調控調節性T細胞和Th17細胞相互轉化的藥物篩選方法

專利名稱：調控調節性T細胞和Th17細胞相互轉化的藥物篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種調控調節性T細胞和Thl7細胞相互轉化的藥物篩選方法， 可高效、可靠的對新化合物、天然藥物活性進行快速初步篩選和評價，屬細胞生 物學、免疫學、分子生物學和藥理學技術領域。
技術背景自身免疫性疾病是一種免疫細胞介導的危害人類健康的疾病，常伴有多器官 的損傷，多系統的累及，重者威及生命。激素等免疫抑制劑作為目前治療的一線 藥物，常常因為嚴重的副作用導致病情加重，甚至治療終止。而隨著環境污染和 生活工作壓力的改變，自身免疫性疾病的發病率在逐年增加。尋找安全有效的治 療自身免疫病的藥物已經成為世界范圍深入研究的課題。自身免疫性疾病常伴有免疫耐受的破壞。免疫耐受對于維持體內免疫平衡和 防止自身免疫性疾病很重要。胸腺首先會清除自身反應性T細胞，如果胸腺不能 完全去除自身反應性T細胞，此時健康個體并沒有發生自身免疫病，因為存在有 外周免疫耐受。調節性T細胞(Treg)具有免疫抑制作用，在外周免疫耐受中起 關鍵作用，可防止自身免疫性疾病的發生。越來越多的研究支持自身免疫性疾病 如紅斑狼瘡、類風濕關節炎等都伴有Treg細胞數量的減低，而篩選具有促進T 細胞向Treg細胞轉化的藥物對治療自身免疫性疾病將會起重要作用。叉狀頭/翅 膀狀螺方定轉錄因子(Forkhead/winged helix transcription factor (Foxp3))， 是Treg細胞發育過程中的核心轉錄因子，調控幼稚性T細胞向Treg細胞轉化。 Fo鄧3基因敲處的小鼠可發生嚴重的自身免疫性疾病，說明Fo鄧3在維持免疫耐受 和防止自身免疫性疾病的發生中起重要作用。目前為止公認的具有上調Foxp3的 藥物寥寥無幾，而天然藥物至今未有發現。而本發明關鍵目的之一就是構建體外 細胞模型篩選具有上調Foxp3表達的天然藥物。分泌IL-17的CD4+T細胞(Thl7)是新近發現的一新T細胞亞群，其主要通 過分泌白細胞介素一17A (IL-17A)，白細胞介素一17F (IL-17F)，腫瘤壞死因 子一a (TNF-a)和白細胞介素一6 (IL-6)等細胞因子剌激血管內皮細胞分泌 粘附分子，介導炎細胞對組織的浸潤和組織的損傷；同時Thl7細胞也可以分泌 細胞毒物質直接損傷組織。越來越多的研究表明Thl7細胞在一些自身免疫疾病如風濕性關節炎、紅斑狼瘡、銀屑病和多發性硬化的發病中起關鍵作用。因此尋找同時能夠抑制Thl7細胞亞群的藥物就有可能緩減自身免疫性疾病。研究表 明Thl7和Treg細胞在不同的免疫微環境中可以相互轉化。目前為止，具有調控 這兩種細胞亞群相互轉化的藥物只有一個一維甲酸(RA)，而該藥治療劑量和至 毒劑量接近，在過去的臨床應用中暴露出嚴重的副作用，如損傷肝功、致高血 脂、致畸、影響骨骼發育等等。因此篩選安全有效的藥物已經迫不及待。而目前 為止，國內外未見有調控Treg和Thl7細胞相互轉化的藥物篩選方法。 發明內容本發明的目的是提供一種調控調節性T細胞和Thl7細胞相互轉化的藥物篩 選方法，在初步篩選到促進叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(Foxp3) mRNA的藥物后， 進一步篩選能夠調控調節性T細胞和Thl7細胞相互轉化的安全有效的藥物。