專利名稱：：一種同時測定人血漿中多種局部麻醉藥物濃度的方法
技術領域：
：本發明屬醫學檢驗領域，涉及體內藥物的分析測定方法，具體涉及一種同時測定人血漿中多種局部麻醉藥物濃度的方法。
背景技術：
：普魯卡因(PR0)、利多卡因(LID)、羅哌卡因(R0P)、丁卡因(TET)和布比卡因(BUP)是目前臨床上常用的局部麻醉藥物。其中ROP與BUP屬于起效慢但作用時間長的長效局部麻醉藥物，而PR0、TET、LID屬于起效快但作用時間短的短效局部麻醉藥物。臨床上常合并使用長效和短效局部麻醉藥物以便于手術順利實施。PR0、LID、R0P、TET和BUP五種藥物的藥動學個體間差異大、合并用藥普遍、肝腎功能異常會導致藥物血漿濃度和藥效變化，以及藥動學特性與藥物的中樞神經系統毒性和心臟毒性直接相關，因此通過檢測血漿中上述藥物的濃度來調整給藥劑量，對保證用藥的安全和有效有重要意義。TET易被血漿中膽堿酯酶水解，提高TET在分析過程中的穩定性是保證其血漿濃度測定方法準確度的關鍵，也是建立同時測定人血漿中PR0、LID、R0P、TET和BUP五種局部麻醉藥物濃度的分析方法的關鍵。迄今，國內外未見同時測定上述五種藥物的相關分析方法的文獻報道。
發明內容本發明的目的是克服已有技術的缺陷，提供一種測定人血漿中多種局部麻醉藥物濃度的方法。尤其涉及一種簡便、快速、靈敏、可同時測定人體普魯卡因(PR0)、利多卡因(LID)、羅哌卡因(R0P)、丁卡因(TET)和布比卡因(BUP)血藥濃度的方法。本方法無需昂貴的設備和試劑，具有操作簡便、快速、血漿用量少、成本低等優點，適合常規血藥濃度監測。本方法通過下述技術方案實現待測樣品預處理后，經酸性流動相在色譜柱分離，用紫外檢測器檢測。本方法包括下述步驟1)樣品預處理取待測樣品，加入血漿膽堿酯酶抑制劑新斯的明抑制樣品水解，經氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液堿化，加入定量的有機溶媒，上述操作均在3'C以下冰浴條件下進行；進行常溫萃取、離心后，取上層有機溶液氮氣吹干、流動相復溶，取上清液進樣；所述的新斯的明溶液為0.52mg/tnL，氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液為0.52mol/L，所述的有機溶媒優選乙醚溶液；2)樣品分離采用通用型的液相色譜柱，其填料為KromasilCi8，高效液相系統采用通用型高壓泵和進樣器，采用30mmol/L的磷酸二氫鉀水溶液(含0.14~0.18%三乙胺溶液，磷酸溶液調pH=4.8~5.l)和乙腈的混合液作為流動相，等度洗脫；所述的磷酸二氫鉀水溶液乙腈為63士2:37±2，優選磷酸二氫鉀水溶液乙腈為63:37，V/V;3)樣品檢測采用通用型紫外檢測器210±1nm檢測LID、ROP和BUP的峰面積，290±1nm檢測PRO和TET的峰面積，用標準曲線方程換算成濃度。本方法具有以下優點1.同時測定只需一種方法即可測定人血漿中PR0、LID、R0P、TET和BUP濃度，降低了分析成本，簡化了分析步驟，減少了血漿采集量，大大提高了以上五種藥物臨床血藥濃度檢測的效率。2.采樣量少測定一份樣品只需0.5ml血漿樣本；3.預處理簡便樣品堿化后乙醚萃取，簡便易行，適用于常規檢測；4.靈敏度高通過雙波長檢測，明顯提高同時測定的檢測靈敏度，PRO、LID、R0P、TET和BUP的最低定量限均為0.05叫/mL;5.選擇性強內源性物質、常用麻醉和鎮痛藥物以及常用抗生素藥物等對測定不干擾。6.測定時間短整個色譜分析測定過程為13min。