Y-環氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷及其衍生物等。因此，本發明的保護范圍不局限于本文實施例中所采用的共價連接試劑和方式。在本發明光纖生物傳感器探頭中，所述通過第一葡聚糖高分子和第二葡聚糖高分子的共價連接固定在光纖端面的生物分子應能與被檢測分子特異性結合。根據被檢測分子的不同，所述生物分子例如可以是抗體或者抗原。其中，所述抗原包括但不限于天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原等。天然抗原可取自動物組織、微生物培養物等，須經提取純化才能使用；重組抗原是抗原基因在質粒體中表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母為質粒體；而合成多肽抗原是根據蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。所述抗體一般應具有高親和力和高特異性，一般優選單克隆抗體。在一個具體的實施方案中，本發明還提供了一種制備所述光纖生物傳感器探頭的方法，它的方法如下a)用甲醇、甲醇與濃鹽酸的混合溶液、11202與NH4OH的混合溶液依次對光纖(優選石英光纖)的一個端面羥基化處理；b)將步驟a)得到的光纖端面上的羥基(優選硅羥基)通過Y-(2，3-環氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(GOPS)改性(即生成環氧基團)，共價連接葡聚糖T-500(即環氧基團與葡聚糖T-500上的醇羥基反應，共價連接)，形成第一(層)葡聚糖高分子；c)將步驟b)得到的光纖端面第一葡聚糖高分子上的醇羥基通過環氧氯丙烷(表氯醇)改性(即生成環氧基團)，共價連接葡聚糖T-40(即環氧基團與葡聚糖T-40上的醇7羥基反應，共價連接)，形成第二(層)葡聚糖高分子；d)將步驟c)得到的光纖端面第二葡聚糖高分子上的醇羥基通過改性，然后與生物分子(優選抗原或者抗體)共價連接。在一個優選的實施方案中，當步驟d)中的生物分子為抗原或者抗體時，所述步驟d)的具體實施方案為將步驟c)得到的光纖端面第二葡聚糖高分子上的醇羥基通過改性(較佳的是通過丁二酸酐將醇羥基衍生化為羧基，羧基再衍生化為活性酯)，生成的活性酯與抗原或者抗體上的氨基之間反應，共價連接。當然，為了進一步降低檢測時的背景干擾，還可以使用乙醇胺封閉未連接的活性酯，并將未固定的抗原或者抗體沖洗干凈。在本發明中，光纖端面經過了兩層葡聚糖高分子(優選第一層使用葡聚糖T-500,第二層使用葡聚糖T-40)的修飾，使得其上共價連接的生物分子(抗原或者抗體)密度達1.0士0.03pmol/cm、則其檢測靈敏度較高。而如果只使用一層葡聚糖高分子(優選葡聚糖T-500)修飾光纖端面，其上共價連接的生物分子(抗原或者抗體)密度只有0.35±0.02pmol/cm2。本發明還提供了一種光纖生物傳感器檢測系統，它包括至少一個上述光纖生物傳感器探頭、暗盒、以及光信號接收與處理裝置，其中，所述光纖生物傳感器探頭固定有生物分子的一端與暗盒連接，另一端與光信號接收與處理裝置連接。在本發明光纖生物傳感器檢測系統中，可以包括一個所述光纖生物傳感器探頭，也可以包括多個所述光纖生物傳感器探頭。當多個所述光纖生物傳感器探頭上固定不同的生物分子(針對不同被檢測分子)，就可實現對于同一待測樣品的多個檢測指標(被檢測分子)同時進行檢測。在本發明光纖生物傳感器檢測系統中，所述光信號接收與處理裝置是將光信號經光電轉換器件轉變為相應的電信號。在一個優選的實施方案中，所述暗盒包含位置調節裝置，其上可設有多個試劑池。根據待測樣品的具體種類、數量、檢測指標(被檢測分子)等，試劑池包括但不限于待測樣品池、酶標分子池、底物池、洗滌池等。其中，待測樣品池中含有待測樣品(其中可能含有被檢測分子，例如抗原或者抗體)，所述酶標分子池中含有酶標記的能與被檢測分子特異性結合的生物分子(如抗體或者抗原)，所述底物池中含有酶的化學發光底物，所述洗滌池中含有洗滌液。用于本發明的酶應符合以下要求能夠催化化學發光反應，純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩定，制備成酶標生物分子后仍繼續保留它的活性部分和催化能力。優選的酶包括優選辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)等。酶標記抗體或抗原的方法(酶標生物分子的制備方法)是本領域技術人員所熟知的，例如戊二醛交聯法、過碘酸鹽氧化法等。