專利名稱：三聚氰胺的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種三聚氰胺的檢測方法，具體地，涉及一種液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用檢
測三聚氰胺的方法。
背景技術(shù)：
近幾個月來，在嬰兒奶粉及其他奶類制品中發(fā)現(xiàn)混有大量三聚氰胺，三聚氰胺是一種化工原料，人體攝入過量的三聚氰胺會造成腎結(jié)石并對健康產(chǎn)生巨大的影響。目前對三聚氰胺的檢測方法可分為三類 (1)高性能液態(tài)色層分析法這種方法是利用高性能液態(tài)色層分析儀器對化合物做一個分離和檢測，其檢測的方法通常是紫外吸收。 (2)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法這種方法是利用氣相色譜對化合物進行分離，然后利用質(zhì)譜鑒定化合物，它的靈敏度通?？梢赃_到5PPB左右，其缺點是必須對三聚氰胺進行衍生化反應才能利用質(zhì)譜檢測，因此較為繁瑣。 (3)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法這種方法是使用液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用對化合物進行分離鑒定，它的靈敏度也可達到5PPB以下，而且不需要做衍生化反應。液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的方法是目前最靈敏最好的方法。該方法是先利用液相色譜對樣品進行分離，再利用質(zhì)譜對分離出來的成分進行鑒定。最常用的液相色譜方法是反相色譜分析，它是利用樣品在反相色譜柱上保留，再使用含有高含量的有機溶劑的流動相予以洗脫。最常用的反相色譜柱是C18和C8色譜柱。三聚氰胺是一個親水性非常好的化合物，它在反相色譜柱上幾乎無法保留，因此無法對其進行分離。 一般情況下，對于親水性的化合物可以在溶劑中加入離子對試劑，離子對試劑可以和樣品起交互作用，進而使其在反相柱上有保留而達到分離的效果。一般的離子對試劑具有很長的碳鏈，在尾端還鍵合有一個強酸或強堿基，從而和樣品形成離子對并能使樣品在反相柱上保留，可是一般離子對試劑都有較高的分子量不易揮發(fā)，因此無法和質(zhì)譜聯(lián)用，其他的方法，例如使用正相色譜分離三聚氰胺，可是眾所周知正相色譜法穩(wěn)定性不太好，柱效和分離效果也不如反相色譜柱，此外，高有機溶劑的流動相也容易使樣品在進入質(zhì)譜前的離子化不完全，從而降低了靈敏度。因此，目前需要建立一種新的用于檢測三聚氰胺的反相液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的用于檢測三聚氰胺的反相液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(簡稱反相LC-MS)的方法，該方法簡單、準確性好，可用于奶粉和雞蛋等食品中三聚氰胺的檢測。 本發(fā)明的三聚氰胺檢測方法，是一種反相液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法，采用含有有機溶劑的水溶液作為流動相，在流動相中加入多氟羧酸和/或其鹽。 本發(fā)明的三聚氰胺檢測方法中，所述多氟羧酸是下述通式(1)和(2)所表示的化合物，所述多氟羧酸鹽為下式(3)或(4)所表示的分子量為15 500的小分子有機鹽，其中，這些多氟羧酸或多氟羧酸鹽可以一種單獨使用，也可以2種以上并用，
O
II
CnFm—C—OH
其中，m、n為1 20的整數(shù)；
OH
II
CnFa—CmHb—C—OH
其中，m、n、a、b為1 20的整數(shù)，且m+n《20
O
CnFm—C一O0 M
其中，m、n為1 20的整數(shù)，M為陽離子；
(1)
(2)
(3)
CnFa—Cm Hb
