專利名稱：：鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗免疫效果的評價方法
技術領域：
：本發明涉及疫苗
技術領域：
，具體涉及鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗免疫效果的評價方法。
背景技術：
：鱘魚為軟骨硬鱗魚，具有很高的經濟價值，有"黑色黃金"之稱。隨著其野生資源的減少，人工增養殖相繼出現，與之相關的商品規模化養殖相繼開展。由于鱘魚骨板堅硬，鰓部分裸露，在人工環境下進行高密度養殖，相互磨傷而容易受到感染，病害也逐漸增加，但有關其病害病原的分離、鑒定以及防治的研究資料極少。因此，疾病防治的研究是當務之急，這是保證鱘魚養殖持續、穩定發展的關鍵之一。鱘魚細菌性疾病的發生目前已成為鱘魚養殖業的瓶頸，鱘魚的細菌性疾病主要有細菌性腸炎、細菌性敗血癥和細菌性出血病(腫嘴病)，病原主要是氣單胞菌，具有極強的傳染性，患病鱘魚死亡率高，給生產造成了很大的損失。在鱘魚疾病防治時多采用藥物防治，但藥物防治容易污染水質，造成藥物殘留現象，藥量過大還會對鱘魚的生長產生負面影響。此外，大多數藥物的長期使用還造成了病原性細菌耐藥性的產生，最終給疾病的防治造成了困難。近年來，免疫防治在水產病害防治中的應用已日益廣泛。利用疫苗等，活化或加強動物自身的特異性免疫和非特異性免疫功能，提高抗病能力，被公認為是目前防治病害最為有效的方法之一。國內外已應用的漁用疫苗有20余種。水產病害的疫苗防治是今后的發展方向，疫苗防治既可克服治療困難影響療效的弊病，又可避免藥物殘留現象。目前關于鱘魚細菌病的疫苗防治尚未見報道，我國對鱘魚病的預防治療主要還是依靠藥物手段，因此開發病原菌疫苗將是鱘魚細菌病有效的防治方法之一。疫苗是將病原體或其代謝產物，經過人工滅活、減毒或利用基因工程等方法制成的用于預防傳染病的生物制劑。疫苗保留了病原體剌激魚類免疫系統的特性，當魚體接種疫苗后，免疫系統便會產生一定的保護物質，并形成免疫記憶；當魚體再次接觸到與所接種疫苗原性一致的病原體時，免疫系統就會迅速產生更多的保護物質來阻止病原體對魚體的傷害。全菌滅活疫苗具有操作簡便、安全等優點，因此適合于目前階段推廣防治鱘魚細菌病。
發明內容本發明所要解決的技術問題提供了一種鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗免疫效果的評價方法。為此，本發明公開了一種鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗免疫效果的評價方法，包括下列步驟a)待免鱘魚健康檢查免疫接種的鱘魚需攝食活動正常、體質健康；b)免疫接種采用注射方式進行鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗免疫接種，注射部位可為胸鰭基部、背鰭基部或腹鰭基部，其中以背鰭基部為佳；c)免疫后養殖管理工作監測水溫、水質的理化因子溶解氧、pH、氨氮、亞硝酸鹽，確保水質良好；d)免疫效果評價從鱘魚特異性免疫和非特異性免疫兩方面評價全菌滅活疫苗的免疫效果，測定五個指標溶菌酶含量，總蛋白含量，抗體效價，Y-免疫球蛋白含量。在一些實施方式里，所述鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗為嗜水氣單胞菌菌株可為Xl(登錄號EU669667)全菌滅活疫苗或嗜水氣單胞菌ATCC35654(登錄號X74676.1)全菌滅活疫苗，滅活疫苗每尾接種量為5.0X108CFU。在一些實施方式里，溫度是鱘魚免疫應答的重要影響因子，一般免疫時水溫以20-25t:為宜。水溫過低，鱘魚難以產生有效的免疫反應；水溫過高，免疫時鱘魚易產生強烈的應激反應。在一些實施方式里，所述溶菌酶含量，總蛋白含量，抗體效價，Y-免疫球蛋白含量分別采用血清學方法及相關ELISA試劑盒檢測；在一些實施方式里，本發明所述鱘魚細菌性疾病可為鱘魚細菌性腸炎、鱘魚細菌性敗血癥或鱘魚細菌性出血病，最優為鱘魚細菌性敗血癥。