或者也可以通過市售直接獲得酶標記抗體或抗原。本發明所述酶的化學發光底物是指在化學發光反應中參與能量轉移并最終以發射光子的形式釋放能量的化合物，本領域技術人員也是熟知的。其中，氨基苯二酰肼類(主要是魯米諾、異魯米諾、及其衍生物)是最常用的一類化學發光底物。魯米諾(luminol，5-氨基-2，3-二氫-l，4-酞嗪二酮)可用作過氧化物酶(例如HRP)的底物。在本發明的一個實施方案中，選用了HRP標記的SCCA1的單抗，酶的化學發光底物選用了H202與魯米諾的混合物。此外，本發明所述洗滌液是本領域技術人員根據具體情況所能確定的，例如常用的ELISA洗滌液，優選的洗滌液為PBS-T緩沖液(即含0.05%(v/v)吐溫20(Tween-20)磷酸緩沖鹽水(PBS)，pH7.4)。設置在所述位置調節裝置上的試劑池的種類、個數本領域技術人員可以根據實際待測樣品的需要來確定。例如，如附圖2所示，當只使用一個所述光纖生物傳感器探頭檢測待測樣品中的一種檢測指標(被檢測分子)時，在所述暗盒中的位置調節裝置上可設有一個待測樣品池6、一個酶標分子池8、一個底物池10、以及兩個洗滌池7、9(或者也可只設置一個洗滌池，并在操作間隙更換洗滌液)。需要說明的是，本發明所述光纖生物傳感器檢測系統的工作原理可以類似ELISA反應中的多種類型，包括但不限于，雙抗體夾心法測抗原、雙抗原夾心法測抗體、間接法測抗體、競爭法測抗體、競爭法測抗原、捕獲包被法測抗體等，優選夾心法、間接法或競爭法。所不同的是通過光信號接收與處理裝置最終輸出是電信號，再根據標準工作曲線(或者曲線方程)得到被檢測分子的濃度。一般在本發明所述光纖生物傳感器檢測系統中有三個必需的試劑(l)固定在基質上的抗體或抗原，即通過兩層葡聚糖高分子層共價連接在所述光纖端面的生物分子；(2)酶標記的抗體或抗原，即置于所述酶標分子池中的酶標生物分子；(3)酶反應的底物，即置于所述底物池中的酶的化學發光底物。本發明還涉及所述光纖生物傳感器檢測系統在體外定量檢測中的應用。以上述雙抗體夾心法測抗原為例，其具體的檢測步驟為1)將所述光纖生物傳感器探頭固定有生物分子(如抗體)的一端浸入待測樣品池中，使所述生物分子(如抗體)與待測樣品中的被檢測分子(如抗原)發生特異性結合反應(優選37°C，反應10分鐘2小時)，拔出；2)將所述光纖生物傳感器探頭浸入洗滌池中清洗，拔出；3)將所述光纖生物傳感器探頭浸入酶標分子池中，使步驟1)結合上的被檢測分子(如抗原)與酶標生物分子(如酶標記的另一特異性抗體)發生特異性結合反應，(優選37t:，反應10分鐘2小時)拔出；4)將所述光纖生物傳感器探頭浸入另一洗滌池中清洗，拔出；5)將所述光纖生物傳感器探頭浸入底物池中，化學發光；6)光信號的接收與處理(通過光信號接收與處理裝置)，輸出電信號；7)根據輸出的電信號、以及標準工作曲線(或者曲線方程)，得到被檢測分子(如抗原)的濃度。其中，步驟7)的標準工作曲線(或者曲線方程)獲得的方法如下首先確定所要輸出的電信號(如電流等)；其次，將若干個已知不同濃度的標準樣品分別放入待測樣品池中，操作上述步驟l)—6)，得到與其對應的電信號(如電流等)；最后在二維坐標系中建立標準工作曲線(或者曲線方程)。當然，根據需要可以將多個固定有不同生物分子(優選抗原或者抗體)的所述光纖生物傳感器探頭集成在一起，就可實現對于同一待測樣品的多個檢測指標(被檢測分子)同時進行檢測。本領域技術人員能夠理解，本發明上述的各實施方案、優選實施方案以及更優選的實施方案可以以任意方式組合，所有這些組合后構成的技術方案均屬于本發明明確記載的內容。下面將結合實施例進一步詳細地描述本發明。然而應當理解，列舉這些實施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發明的范圍。實施例1光纖生物傳感器探頭的制備(—)兩層葡聚糖高分子修飾的光纖生物傳感器。a)光纖端面羥基化處理。先將光纖(PCS石英光纖，購自南京飛帝斯光纖機械電子工程制作中心)端面在甲醇中浸泡30分鐘，然后將其置于甲醇與濃鹽酸的混合溶液中，IO(TC處理25小時；然后再將光纖端面置于H202與NH40H的混合溶液中，8(TC處理28小時；將處理過的光纖端面用蒸餾水多次洗滌，并用氮氣吹干。b)光纖端面上的硅羥基通過G0PS改性，共價連接葡聚糖T-500，形成第一層葡聚糖高分子。將干燥的光纖端面置于10%(v/v)GOPS的丙酮溶液中，室溫反應過夜，反應結束后采用丙酮浸泡洗滌，并干燥；將上述處理過的光纖端面再置于0.3%(w/v)的T-500溶液中，反應812小時；反應結束后將光纖用0.1MNaOH多次洗滌，然后采用去離子水洗滌，并干燥。