(4)其中，m、n、a、b為1 20的整數(shù)，且m+n《20，M為陽離子。 本發(fā)明的三聚氰胺檢測方法中，發(fā)明人考察了多種可用的多氟羧酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三 氟乙酸(TFA)、七氟丁酸(HFBA)、3，3，3-三氟-2，2-二甲基丙酸、3，3，3-三氟-2-(三氟 甲基)丙酸、五氟丙酸都可以添加到流動相中，其中優(yōu)選三氟乙酸(TFA)和/或七氟丁酸 (HFBA)。 本發(fā)明的三聚氰胺檢測方法中，發(fā)明人考察了多氟羧酸在流動相中的含量，結(jié)果
發(fā)現(xiàn)，當多氟羧酸的含量在0.05% 5% (v/v)的范圍內(nèi)，都可以獲得良好的色譜峰。 本發(fā)明的三聚氰胺檢測方法中，所述有機溶劑可以是液相色譜中常用的各種有機
溶劑，其中優(yōu)選甲醇和乙腈。此外，本發(fā)明考察了的甲醇水溶液的濃度范圍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇
的水溶液的濃度只要在5% 50%的范圍內(nèi)，就可以獲得較為良好的色譜峰，但是從獲得
對稱性和峰形更好的色譜峰的角度，優(yōu)選10% 35% (v/v)。本發(fā)明也考察了乙腈水溶液
的濃度范圍，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈的水溶液只要在2% 50% (v/v)的范圍內(nèi)，就可以獲得較為
良好的色譜峰，但是從獲得對稱性和峰形更好的色譜峰的角度，優(yōu)選5% 30% (v/v)。 本發(fā)明的三聚氰胺檢測方法中，使用C8或C18色譜柱作為色譜柱。 本發(fā)明在流動相中加入多氟羧酸和/或其鹽，因為多氟羧酸和/或其鹽具有很強
的疏水性，可以與反相色譜柱的固定相形成較強的交互作用。此外，多氟羧酸和/或其鹽中
的羧基可以和三聚氰胺形成離子對，所以可以增加三聚氰胺在反相色譜柱上的保留而達到
分離的效果。此外，多氟羧酸和/或其鹽一般具有很低的沸點、容易被揮發(fā)，因此，可以和質(zhì)
譜聯(lián)用而不會減低靈敏度。 本發(fā)明通過在流動相的含有有機溶劑的水溶液中加入多氟羧酸和/或其鹽，可以 提供一種新的反相液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法來檢測三聚氰胺。
圖1是采用本發(fā)明的一個實施例(A :含有0. 1% (v/v)HFBA的H20， B :含有0. 1% HFBA(v/v)的甲醇，A : B = 70 : 30混合作為流動相)檢測不同濃度的三聚氰胺得到的色 譜圖。 圖2是采用本發(fā)明的另一個實施例(A :含有0. 1% (v/v)HFBA和0. 1% (v/v)TFA WH20、B :含有O. 1% (v/v) HFBA和0. 1 % (v/v)TFA的甲醇，其中，A : B = 70 : 30混合作
為流動相)檢測不同濃度的三聚氰胺得到的色譜圖。 圖3是采用本發(fā)明的另一個實施例(A :含有O. 1% (v/v)HFBA的H20、B :含有O. 1% (v/v)HFBA的乙腈，A : B = 95 : 5混合作為流動相)檢測濃度為5PPB的三聚氰胺得到的 色譜圖。 圖4是采用本發(fā)明的另一個實施例(A :含有0. 1% (v/v)HFBA和0. 1 % (v/v)TFA WH20、B :含有O. 1% (v/v)HFBA和0. 1% (v/v) TFA的乙腈，A : B = 90 : 10混合作為流 動相)檢測濃度為5PPB的三聚氰胺得到的色譜圖。 圖5是采用本發(fā)明的另一個實施例(A :含有O. 1% (v/v)TFA的H^、B :乙腈，A : B
=70 : 30混合作為流動相)檢測濃度為5PPB的三聚氰胺得到的色譜圖。 圖6是采用本發(fā)明的另一個實施例(A :含有1% (v/v)HFBA的H20、B :含有1% (v/