本發明首次公開了鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗的評價方法，該方法步驟少，能對鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗進行科學地的量化評價，可為鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗的研發和生成提供了可靠的評價基礎。圖1各實驗組西伯利亞鱘的血清抗體效價隨時間的變化曲線。圖2各實驗組西伯利亞鱘的血清總蛋白含量隨時間的變化曲線。圖3各實驗組西伯利亞鱘的血清免疫球蛋白含量隨時間的變化曲線。圖4各實驗組西伯利亞鱘的血清溶菌酶含量隨時間的變化曲線。具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。l待免鱘魚健康檢查免疫前，需確認待免疫鱘魚處于健康狀態，環境條件適宜，并進行魚體接種疫苗的安全性預試驗。1.1、待免鱘魚健康檢查免疫接種的鱘魚需攝食活動正常、體質健康。先觀察全池或整個網箱鱘魚的攝食及活動情況，再抽樣檢測待免鱘魚3-5尾，肉眼觀察體表及鰓等處是否正常，按常規方法鏡檢寄生蟲、必要時開展細菌性病原檢測。凡魚體瘦弱、魚池發病出現死魚或有較多寄生蟲寄生的鱘魚，不能接種疫苗。1.2、考察免疫的外界條件溫度是鱘魚免疫應答的重要影響因子，一般免疫時水溫以20-25t:為宜。水溫過低，鱘魚難以產生有效的免疫反應；水溫過高，免疫時鱘魚易產生強烈的應激反應。此外，溶解氧、PH、氨氮、亞硝酸鹽等水質理化因子，與魚體健康、免疫效果關系密切，在免疫前需按常規方法進行水質理化因子檢查，并結合經驗性水色觀察，判斷水體質量，確認水質在正常范圍之內。通常選擇在天氣晴朗的早晨進行免疫，盡量減少鱘魚損傷。1.3、魚體安全免疫測定為確保安全，在進行批量免疫處理前，有必要對待免鱘魚進行安全性預測試。適當加大疫苗注射劑量考察魚體的注射安全性，一般采取疫苗使用劑量1.5-2倍，并在規定的條件下進行試驗，觀察l-2天內免疫鱘魚有無異常。2免疫接種通常選擇在天氣晴朗、水溫適宜的早晨進行魚體免疫，整個操作過程要輕、快、穩、盡量減少魚體的損傷。合理控制餌料魚的投放量，避免養殖密度過大而對鱘魚產生不利剌激。在魚體免疫測定確認安全的前提下，才能進行批量免疫魚處理。批量免疫操作具體方法2.1工具選擇。接種器、針頭以及稀釋器皿須用75%的酒精消毒或用開水煮沸消毒。規格在10厘米以下的魚一般選用4.5號或5號接種針頭，規格在11.7厘米以上的魚一般選用5.5號或6號接種針頭，規格在16.7厘米以上的魚一般選用7號接種針頭。為了防止接種時入針太深傷及魚體內臟，可在接種針頭上套一小截塑料管，使暴露出的針尖長度略長于魚體腹肌厚度。2.2注射劑量，體重在11.5千克的鱘魚每尾注射0.5ml。體重在2千克以上的鱘魚每尾注射lml。2.3注射部位與注射深度胸鰭基部、背鰭基部、腹鰭基部均可，其中以背鰭基部為宜。在腹鰭基部接種，針頭與魚體成45度剌入魚體。皮下注射的注射部位是背鰭前方厚的背脊上層結締組織及其下較柔軟的肌肉組織層的間隙，注射時撥針頭要輕，防止藥液摻出，此方法優點一是快速，二是操作容易，三是安全，皮下接種部位不會傷害魚的臟器和重要組織。腹腔注射的注射部位是腹鰭前沿，進針時與體表呈25度角，要防止傷及魚的臟器。此方法優點是抗原吸收最快。肌肉注射同皮下注射部位一樣，優點是抗原可以緩慢而穩定地吸收。采用注射方法，要求針頭鋒利，注射劑量根據魚體大小而定，一般為0.5毫升，實際操作一般采用腹腔注射法。注射深度0.2-0.5cm為宜，原則上以疫苗注射入身體內而不傷及內臟為準。在注射前要視魚的規格大小，確定注射深度，以免剌傷魚的內臟。注射時，針頭、針管嚴格消毒；同時，要做到穩、準、快，避免弄傷魚體。2.4降低活動為了便于注射操作方便，應將魚種活動量降低疫苗注射一定要找熟練的人員操作。