本發明方法快速準確、操作簡便、靈敏度高、成本低，適合臨床常規監測。所述PRO、LID、ROP、TET和BUP測定的線性良好，濃度范圍均為0.055網/mL，方法回收率穩定，日內和日間的精密度(相對標準差，RSD)均小于12%。圖1:典型色譜圖未服用PRO、LID、ROP、TET和BUP受試者的空白血漿，其中，A:210nm;B:290nm。圖2:典型色譜圖空白血漿添加PRO、LID、ROP、TET和BUP標準品(PRO、LID、ROP、TET和BUP的濃度均為0.05|ng/mL)其中，A:210nm;B:290nm。圖3:使用PRO和BUP受試者的色譜圖，其中，A:210nm;B:290nm。圖4:使用TET和ROP受試者的色譜圖，其中，A:210nm;B:290nm。圖5:使用LID和ROP受試者的色譜圖，其中，A:210nm;B:290咖，其中，1:LID，2:ROP，3:BUP,4:PRO，5:TET，6:內標(卡馬西平)。具體實施方式實施例1色譜條件Waters2690HPLC系統，Waters2487雙波長紫外檢測器，Millennium32色譜工作站(Version4.0);色譜柱KromasilCl8(250mmX4.6mm,5nm);柱溫40°C;流動相30mmol/L磷酸二氫鉀水溶液(含0.14%三乙胺溶液，磷酸溶液調pF^4.8):乙腈(61:39，V/V);流速l.OmLmin-';210nm測定LID、ROP和BUP的濃度，290nm測定PRO和TET的濃度。血漿樣品預處理取0.5mL血樣分別加入0.5rng/mL新斯的明溶液50pl、5網/mL內標溶液lOOpl和0.5mol/LKaOH溶液lOOuL，渦旋10Sec，混勻，加入乙醚3mL，上述操作均在3"以下冰浴條件下進行；渦旋2min，2500gX8min離心，取上清液2.5mL于另一試管中，40。C氮氣流吹干，殘留物加入lOOpL50%甲醇/水溶解，渦旋10Sec，12000gX8min離心，分取上清液30pL進行，內標法以峰面積定量。專屬性取不同來源的10名未服用PR0、LID、R0P、TET和BUP的受試者的空白血漿，按照上述樣品預處理和測定方法進行測定，未發現血漿內源性物質對上述測定組分有干擾。此外，常見合并用藥地西泮、咪唑安定、芬太尼、曲馬多、ti引哚美辛、阿司匹林、對乙酰氨基酚、頭孢唑啉、頭孢替安、頭孢呋辛鈉、更昔洛韋、噴昔洛韋、利巴韋林、阿替洛爾、美托洛爾、普萘洛爾等對測定沒有干擾。PR0、LID、R0P、TET、BUP和內標的典型色譜保留時間分別為3.5、5.6、6.3、8.1、9.0、11.1min，整個色譜分析過程時間為13min。線性試驗精密稱取PR0、LID、R0P、TET和BUP標準物質適量，用50%甲醇溶解，稀釋成系列工作液，再加入適量空白人血漿，配制成含PR0、LID、R0P、TET和BUP血漿濃度分別為0.05,0.1,0.25，1，2.5和5Pg/mL的標準血樣。取血漿0.5mL,按"血漿樣品預處理"方法操作。內標法以待測組分與內標的峰面積比(/0和待測組分濃度(C)作加權(l/0線性回歸，線性范圍均為0.055化/mL，最低定量限均為0.05Pg/mL,PR0、LID、R0P、TET和BUP的標準曲線回歸方程分別為PRO力-l.0515，產0.9993;LID力-O.3180.00252，戶0.9982;ROP力=0.401C-O.0130，r=0.9996;TET#0.838C-0.0104，產0.9998;BUP/1=0.342C-O.0107，尸0.9998。