v)HFBA的甲醇，A : B = 85 : 15混合作為流動相)檢測三聚氰胺得到的色譜圖。 圖7是采用本發(fā)明的另一個實施例(A :含有0. 1% (v/v)五氟丙酸的H20、B :含有
0.1% (v/v)五氟丙酸的甲醇，A : B = 70 : 30混合作為流動相)檢測三聚氰胺得到的色譜圖。 圖8是三聚氰胺的標準曲線圖。 圖9是用本發(fā)明的方法檢測奶粉中的三聚氰胺的色譜圖。
具體實施例方式
首先說明一下本發(fā)明的檢測方法的實驗步驟。 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定三聚氰胺是一種現(xiàn)有技術(shù)。主要包括以下一些步驟
(1)制備三聚氰胺標準品溶液，三聚氰胺是一種水溶性化合物，可以用各種常用的 含水有機溶劑配制三聚氰胺標準品。本發(fā)明中使用20% (v/v)甲醇水溶液配制不同濃度梯 度的三聚氰胺標準品溶液； (2)設(shè)定適宜的色譜條件和質(zhì)譜條件，供分析用； (3)將不同濃度的三聚氰胺標準品溶液注入LC-MS，繪制標準曲線； (4)制備待測樣品溶液，使用合適的溶劑將三聚氰胺從待測樣品中提取出來，配制
成待測溶液； (5)分析待測樣品，將待測樣品注入LC-MS進行分析，根據(jù)分析結(jié)果計算待測樣品 中三聚氰胺的含量。 接下來，簡要說明本發(fā)明的檢測方法中所使用的試劑材料以及儀器設(shè)備。
1.試劑與材料 除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。
甲醇色譜純。
乙腈色譜純。 三聚氰胺標準品CAS 108-78-01，純度大于99. 0% 。 0. 1 %的HFBA (v/v)水溶液準確量取1毫升七氟丁酸于1L容量瓶中，用水溶解并 定容至刻度，混勻后備用。 1%的HFBA(v/v)水溶液準確量取10毫升七氟丁酸于1L容量瓶中，用水溶解并 定容至刻度，混勻后備用。 0. 1%的TFA(v/v)水溶液準確量取1毫升三氟乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并
定容至刻度，混勻后備用。
2.儀器和設(shè)備 液相色譜質(zhì)譜儀Agilent 1100C即illary-LC/Q-T0F
離心機轉(zhuǎn)速不低于4000r/min。 以下，結(jié)合實施例以及附圖詳細說明本發(fā)明的三聚氰胺的檢測方法。但本發(fā)明并 不局限于這些實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以以這些實施例為基礎(chǔ)，根據(jù)實際情況進行適 當?shù)恼{(diào)整。 實施例1 實施例7是流動相的優(yōu)化選擇試驗。
實施例1 (1)色譜條件和質(zhì)譜條件 色譜柱C18柱，250mmX2. lmm(i. d.) ， 5 ii m(ColumnTechnology Inc.，弗里蒙特， CA) 流動相:A :含有0. 1 % (v/v) HFBA的H20， B :含有0. 1 % HFBA (v/v)的甲醇，以A : B =70 : 30的比例混合
流速200uL/min
柱溫室溫 離子源(Ion source) :ESI，正離子模式
噴霧器(Nebulizer) :N2 30psi
干燥氣流速(Drying gas) :N2 6L/min
進樣量20iiL
(2)實驗步驟 (a)配制三聚氰胺標準品溶液精密稱取一定量的三聚氰胺，用20% (v/v)的甲醇 水溶液配制成濃度分別為0. 5PPB、1PPB、2PPB、5PPB、10PPB、20PPB的三聚氰胺標準品溶液， 備用； (b)分別將不同濃度的三聚氰胺標準品溶液注射入LC-MS儀，考察在此條件下的
三聚氰胺的色譜峰情況。
(3)結(jié)果 色譜分析結(jié)果示于圖1。圖l是儀器的工作站制出的色譜圖，其中，色譜峰由上 而下分別為濃度是0. 5PPB、1PPB、2PPB、5PPB、10PPB、20PPB的三聚氰胺標準品的色譜峰，圖 中，橫坐標表示色譜峰的保留時間，單位是分鐘，縱坐標表示離子數(shù)。由圖l可以看出，在這 樣的色譜條件下，三聚氰胺能夠被很好地分離，色譜峰峰形良好，保留時間為3. 82分鐘左 右。此外，由圖1可知，該方法可以檢測到0. 5PPB的三聚氰胺，靈敏度高。