3免疫后的管理3.1、緩解受免魚的環境脅迫后效應施行免疫時鱘魚因在環境脅迫(擁擠脅迫、捕捉脅迫、體表損傷、疫苗的使用等)的作用下，魚體抗病、抗逆能力受到一定影響，須加強日常養殖管理工作，監測水質的理化因子(溶解氧、PH、氨氮、亞硝酸鹽)，確保水質良好；仔細觀察受免魚的報信情況，適時適量投放餌料魚。3.2、加強綜合防治目前研制的鱘魚疫苗針對的是特異的細菌病(嗜水氣單胞菌病)，而養殖過程中可能會遇到寄生蟲和其它病原菌等病原性疾病及一些非病原性疾病，因此必須增強綜合防治管理意識，通過病原早期監控和水質、餌料魚的精心管理(為防止病原從佴料魚環節帶入，佴料魚投放前應做消毒處理)，以保障養殖全過程的安全。3.3做好免疫效果檢查如果是池塘養殖鱘魚，注射后要適當加注新水增加魚的活動量，做好詳細記錄，如時間、水溫、劑量等，并注意觀察注射后魚有無異常情況發生。隨著氣溫、水溫升高，魚發病率也越來越高，這時候巡塘特別重要，要觀察魚的吃食情況、生長速度、發病情況，并且一一記錄，以便驗證疫苗質量好壞，從中找出成功或失敗的原因，給今后養魚提供參考依據。4全菌滅活疫苗免疫效果評價從鱘魚特異性免疫和非特異性免疫兩方面評價全菌滅活疫苗的免疫效果，測定五個指標溶菌酶含量，總蛋白含量，抗體效價，Y-免疫球蛋白含量。同時，檢測了佐劑對疫苗免疫效果的影響。各指標測定分別采用血清學方法及相關試劑盒每個實驗分為3組分別為對照組一-注射生理鹽水，實驗組1一一注射全菌苗+氟氏不完全佐劑，實驗組2-—只注射全菌苗，每周抽血一次。共10周。相關實驗結果4.i血清中抗體效價變化實驗結果(圖1)表明，嗜水氣單胞菌XI全菌苗能夠明顯提高西伯利亞鱘的血清抗體水平。具體表現在在加強免疫后28天，全菌苗組西伯利亞鱘血清抗體凝集效價達到最大值，為4.77±0.70，較對照組西伯利亞鱘血清抗體凝集效價高42.5%(P<0.05)。此外，在嗜水氣單胞菌X1全菌苗中加入弗氏不完全佐劑，有利于進一步提高增強西伯利亞鱘血清抗體水平。具體表現在在加強免疫后35天，全菌苗+FIA組西伯利亞鱘血清抗體凝集效價達到最大值，為5.71±0.50，較全菌苗組西伯利亞鱘血清抗體凝集效價最大值高19.71%(P>0.05)。4.2血清總蛋白含量變化實驗結果(圖2)表明，嗜水氣單胞菌XI全菌苗能夠明顯提高西伯利亞鱘的血清總蛋白含量。具體表現在在加強免疫后35天，全菌苗組西伯利亞鱘血清總蛋白含量達到最大值，為25.0±0.7g/L，較對照組西伯利亞鱘血清總蛋白含量高20X(P<0.05)。此外，在嗜水氣單胞菌X1全菌苗中加入弗氏不完全佐劑，有利于進一步提高增強西伯利亞鱘血清總蛋白含量。具體表現在在加強免疫后35天，全菌苗+FIA組西伯利亞鱘血清總蛋白含量達到最大值，為31.3±0.9g/L，較全菌苗組西伯利亞鱘血清總蛋白含量最大值高25.2%(P<0.05)。4.3血清免疫球蛋白含量變化實驗結果(圖2)表明，嗜水氣單胞菌XI全菌苗能夠明顯提高西伯利亞鱘的血清免疫球蛋白含量。具體表現在在加強免疫后28天，全菌苗組西伯利亞鱘血清免疫球蛋白含量達到最大值，為5.48±0.50g/L，較對照組西伯利亞鱘血清免疫球蛋白含量高36%(P<0.05)。此外，在嗜水氣單胞菌X1全菌苗中加入弗氏不完全佐劑，有利于進一步提高增強西伯利亞鱘血清免疫球蛋白含量。具體表現在在加強免疫后28天，全菌苗+FIA組西伯利亞鱘血清免疫球蛋白含量達到最大值，為6.42±0.30g/L，較全菌苗組西伯利亞鱘血清免疫球蛋白含量最大值高17.15%(P<0.05)。4.4血清溶菌酶含量變化[OO51]實驗結果(圖4)表明，嗜水氣單胞菌X1全菌苗能夠明顯提高西伯利亞鱘的血清溶菌酶含量。具體表現在在加強免疫后7天，全菌苗組西伯利亞鱘血清溶菌酶含量達到最大值，為171.l士5.9U/mL，較對照組西伯利亞鱘血清溶菌酶含量高44.4%(P<0.05)。此外，在嗜水氣單胞菌X1全菌苗中加入弗氏不完全佐劑，有利于進一步提高增強西伯利亞鱘血清溶菌酶含量。