c)光纖端面第一層葡聚糖高分子上的醇羥基通過環氧氯丙烷改性，共價連接葡聚糖T-40，形成第二層葡聚糖高分子。將形成第一層葡聚糖高分子的光纖端面置于10%(v/v)環氧氯丙烷的NaOH溶液(2M)中，反應期間另添加50%(v/v)環氧氯丙烷的NaOH溶液(2M)，反應816小時，反應結束后先使用乙醇洗滌，再用去離子水洗滌，并干燥；將上述處理過的光纖端面再置于0.3%(w/v)的T-40中反應1218小時；反應結束將光纖用0.1MNaOH多次洗滌，然后采用去離子水洗滌，并干燥。d)光纖端面第二層葡聚糖高分子上的醇羥基通過改性與抗體共價連接。將形成第二層葡聚糖高分子的光纖端面與丁二酸酐在室溫下反應1836小時，反應結束多次用丙酮、水洗滌；然后置于10mg/ml1_(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC*HCl)，5mg/mlN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的PBS(50mM，pH7.4)溶液中，室溫反應30分鐘，反應結束用PBS快速洗滌；再置于30iig/ml的SCCA1(鱗狀細胞癌抗原)的單克隆抗體(scc01，B080811購自中資漢脈(北京)生物技術有限公司)中，4t:反應3小時；將上述固定有抗體(scc01)的光纖端面用乙醇胺封閉45分鐘，再用PBS-T洗滌2次，每次10分鐘。(二)一層葡聚糖高分子修飾的光纖生物傳感器。a)光纖端面羥基化處理。先將光纖(PCS石英光纖，購自南京飛帝斯光纖機械電子工程制作中心)端面在甲醇中浸泡30分鐘，然后將其置于甲醇與濃鹽酸的混合溶液中，IO(TC處理25小時；然后再將光纖端面置于H202與NH40H的混合溶液中，8(TC處理28小時；將處理過的光纖端面用蒸餾水多次洗滌，并用氮氣吹干。b)光纖端面上的硅羥基通過GOPS改性，共價連接葡聚糖T-500，形成一層葡聚糖高分子。將干燥的光纖端面置于10%(v/v)G0PS的丙酮溶液中，室溫反應過夜，反應結束后采用丙酮浸泡洗滌，并干燥；將上述處理過的光纖端面再置于0.3%(w/v)的T-500溶液中，反應812小時；反應結束將光纖用0.1MNaOH多次洗滌，然后采用去離子水洗滌，并干燥。c)光纖端面葡聚糖高分子上的醇羥基通過改性與抗體共價連接。將形成一層葡聚糖高分子的光纖端面與丁二酸酐在室溫下反應1836小時，反應結束多次用丙酮、水洗滌；然后置于10mg/ml1_(3-二甲基氨基丙基)_3_乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC*HCl)，5mg/mlN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的PBS(50mM，pH7.4)溶液中，室溫反應30分鐘，反應結束用PBS快速洗滌；再置于30iig/ml的SCCA1(鱗狀細胞癌抗原)的單克隆抗體(scc01，B080811購自中資漢脈(北京)生物技術有限公司)中，fC反應3小時；將上述固定有抗體(scc01)的光纖端面用乙醇胺封閉45分鐘，再用PBS-T洗滌2次，每次10分鐘。實施例2檢測樣品中SCCA1(鱗狀細胞癌抗原)的濃度(使用實施例1(一)中制得的光纖生物傳感器探頭檢測)(1)待測樣品電流信號的測定。將實施例1(一)中制得的光纖生物傳感器探頭裝入如圖2所示的光纖生物傳感器檢測系統中，該光纖生物傳感器探頭首先浸入待測樣品池中(待測樣品池中含有待測樣品l)，37°C，10min;清洗池中清洗后，再浸入酶標分子池中(酶標分子池中含有1:8000稀釋的HRP標記的SCCA1的另一個單抗，scc02，B080812購自中資漢脈(北京)生物技術有限公司)，37°C，10min;清洗池中清洗后，最后浸入底物池中(底物池中含有HRP的化學發光底物，SuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate37070，購自PIERCE公司)，化學發光，經過光信號接收與處理裝置(光電轉換器PC008)，輸出電信號(電流值)。重復以上步驟，檢測待測樣品2，同樣輸出一個與其對應的電信號(電流值)。(2)標準工作曲線(方程)的建立。將實施例1(一)中制得的光纖生物傳感器探頭分別浸入含有不同濃度SCCA1抗原標準品(sccAg，A080626購自中資漢脈(北京)生物技術有限公司)的待測樣品池中，重復(1)的步驟，得到一組電流信號值。