為了達到上述目的，本發明的技術方案是提供一種調控調節性T細胞和Thl7 細胞相互轉化的藥物篩選方法，其特征在于，具體步驟為第一步將叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子綠色熒光蛋白(Foxp3-GFP)表達質 粒轉染入人腎上皮細胞(293T)細胞中，通過熒光顯微鏡觀測轉染入質粒是否表 達，加入不同的待篩選藥物，20-30小時后通過實時定量聚合酶聯反應(實時定 量PCR)檢測叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(Foxp3) mRNA的表達，篩選出具有上調 叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(Foxp3)效果的藥物；第二步培養小鼠幼稚性T淋巴細胞，加入第一步篩選得到的藥物，60-80 小時后通過實時定量PCR檢測叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(Fo鄧3) mRNA的表 達，篩選上調該基因表達的藥物，并進一步通過流式細胞儀檢査004+0025卞0鄧3+ 在CD4+T細胞中的百分率，驗證該藥物在蛋白水平上的作用；第三步培養小鼠幼稚性T淋巴細胞，加入轉化生長因子-e和白細胞介素一6誘導向Thl7細胞轉化，同時加入通過第二步篩選得到的藥物，60-80小時后 通過實時定量聚合酶聯反應(實時定量PCR)檢測Thl7細胞核轉錄因子孤核受體 Yt (R0RYt) mRNA的表達，篩選出下調該基因表達的藥物，并進一步通過流式 細胞儀檢査CD4+IL-17+在CD4+T細胞中的百分率，驗證該藥物在蛋白水平上的作 用。進一步地，第一步中所述的待篩選藥物為芍藥苷，維甲酸，黃芪甲苷，雷 公藤甲素，蒿甲醚，天花粉蛋白，青藤堿，隱丹參酮和丹皮酚。本發明首先以Foxp3為初始靶標，通過初篩和復篩在淋巴細胞和人腎上皮細 胞兩種細胞中找到能上調外源性Foxp3和內源性Foxp3mRNA的藥物；然后在上面的 基礎上進一步縮小篩選范圍，尋找能夠抑制T細胞向Thl7細胞轉化的藥物。綜合 兩步就可以篩選到可靠的具有調控Treg和Thl7細胞相互轉化的藥物。基于T細胞亞群的最新研究進展，本發明層層深入，結合分子生物學、免疫 學和細胞工程技術，建立簡便、可靠、有效的模型，從大量天然產物種快捷地篩 選能夠促進T細胞向Treg細胞轉化，抑制向Thl7細胞轉化的創新藥物，為治療自 身免疫性疾病尋找新的藥物。本發明具有以下優點(1)藥物用量少只需幽級的藥物；(2)時間短7 天左右可完成一輪完整篩選；(3)體外篩選該方法主要在體外進行藥物篩選， 回避了動物和人體實驗的倫理學要求；(4)可靠性高通過實時定量PCR和流式 細胞儀從mRNA水平和蛋白水平檢測，經歷初篩和復篩反復驗證，結論可靠；(5) 高通量通過96孔板培養細胞，采用實時定量PCR和流式細胞儀保證了可進行高 通量的篩選；(6)應用前景廣篩選到的藥物可以廣泛應用與自身免疫性疾病或 Treg和Thl7細胞失衡的炎癥性疾病。


圖l為本發明中9種樣品的實時定量聚合酶聯反應檢測圖； 圖2為芍藥苷、維甲酸和青藤堿的實時定量聚合酶聯反應檢測圖； 圖3為芍藥苷、維甲酸和青藤堿的流式細胞儀檢測圖； 圖4為芍藥苷、維甲酸的實時定量聚合酶聯反應檢測圖； 圖5為芍藥苷、維甲酸的流式細胞儀檢測圖。
具體實施方式
下面結合實施例來具體說明本發明。實施例一種調控Treg和Thl7細胞相互轉化的藥物篩選方法，具體步驟為 第一步將Foxp3-GFP表達質粒轉染入293T細胞中，通過熒光顯微鏡觀測 轉染入質粒是否表達，然后加入中國藥品生物制品檢定所提供的9種樣品(5uM 芍藥苷，300nM維甲酸，20uM黃芪甲苷，lnM雷公藤甲素，luM蒿甲醚，5uM 天花粉蛋白，5uM青藤堿，5wM隱丹參酮，5uM丹皮酚)，24小時后通過實時 定量PCR檢測Foxp3 mRNA的表達，如圖1所示，篩選出具有上調Foxp3 mRNA 的藥物(芍藥苷、維甲酸、青藤堿)；第二步培養小鼠幼稚性T淋巴細胞，加入第一步篩選得到的藥物芍藥苷、 維甲酸、青藤堿，72小時后通過實時定量PCR檢測Foxp3 mRNA的表達，如圖2 所示，篩選出上調該基因表達的藥物芍藥苷、維甲酸，并進一步通過流式細胞儀 檢査CD4+CD25+Foxp3+在CD4+T細胞中的百分率，如圖3所示，驗證該藥物在蛋白 水平上的作用；第二步培養小鼠幼稚性T淋巴細胞，加入細胞因子(5ng/ml TGF-p+20ng/ml IL-6)誘導向Thl7細胞轉化，同時加入通過以上兩步篩選的藥物芍藥苷、維甲 酸，72小時后通過實時定量PCR檢測Thl7細胞核轉錄因子R0R y t mRNA的表達， 如圖4所示，篩選出下調該基因表達的藥物芍藥苷，并進一步通過流式細胞儀檢 查CD4+IL-17+在CD4+T中的百分率，如圖5所示，驗證該藥物在蛋白水平上的作 用。