實施例2 (1)色譜條件和質(zhì)譜條件 將流動相更改為A :含有O. 1% (v/v)HFBA和0. 1% (v/v) TFA的H20、B :含有O. 1% (v/v)HFBA和0. 1% (v/v)TFA的甲醇，以A : B = 70 : 30的比例混合，其余條件與實施例 l相同。 (2)實驗步驟
同實施例l。
(3)結(jié)果 色譜分析結(jié)果示于圖2。圖2是儀器的工作站制出的色譜圖，其中，色譜峰由上 而下分別為濃度是0. 5PPB、1PPB、2PPB、5PPB、10PPB、20PPB的三聚氰胺標準品的色譜峰，圖 中，橫坐標表示色譜峰的保留時間，縱坐標表示離子數(shù)。由圖2可以看出，在這樣的色譜條 件下，三聚氰胺能被很好地分離，色譜峰峰形良好，保留時間3. 15分鐘左右。
實施例3 (1)色譜條件和質(zhì)譜條件 將流動相更改為:A :含有0. 1% (v/v) HFBA的H20、 B :含有0. 1% (v/v)HFBA的乙 腈，以A : B = 95 : 5的比例混合，其余條件與實施例1相同。 [OO 8] (2)實驗步驟 取實施例1中配制的濃度為5PPB的三聚氰胺標準品溶液，注入LC-MS儀，考察在
此條件下的三聚氰胺的色譜峰情況。 (3)結(jié)果 色譜分析結(jié)果示于圖3。圖3是儀器的工作站制出的色譜圖，其中，色譜峰為三聚 氰胺標準品的色譜峰，圖中，橫坐標表示色譜峰的保留時間，縱坐標表示離子數(shù)。由圖3可 以看出，在這樣的色譜條件下，三聚氰胺能夠被很好地分離，色譜峰峰形良好，保留時間為 8. 2分鐘左右。
實施例4 (1)色譜條件和質(zhì)譜條件 將流動相更改為A :含有O. 1% (v/v)HFBA和0. 1% (v/v) TFA的H20、B :含有O. 1% (v/v)HFBA和0. 1% (v/v)TFA的乙腈，以A : B = 90 : 10的比例混合，其余條件與實施例 l相同。 (2)實驗步驟
同實施例3。
(3)結(jié)果 色譜分析結(jié)果示于圖4。圖4是儀器的工作站制出的色譜圖，其中，色譜峰為三聚 氰胺標準品的色譜峰，圖中，橫坐標表示色譜峰的保留時間，縱坐標表示離子數(shù)。由圖4可 以看出，在這樣的色譜條件下，三聚氰胺能夠被很好地分離，色譜峰峰形良好，保留時間為 5. 3分鐘左右。
實施例5 (1)色譜條件和質(zhì)譜條件將流動相更改為:A :含有0. 1% (v/v) TFA的H20、B :乙腈，以A : B = 70 : 30的
7比例混合(在這個條件下，TFA的濃度相當于0. 07% )，其余條件與實施例1相同。
(2)實驗步驟
同實施例3。
(3)結(jié)果 色譜分析結(jié)果示于圖5。圖5是儀器的工作站制出的色譜圖，其中，色譜峰為三聚 氰胺標準品的色譜峰，圖中，橫坐標表示色譜峰的保留時間，縱坐標表示離子數(shù)。由圖5可 以看出，在這樣的色譜條件下，三聚氰胺能夠被很好地分離，色譜峰峰形良好，保留時間為 4. 3分鐘左右。
實施例6 (1)色譜條件和質(zhì)譜條件 A :含有1. 0 % (v/v) HFBA的H20、 B :含有1. 0 % (v/v) HFBA的甲醇，以A : B = 85 : 15的比例混合作為流動相，其余條件與實施例1相同。 [OO"] (2)實驗步驟
同實施例3。
(3)結(jié)果 色譜分析結(jié)果示于圖6。圖6是儀器的工作站制出的色譜圖，其中，色譜峰為三聚 氰胺標準品的色譜峰，圖中，橫坐標表示色譜峰的保留時間，縱坐標是離子數(shù)表示離子數(shù)。 由圖6可以看出，在這樣的色譜條件下，三聚氰胺能夠被很好地分離，色譜峰峰形良好，保 留時間為4. 5分鐘左右。