實驗結果如表1所示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>樣品<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>標準工作曲線如圖3所示，曲線方程為y=0.0059x2+0.8305x_0.3472(R2=0.9998)，其中，y代表SCCAl抗原濃度(納克/毫升)，x代表電流值(XIO—1QA)。經檢測，待測樣品l輸出的電流值為4.2X10—"A，待測樣品2輸出的電流值為14.0X10—"A，則根據標準工作曲線方程得到待測樣品1中SCCA1抗原濃度為3.2納克/毫升，待測樣品2中SCCA1抗原濃度為12.4納克/毫升。實施例3檢測樣品中SCCA1(鱗狀細胞癌抗原)的濃度[ono](使用實施例1(二)中制得的光纖生物傳感器探頭檢測)將實施例l(二)中制得的光纖生物傳感器探頭裝入如圖2所示的光纖生物傳感器檢測系統中，按照實施例2(2)的方法建立標準工作曲線(方程)，并檢測相同的兩個待測樣品(待測樣品1、待測樣品2)。實驗結果如表2所示表2樣<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>標準工作曲線如圖4所示，曲線方程為y=0.0269x2+3.9789x+3.0187(R2=0.9973)，其中，y代表SCCA1抗原濃度(納克/毫升)，x代表電流值(X10—1QA)。經檢測，待測樣品1輸出的電流值為0.4X10—1QA，待測樣品2輸出的電流值為2.3X10—1QA，則根據標準工作曲線方程得到待測樣品1中SCCA1抗原濃度為4.6納克/毫升，待測樣品2中SCCA1抗原濃度為12.3納克/毫升。從檢測得到的數據及標準工作曲線分析，標準品5ng/ml時的電流輸出值僅為0.5X10—、，與空白對照(背景)電流輸出值0.3X10—"A區別很小，而待測樣品1的電流輸出值為0.4X10—"A，根據標準工作曲線方程計算出的濃度值極有可能不準確。實施例4使用ELISA法(雙抗體夾心)檢測樣品中SCCA1的濃度1.包被用包被液(pH9.6的50mM碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液)將單抗scc01(B080811購自中資漢脈(北京)生物技術有限公司)稀釋成0.5yg/ml，100y1/孔加至酶標板，4t:過夜。2.從4°C中取出包被好的酶標板，室溫平衡15分鐘。用pH7.4的PBS-0.05%(v/v)Tween20(PBS-T)洗滌液洗酶標板3次，200y1/次。3.封閉用PBS-T溶解的3%(w/v)BSA，每孔200iil，37t:溫育2小時。4.用PBS-T洗滌液洗板3次，200y1/次，拍干。5.加入不同濃度SCCA1抗原標準品(sccAg，A080626購自中資漢脈(北京)生物技術有限公司)以及待測樣品1、待測樣品2，100iU/孔，均做復孔，37t:溫育1小時。6.用PBS-T洗滌液洗板3次，200y1/次，拍干。7.加入l:8000稀釋的HRP標記的二抗scc02(B080812購自中資漢脈(北京)生物技術有限公司)，100iU/孔，37。C溫育1小時。8.用PBS-T洗滌液洗板3次，200y1/次，拍干。9.加底物TMB:A液+B液(體積比1:1)，即用即配，100y1/孔，37。C溫育23分鐘。10.終止加2M的硫酸，100ii1/孔。11.終止反應后，應在5分鐘內用酶標儀測定各孔在波長450nm處的吸收值(0D450nm)。具體數據見表3，標準曲線如圖5所示。曲線方程為y=14.368x2-0.2516x+0.1336(R2=0.9981)，其中，y代表SCCA1抗原濃度(納克/毫升)，x代表0045。值。經檢測，待測樣品1平均0D45。值為0.4750，待測樣品2平均0045。值為0.9335，則根據曲線方程得到待測樣品1中SCCA1抗原濃度為3.256納克/毫升，待測樣品2中SCCA1抗原濃度為12.419納克/毫升。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結果分析與討論本發明使用了三種方法檢測兩個待測樣品(待測樣品1、待測樣品2)，其結果匯總見表4。