準確度和精密度精密稱取PR0、LID、R0P、TET和BUP標準物質適量，50%甲醇溶解并稀釋成系列工作液，再加入適量空白人血漿，配制成含PR0、LID、R0P、TET和BUP血漿濃度分別為0.15，2和4Pg/mL的系列血樣，各取血漿0.5mL,按"血漿樣品預處理"方法操作，考察日內和日間的精密度和準確度。根據線性回歸方程計算其實測濃度，計算每種濃度的實測平均值、偏差和相對標準差(RSD)，其中(C實測-C理論)/C理論X100X為偏差，結果表明三種待測物的日內和日間精密度均小于12%，相對偏差小于12%。本方法測定同時使用PRO和BUP受試者，某受試者的分析色譜圖顯示二者濃度分別為2.16和1.83嗎/mL(圖3)。表l顯示了PRO、LID、R0P、TET和BUP的日內、日間精密度和準確度。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例2色譜條件Waters2690HPLC系統，Waters2487雙波長紫外檢測器，Millennium32色譜工作站(Version4.0);色譜柱KromasilCl8(250ramX4.6mm，5pm);柱溫40°C;流動相30mmol/L磷酸二氫鉀水溶液(含0.18%三乙胺溶液，磷酸溶液調pH4.1):乙腈(65:35，V/V);流速l.OmL'min—';210nm測定LID、ROP和BUP的濃度，290nm測定PRO和TET的濃度。血漿樣品預處理取0.5mL血樣分別加入2mg/mL新斯的明溶液50pl、g/mL內標溶液100pl和2mol/LNa0H溶液100uL，渦旋8Sec，混勻，加入乙醚3mL，上述操作均在3。C以下冰浴條件下進行；渦旋2min，2500gX10min離心，取上清液2.5mL于另一試管中，40。C氮氣流吹干，殘留物加入100HL5(^甲醇/水溶解，渦旋10Sec，10000gX10min離心，分取上清液30pL進行，內標法以峰面積定量。取不同來源的10名未服用PR0、LID、R0P、TET和BUP的受試者的空白血漿，按照上述樣品預處理和測定方法進行測定，未發現血槳內源性物質對上述測定組分有干擾。此外，常見合并用藥地西泮、咪唑安定、芬太尼、曲馬多、d引哚美辛、阿司匹林、對乙酰氨基酚、頭孢唑啉、頭孢替安、頭孢呋辛鈉、更昔洛韋、噴昔洛韋、利巴韋林、阿替洛爾、美托洛爾、普萘洛爾等對測定沒有干擾。PR0、LID、R0P、TET、BUP和內標的典型色譜保留時間分別為3.7、5.6、6.5、8.7、9.4、12.0min，整個色譜分析過程時間為13min。線性試驗精密稱取PRO、LID、R0P、TET和BUP標準物質適量，用50%甲醇溶解，稀釋成系列工作液，再加入適量空白人血漿，配制成含PR0、LID、R0P、TET和BUP血槳濃度分別為0.05，0.1，0.25，1，2.5和5Pg/mL的標準血樣。取血漿0.5mL,按"血漿樣品預處理"方法操作。內標法以待測組分與內標的峰面積比(力)和待測組分濃度(C)作加權(l/0線性回歸，線性范圍均為0.055Pg/mL，最低定量限均為0.05Pg/mL，PR0、LID、R0P、TET和BUP的標準曲線回歸方程分別為PRO^l.17C+0.0384，嚴0.9996;LID/N),29100151，廣0.9991;R0P/^0.393C+0.00027，產0.9993;TET#0.820C-0.0108,產0.9996;BUP力=0.344C-0.00328，產0.9995。