實施例7 (1)色譜條件和質(zhì)譜條件 A:含有O. 1% (v/v)五氟丙酸的！120、 B :含有O. 1% (v/v)五氟丙酸的甲醇，以 A : B = 70 : 30的比例混合作為流動相，其余條件與實施例1相同。(2)實驗步驟 同實施例3。
(3)結(jié)果 色譜分析結(jié)果示于圖7。圖7是儀器的工作站制出的色譜圖，其中，色譜峰為三聚 氰胺標準品的色譜峰，圖中，橫坐標表示色譜峰的保留時間，縱坐標表示離子數(shù)。由圖7可 以看出，在這樣的色譜條件下，三聚氰胺能夠被很好地分離，色譜峰峰形良好，保留時間為 4. 3分鐘左右。
實施例8 實施例8是奶粉樣品的含量測定試驗。
(1)色譜條件和質(zhì)譜條件 色譜柱C18柱，250mmX2. lmm(i.d.)，5iim(Column Technology Inc.，弗里蒙特， CA)流動相:A :含有0. 1 % (v/v) HFBA的H20， B :含有0. 1 % HFBA (v/v)的甲醇，以A : B =70 : 30的比例混合
流速200uL/min
柱溫室溫
離子源(Ion source) :ESI，正離子模式(positive)
噴霧器(Nebulizer) :N2 30psi
干燥氣流速(Drying gas) :N2 6L/min
進樣量20iiL
(2)實驗步驟 (a)配制三聚氰胺標準品溶液精密稱取一定量的三聚氰胺，用20% (v/v)的甲醇 水溶液配制成濃度分別為2. 5PPB、5PPB、10PPB、25PPB、50PPB的三聚氰胺標準品溶液；
(b)分別將上述5種不同濃度的三聚氰胺標準品溶液注射入LC-MS中，由儀 器自帶的工作站繪制出標準曲線，見圖8，工作站根據(jù)分析數(shù)據(jù)求得的標準曲線為y = 23544. 9455x-6084. 8270，其中，y表示色譜峰的峰面積，x表示三聚氰胺的量，R2是一個表 示標準曲線的線性程度的參數(shù)，R2 = 0. 9988，表明具有良好的線性。
(c)配制奶粉樣品溶液 稱取50毫克(精確至O. l毫克)試樣于5mL試管中，加入約5納克的三聚氰胺混 合均勻，加入含1%三氯乙酸的20% (v/v)甲醇水溶液2.5毫升，超聲提取10分鐘，再振蕩 提取10分鐘，取700微升于1. 5毫升的試管中，加入100微升的氯仿振蕩提取5分鐘，再 以12000r/min的轉(zhuǎn)速在離心機中離心分離10min。取500微升上清液到3K超濾管中，以 12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取250微升過濾液并和250微升的0. 1% HFBA混合。
(d)進樣分析，將配制好的樣品溶液注入液相色譜質(zhì)譜儀，色譜圖見圖9。
(e)根據(jù)儀器的工作站給出的峰面積數(shù)據(jù)，代入上述標準曲線y = 23544. 9455x-6084. 8270，計算樣品中的三聚氰胺的含量。
(3)計算結(jié)果 經(jīng)計算，奶粉樣品中三聚氰胺的含量為5. 35納克。
實施例9 實施例9是雞蛋品的含量測定試驗。
(1)色譜條件和質(zhì)譜條件
同實施例8。
(2)實驗步驟 除將奶粉換成雞蛋外，其余都和實施例8相同。
(3)結(jié)果: 經(jīng)計算，雞蛋樣品中三聚氰胺的含量為4. 75納克。
方法學驗證 通過考察重復性、穩(wěn)定性和回收率這幾個指標，對本發(fā)明的方法進行方法學驗證
(1)重復性試驗 按照實施例8中的(c)項所述的方法制備5份同樣濃度的奶粉樣品，按照實施例8 的色譜條件和質(zhì)譜條件下進行分析，計算其中的三聚氰胺含量，結(jié)果表明平均含量為5. 35 納克，標準偏差(RSD) < 2%，證明該方法重復性良好。
(2)回收率試驗 回收率試驗的結(jié)果表明該方法的回收率為94. 7 98. 2%， [OH4] (3)穩(wěn)定性試驗
取實施例8中的奶粉樣品在0小時、2小時、4小時、8小時、24小時后測定，結(jié)果表
明穩(wěn)定性良好。 由以上方法學驗證結(jié)果可知，本發(fā)明的方法準確度高?？梢杂米鳛槟谭刍蛘咂渌?食品中三聚氰胺的含量檢測。相信此方法可在食品安全及衛(wèi)生領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。