從該結果可知，使用實施例l(一)中制得的光纖生物傳感器探頭檢測的結果與ELISA雙抗體夾心法的檢測結果一致；而使用實施例1(二)中制得的光纖生物傳感器探頭檢測待測樣品1的結果嚴重偏離ELISA雙抗體夾心法的檢測結果，這可能是由于待測樣品1的實際濃度低于實施例l(二)中制得的光纖生物傳感器探頭的最低檢測濃度。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>從以上結果分析可以看出，實施例l(一)中制得的光纖生物傳感器探頭的檢測靈敏度高，結果準確可靠，操作方便快速。盡管本發明描述了具體的例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和范圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明范圍內的變動。權利要求一種光纖生物傳感器探頭，其特征在于，它是由光纖、共價連接在所述光纖的一個端面上的第一葡聚糖高分子、與所述第一葡聚糖高分子共價連接的第二葡聚糖高分子、和與所述第二葡聚糖高分子共價連接的生物分子組成，其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在3000～2000000范圍內，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能與被檢測分子特異性結合。2.根據權利要求1所述的光纖生物傳感器探頭，其特征在于，所述生物分子選自抗原或者抗體。3.根據權利要求1所述的光纖生物傳感器探頭，其特征在于，所述光纖是石英光纖。4.根據權利要求1所述的光纖生物傳感器探頭，其特征在于，所述第一葡聚糖高分子的分子量選自1000001000000，所述第二葡聚糖高分子的分子量選自10000100000。5.根據權利要求4所述的光纖生物傳感器探頭，其特征在于，所述第一葡聚糖高分子的分子量為500000，所述第二葡聚糖高分子的分子量為40000。6.—種制備權利要求1所述光纖生物傳感器探頭的方法，其特征在于，該方法的步驟如下a)將第一葡聚糖高分子與光纖的一個端面共價連接；b)將第二葡聚糖高分子與步驟a)中的共價連接到光纖端面上的第一葡聚糖高分子共價連接；c)將生物分子與步驟b)中的共價連接到第一葡聚糖高分子上的第二葡聚糖高分子共價連接；其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在30002000000范圍內，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能與被檢測分子特異性結合。7.根據權利要求6所述的制備光纖生物傳感器探頭的方法，其特征在于，該方法的步驟如下a)對光纖的一個端面進行羥基化處理；b)將步驟a)得到的光纖端面上的羥基通過Y-(2，3-環氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷改性，與第一葡聚糖高分子共價連接；c)將步驟b)得到的光纖端面第一葡聚糖高分子上的醇羥基通過環氧氯丙烷改性，與第二葡聚糖高分子共價連接；d)將步驟c)得到的光纖端面第二葡聚糖高分子上的醇羥基通過改性，與生物分子共價連接。8.—種光纖生物傳感器檢測系統，其特征在于，它包括至少一個權利要求1-5任一項所述的光纖生物傳感器探頭、暗盒、以及光信號接收與處理裝置，其中，所述光纖生物傳感器探頭固定有生物分子的一端與暗盒連接，另一端與光信號接收與處理裝置連接。9.根據權利要求8所述的光纖生物傳感器檢測系統，其特征在于，所述暗盒包含位置調節裝置，其上設有試劑池。10.權利要求8或9所述的光纖生物傳感器檢測系統在體外定量檢測中的應用。全文摘要本發明公開了一種光纖生物傳感器探頭，它是由光纖、共價連接在所述光纖的一個端面上的第一葡聚糖高分子、與所述第一葡聚糖高分子共價連接的第二葡聚糖高分子、和與所述第二葡聚糖高分子共價連接的生物分子組成，其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在3000～2000000范圍內，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能與被檢測分子特異性結合。本發明還提供了制備該光纖生物傳感器探頭的方法和光纖生物傳感器檢測系統，以及該光纖生物傳感器檢測系統在體外定量檢測中的應用。文檔編號G01N21/17GK101750483SQ20081020383公開日2010年6月23日申請日期2008年12月2日優先權日2008年12月2日發明者劉艷平申請人:浙江我武生物科技有限公司