綜合二步篩選，我們找到一個具有調控Treg和Thl7細胞相互轉化的天然藥 物單體芍藥苷。對篩選到的單體，我們進行了體內的驗證，通過對自發性狼瘡鼠(服L/lpr) 9周的治療，我們發現該單體能明顯緩減狼瘡鼠腎臟的病理損傷和減低24小時 尿蛋白。通過對佐劑性關節炎小鼠1周的治療，該單體能明顯抑制關節炎的發生。
權利要求
1. 一種調控調節性T細胞和Th17細胞相互轉化的藥物篩選方法，其特征在于，具體步驟為第一步將叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子綠色熒光蛋白表達質粒轉染入人腎上皮細胞中，通過熒光顯微鏡觀測轉染入的質粒是否表達，加入不同的待篩選藥物，20-30小時后通過實時定量聚合酶聯反應檢測叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子mRNA的表達，篩選出具有上調叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子表達的藥物；第二步培養小鼠幼稚性T淋巴細胞，加入第一步篩選得到的藥物，60-80小時后實時定量聚合酶聯反應檢測叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子mRNA的表達，篩選出上調該基因表達的藥物，并進一步通過流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+在CD4+T細胞中的百分率，驗證該藥物在蛋白水平上的作用；第三步培養小鼠幼稚性T淋巴細胞，加入轉化生長因子-β和白細胞介素—6誘導向Th17細胞轉化，同時加入通過第二步篩選得到的藥物，60-80小時后通過實時定量聚合酶聯反應檢測Th17細胞核轉錄因子孤核受體γtmRNA的表達，篩選出下調該基因表達的藥物，并進一步通過流式細胞儀檢測CD4+IL-17+在CD4+T細胞中的百分率，驗證該藥物在蛋白水平上的作用。
2. 如權利要求1所述的一種調控調節性T細胞和Thl7細胞相互轉化的藥物篩 選方法，其特征在于，第一步中所述的待篩選藥物為芍藥苷，維甲酸，黃芪 甲苷，雷公藤甲素，蒿甲醚，天花粉蛋白，青藤堿，隱丹參酮和丹皮酚。
全文摘要
本發明提供了一種調控調節性T細胞和Th17細胞相互轉化的藥物篩選方法，步驟為將Foxp3-GFP表達質粒轉染入293T細胞中，加入待篩選藥物，檢測Foxp3 mRNA的表達，篩選出具有上調Foxp3 mRNA的藥物；培養小鼠幼稚性T淋巴細胞，加入藥物，檢測Foxp3 mRNA的表達，篩選出上調該基因表達的藥物，并進一步驗證該藥能上調CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺在CD4⁺T細胞中的百分率；培養小鼠幼稚性T淋巴細胞，加入細胞因子誘導向Th17細胞轉化，加入藥物，檢測Th17細胞核轉錄因子RORγt mRNA的表達，篩選出下調該基因表達的藥物，并進一步驗證該藥能下調CD4⁺IL-17⁺在CD4⁺T中的百分率。本發明采用體外篩選方式、藥物用量少、時間短、可靠性高、應用前景廣。
文檔編號G01N15/10GK101392294SQ20081020214
公開日2009年3月25日 申請日期2008年11月3日 優先權日2008年11月3日
發明者明 李, 驥 楊 申請人:復旦大學附屬中山醫院