具體表現在在加強免疫后7天，全菌苗+FIA組西伯利亞鱘血清溶菌酶含量達到最大值，為192.0±3.2U/mL，較全菌苗組西伯利亞鱘血清溶菌酶含量最大值高12.22%(P<0.05)。4.5免疫保護率測定結果實驗結果(表1)表明，嗜水氣單胞菌XI全菌苗對西伯利亞鱘抗嗜水氣單胞菌XI人工感染具有較好的免疫保護作用，其對西伯利亞鱘的免疫保護率為50%，而且在嗜水氣單胞菌X1全菌苗中加入弗氏不完全佐劑，嗜水氣單胞菌X1全菌苗對西伯利亞鱘抗嗜水氣單胞X1人工感染的免疫保護作用更好，其對西伯利亞鱘的免疫保護率為70%。表1全菌苗對西伯利亞鱘的免疫保護率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只欲作為闡明本發明各個方面的單個例子，本發明范圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發明的多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的范圍之內。權利要求一種鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗免疫效果的評價方法，包括下列步驟a)待免鱘魚健康檢查免疫接種的鱘魚需攝食活動正常、體質健康；b)免疫接種采用注射方式進行鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗免疫接種，注射部位可為胸鰭基部、背鰭基部或腹鰭基部，其中以背鰭基部為佳；c)免疫后養殖管理工作監測水溫、水質的理化因子溶解氧、pH、氨氮、亞硝酸鹽，確保水質良好；d)免疫效果評價從鱘魚特異性免疫和非特異性免疫兩方面評價全菌滅活疫苗的免疫效果，測定五個指標溶菌酶含量，總蛋白含量，抗體效價，γ-免疫球蛋白含量。2.如權利要求1所述的評價方法，其特征在于步驟b中所述鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗為嗜水氣單胞菌XI全菌滅活疫苗或嗜水氣單胞菌ATCC35654全菌滅活疫苗。3.如權利要求2所述的評價方法，其特征在于步驟b中所述鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗每尾接種量為5.0X108CFU。4.如權利要求l所述的評價方法，其特征在于步驟b中免疫接種注射部位為背鰭基部。5.如權利要求1所述的評價方法，其特征在于步驟c中水溫為20-25°C。6.如權利要求1所述的評價方法，其特征在于步驟d中所述溶菌酶含量，總蛋白含量，抗體效價，Y_免疫球蛋白含量分別采用血清學方法及相關ELISA試劑盒檢測。全文摘要本發明涉及疫苗
技術領域：
，具體涉及鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗免疫效果的評價方法。本發明公開了一種鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗免疫效果的評價方法，包括下列步驟待免鱘魚健康檢查；免疫接種；免疫后養殖管理工作；免疫效果評價。本發明首次公開了鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗的評價方法，該方法步驟少，能對鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗進行科學地的量化評價，可為鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗的研發和生成提供了可靠的評價基礎。文檔編號G01N33/53GK101738467SQ200810202810公開日2010年6月16日申請日期2008年11月17日優先權日2008年11月17日發明者姜有聲,曹海鵬,李圓圓,楊先樂,邱軍強申請人:上海海洋大學