權(quán)利要求
一種三聚氰胺的檢測方法，所述方法是一種反相高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法，其特征在于，采用含有有機溶劑的水溶液作為流動相，在流動相中加入多氟羧酸和/或其鹽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的三聚氰胺的檢測方法，其中，所述多氟羧酸是下述通式(1)或 (2)所表示的化合物，所述多氟羧酸鹽為下述通式(3)或(4)所表示的分子量為15 500 的有機小分子鹽，其中，這些多氟羧酸或多氟羧酸鹽可以一種單獨使用，也可以2種以上并 用，<formula>formula see original document page 2</formula>其中，m、n為1 20的整數(shù)；<formula>formula see original document page 2</formula>其中，m、n、a、b為1 20的整數(shù)，m+n《20 ;<formula>formula see original document page 2</formula>其中，m、n為1 20的整數(shù)，M表示陽離子；<formula>formula see original document page 2</formula>其中，m、n、a、b為1 20的整數(shù)，m+n《20，M表示陽離子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的三聚氰胺檢測方法，其中，所述多氟羧酸是三氟乙酸、七 氟丁酸、3，3，3-三氟-2，2-二甲基丙酸、3，3，3-三氟-2-(三氟甲基)丙酸、五氟丙酸中的 l種或2種以上。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的三聚氰胺檢測方法，其中，所述多氟羧酸是三氟乙酸和/或七 氟丁酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的三聚氰胺檢測方法，其中，所述多氟羧酸和/或其鹽在流 動相中的含量為0. 05% 5% (v/v)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的三聚氰胺檢測方法，其中，所述多氟羧酸和/或其鹽的含量為 0. 05% 5% (v/v)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的三聚氰胺檢測方法，其中，用C8或C18色譜柱作為色譜柱。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的三聚氰胺檢測方法，其中，作為流動相的所述含有有機溶 劑的水溶液是5% 50% (v/v)的甲醇水溶液和/或2% 50% (v/v)的乙腈水溶液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的三聚氰胺檢測方法，其中，作為流動相的所述含有有機溶劑 的水溶液是10% 35% (v/v)的甲醇水溶液和/或5% 30% (v/v)的乙腈水溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的三聚氰胺的檢測方法，是一種反相高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法，采用含有有機溶劑的水溶液作為流動相，在流動相中加入多氟羧酸和/或其鹽。
文檔編號G01N30/26GK101738444SQ20081020220
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月4日
發(fā)明者曾嶸, 謝佳輝 申請人:上?？浦律锟萍加邢薰?中國科學院上海生命科學研究院