準確度和精密度精密稱取PRO、LID、R0P、TET和BUP標準物質適量，50%甲醇溶解并稀釋成系列工作液，再加入適量空白人血漿，配制成含PR0、LID、R0P、TET和BUP血漿濃度分別為0.15，2和4Pg/mL的系列血樣，各取血漿0.5mL，按"血漿樣品預處理"方法操作，考察日內和日間的精密度和準確度。根據線性回歸方程計算其實測濃度，計算每種濃度的實測平均值、偏差和相對標準差(RSD)，其中(C實甜-C理論)/Ca論X100M為偏差。結果表明三種待測物的日內和日間精密度均小于9%，相對偏差小于10%。本方法測定受試者血漿，使用TET和ROP的受試者的分析色譜圖顯示二者濃度分別為1.25和1.28叫/mL(圖4)。表2顯示了PR0、LID、ROP、TET和BUP的日內、日間精密度和準確度。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例3色譜條件Waters2690HPLC系統，Waters2487雙波長紫外檢測器，Millennium32色譜工作站(Version4.0);色譜柱KromasilC,s(250咖X4.6咖，5pm);柱溫40°C;流動相30飄ol/L磷酸二氫鉀水溶液(含0.16%三乙胺溶液，磷酸溶液調pH^4.9):乙腈(63:37，V/V);流速1.0mLmin—';210nm測定LID、ROP和BUP的濃度，290nm測定PRO和TET的濃度。血槳樣品預處理取0.5mL血樣分別加入lmg/mL新斯的明溶液50pl、g/mL內標溶液100pl和lmol/LNaOH溶液lOOuL，渦旋12Sec，混勻，加入乙醚3mL，上述操作均在3。C以下冰浴條件下進行；渦旋2min，3000gX9min離心，取上清液2.5mL于另一試管中，40°C氮氣流吹干，殘留物加入100pL50%甲醇/水溶解，渦旋10Sec，11000gX9min離心，分取上清液30pL進行，內標法以峰面積定量。取不同來源的10名未服用PR0、LID、R0P、TET和BUP的受試者的空白血漿，按照上述樣品預處理和測定方法進行測定，未發現血漿內源性物質對上述測定組分有干擾。此外，常見合并用藥地西泮-,咪唑安定、芬太尼、曲馬多、吲哚美辛、阿司匹林、對乙酰氨基酚、頭孢唑啉、頭孢替安、頭孢呋辛鈉、更昔洛韋、噴昔洛韋、利巴韋林、阿替洛爾、美托洛爾、普萘洛爾等對測定沒有干擾。PR0、LID、R0P、TET、BUP和內標的典型色譜保留時間分別為3.6、5.4、6.4、8.1、8.8、11.6min，整個色譜分析過程時間為13min。線性試驗精密稱取PR0、LID、R0P、TET和BUP標準物質適量，用50%甲醇溶解，稀釋成系列工作液，再加入適量空白人血漿，配制成含PR0、LID、R0P、TET和BUP血漿濃度分別為0.05，0.1,0.25，1，2.5和5Pg/mL的標準血樣。取血漿0.5mL，按"血漿樣品預處理"方法操作。內標法以待測組分與內標的峰面積比")和待測組分濃度(C)作加權(l/0線性回歸，線性范圍均為0.0554g/mL，最低定量限均為0.05iVmL，PR0、LID、R0P、TET和BUP的標準曲線回歸方程分別為PROX=l.186H).0323，廣0.9998;LID/H).294C-0.000778，f0.9996;ROP#0.4100.00161，r=0.9992;TET#0.838C-0.0103，產0.9997;BUP#0.353C-0.00093，f0.9992。準確度和精密度精密稱取PRO、LID、ROP、TET和BUP標準物質適量，50%甲醇溶解并稀釋成系列工作液，再加入適量空白人血漿，配制成含PRO、LID、ROP、TET和BUP血漿濃度分別為0.15，2和4Pg/mL的系列血樣，各取血漿0.5mL，按"血漿樣品預處理"方法操作，考察曰內和日間的精密度和準確度。根據線性回歸方程計算其實測濃度，計算每種濃度的實測平均值、偏差和相對標準差(RSD)，其中(C實測-C理論)/C理論X100M為偏差。結果表明三種待測物的日內和日間精密度均小于8%，相對偏差小于9%。本方法測定受試者血漿，使用LID和ROP的受試者的分析色譜圖顯示二者濃度分別為0.94和1.降g/mL(圖5)。表3顯示了PR0、LID、R0P、TET和BUP的日內、日間精密度和準確度。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權利要求1、一種同時測定人血漿中多種局部麻醉藥物濃度的方法，其特征是待測樣品預處理后，在酸性流動相下，經色譜柱分離后，用紫外檢測器檢測，包括以下步驟1)樣品預處理取待測樣品，在3℃以下冰浴條件下，加入血漿膽堿酯酶抑制劑抑制樣品水解，經氫氧化鈉或氫氧化鉀堿化，加入定量的有機溶媒；常溫萃取、離心后，取上層有機溶液氮氣吹干、流動相復溶，取上清液進樣；2)樣品分離采用通用型的液相色譜柱，其填料為KromasilC18，250mm×4.6mm，5μm，柱溫40℃；高效液相系統采用通用型高壓泵和進樣器，采用磷酸二氫鉀水溶液和乙腈的混合液作為流動相，等度洗脫；所述磷酸二氫鉀水溶液乙腈為63±237±2，V/V；3)雙波長檢測樣品采用通用型紫外檢測器波長210±1nm檢測LID、ROP和BUP的峰面積，波長290±1nm檢測PRO和TET的峰面積，用標準曲線方程換算成濃度。2、根據權利要求l所述的方法，其特征是，所述的血漿膽堿酯酶抑制劑為新斯的明溶液，濃度為0.52mg/mL。3、根據權利要求l所述的方法，其特征是，所述的氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液濃度為0.52mol/L。4、根據權利要求l所述的方法，其特征是，所述的有機溶媒為乙醚溶液。5、根據權利要求l所述的方法，其特征是，所述的局部麻醉藥物是普魯卡因、利多卡因、羅哌卡因、丁卡因和布比卡因。6、根據權利要求2所述的方法，其特征是所述的新斯的明在3'C以下冰浴條件抑制血漿膽堿酯酶活性，控制丁卡因水解。7、根據權利要求l所述的方法，其特征是所述步驟2)的色譜條件是通用型的液相色譜柱，其填料為KromasilC18,高效液相系統通用型高壓泵和進樣器，以30mmol/L的磷酸二氫鉀水溶液和乙腈的混合液作為流動相等度洗脫，所述的磷酸二氫鉀水溶液含0.14~0.18%三乙胺溶液，磷酸溶液調pH-4.85.1;所述的磷酸二氫鉀水溶液乙腈為63:37，V/V。全文摘要本發明屬醫學檢驗領域，涉及一種可同時測定人血漿中多種局部麻醉藥物濃度的方法。本方法采用血漿膽堿酯酶抑制劑抑制在3℃以下冰浴條件抑制血漿膽堿酯酶活性，控制丁卡因水解，保證了方法的準確度；利用利多卡因、羅哌卡因和布比卡因，普魯卡因和丁卡因分別在在210和290nm下有較強紫外吸收的特征，經酸性流動相在色譜柱分離后，用紫外雙波長法檢測，該法能使上述局部麻醉藥物同時測定的靈敏度大為提高。本法樣品取樣少，預處理簡單、快速、靈敏，無需昂貴的設備和試劑，分析周期短，成本低，適合多種藥物臨床常規血藥濃度的監測。文檔編號G01N30/02GK101393196SQ20081020138公開日2009年3月25日申請日期2008年10月17日優先權日2008年10月17日發明者崔學艷,施孝金,李中東,正焦,覃韋葦,鐘明康申請人:復旦大學附屬華山醫院