專利名稱：一種用于檢測鼠疫細菌感染的免疫層析試紙及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，尤其涉及一種免疫層析試紙，具體來說是 一種用于檢測鼠疫細菌感染的免疫層析試紙及其制備方法。
技術背景-
鼠疫耶爾森氏菌病的實驗室診斷主要為病原學診斷和血清抗體檢測， 病原學診斷方法是采集疑似鼠疫耶爾森氏菌病患者或病畜皮膚或腺體潰瘍
病灶分泌物、膿、血、痰樣品，接種胰酶大豆血瓊脂培養基，37°C 5%C02 培養72小時，挑取灰白色、圓形的菌落，制備玻片并作革蘭氏染色，如為 革蘭氏陰性球桿菌，則繼續進行生化鑒定和血清學試驗，必要時需進行動 物獨立測定。血清抗體檢測的原理為人、家畜和野生動物感染鼠疫耶爾 森氏菌后均可出現有診斷意義的血清抗體，初次特異抗體的出現一般是在 感染后1周，4-6周抗體滴度可達最高，以后逐步下降，半年至一年后仍 能檢測出特異性抗體。
鼠疫感染一周左右會出現特異性抗體，此時可用血清學檢查進行疾病 診斷。鼠疫血清學診斷方法有細菌凝集反應、沉降反應、碳凝集反應、
補體結合反應、免疫熒光反應、放射免疫沉淀反應、免疫電泳、酶聯免疫 吸附試驗和紅細胞凝集試驗(簡稱血凝)，目前應用最廣的是血凝。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種用于檢測鼠疫耶爾森氏菌感 染的免疫層析試紙及其制備方法，所述的這種用于檢測鼠疫耶爾森氏菌感 染的免疫層析試紙及其制備方法要解決現有技術中的用于檢測鼠疫感染的 方法測試時間長，測試方法復雜的技術問題。
本發明提供了一種用于檢測鼠疫耶爾森氏菌感染的免疫層析試紙，包括一層硝酸纖維素膜，所述的硝酸纖維素膜上設置有一條檢測線和質控線， 所述的檢測線為鼠疫耶爾森氏菌多糖抗原，所述的質控線為能與金黃色葡 萄球菌蛋白A結合的抗體，所述的硝酸纖維素膜設置在一層吸水墊上，所 述的硝酸纖維素膜上設置有一層金標墊，所述的金標墊為玻璃纖維膜或聚
酯膜，所述的玻璃纖維膜或聚酯膜中設置有金黃色葡萄球菌蛋白A標記膠
體金探針溶液，所述的金標墊上設置有一層樣品墊。
本發明還提供了一種用于檢測鼠疫耶爾森氏菌感染的免疫層析試紙的 制備方法，包括一個鼠疫耶爾森氏菌多糖抗原的制備方法， 一個將鼠疫耶
爾森氏菌多糖抗原以及可與金黃色葡萄球菌蛋白A結合的抗體固化在硝酸 纖維素膜上形成檢測線和質控線的步驟， 一個將硝酸纖維素膜粘貼在吸水
紙墊上的步驟， 一個制備金黃色葡萄球菌蛋白A (SPA)標記膠體金探針的 步驟， 一個制備金標墊的步驟， 一個在金標墊上粘貼樣品墊的步驟，得到 用于檢測鼠疫耶爾森氏菌感染的免疫層析試紙。
本發明和已有技術相對比，其效果是積極和明顯的。本發明的檢測鼠疫 耶爾森氏菌感染的免疫層析試紙及其制備方法與現有的其他方法相比，特 異性強、更簡便、更快速，更適于臨床和特殊情況下現場使用。
具體實施例方式
實施例1 檢測鼠疫感染的免疫試紙的制備 1.材料
氯金酸(HAuCl4.4H20)，分析純，上海試劑一廠 檸檬酸三鈉(Na3C5H507.2H20)，分析純，北京化工廠 碳酸鉀(K2C03)分析純，北京化工廠
金黃色葡萄球菌蛋白A (SPA)，購于Amersham Pharmacia Biotech公司
鼠疫耶爾森氏菌株(從俄羅斯引進，株名為E.V，現由中國人名解放軍 微生物流行病研究所菌種庫保存，保藏號410049) 鼠疫陽性血清國家標準品，國家生物制品鑒定所生產豚鼠、黃鼠、兔和人鼠疫陽性和陰性血清，中國疾病預防控制中心鼠疫 布氏桿菌預防控制基地提供。
硝酸纖維膜，美國Millipore公司。 玻璃纖維膜，上海良信公司。 塑料背板，北京燕華公司。
間接血凝鼠疫測定藥盒，中國疾病預防控制中心鼠疫布氏桿菌病預防控 制基地生產(LotNo.200301)。 2.1鼠疫耶爾森氏菌可溶性蛋白多糖復合物抗原的制備
將鼠疫桿菌接種4%甘油普通培養基，37。C培養48小時，用無菌生理 鹽水洗下菌苔，菌懸液約為比濁濃度(lX10S個菌/ml)，流通蒸汽lh，冷 卻至室溫后8000r/min離心15min，收集上清備用。 2.2金黃色葡萄球菌蛋白A (SPA)膠體金探針的制備
用水溶解氯金酸使其終濃度為0.01%，煮沸后每100ml氯金酸溶液進 行一下操作加入線的檸檬酸三鈉水溶液1.6ml，繼續煮沸10分鐘，用純 水恢復至lOOml，冷卻至室溫后用0.2M K2C03調pH至6，攪拌加入 SPA0.7mg， 15min后加入10%的聚乙二醇200002ml ，繼續攪拌30, 15000-16000rpm離心30，棄上清，沉淀即為SPA標記膠體金探針。將該探 針溶于10ml 0.01M四硼酸鈉緩沖溶液中，4度冰箱保存。 2.3鼠疫膠體金快速診斷免疫層析試紙的制備
膠體金快速診斷免疫層析試紙由吸水紙墊、硝酸纖維素膜、金標墊和 玻璃纖維素膜樣品墊四部分組成。
用O.Olml pH7.2PBS緩沖液稀釋鼠疫耶爾森氏菌F抗原0.26mg/ml和 兔血清IgG2.5mg/ml，分別作為檢測線和質控線分別噴于硝酸纖維素膜的 中間，兩條線中間間隔0.5cm (BIODOT公司XYZ3000噴膜機)，37'C干 燥2h。用SPA標記膠體金探針懸液浸在玻璃纖維膜上制備成金標墊，冷凍 干燥機抽干后備用；將四種材料從上至下按吸水墊、硝酸纖維素膜、金標墊、玻璃纖維素膜樣品墊依次粘貼在塑料背板上，按所需大小切割，裝入 塑料層析盒，即為鼠疫膠體金法快速診斷盒，加干燥劑后密封保存。
權利要求
1.一種用于檢測鼠疫耶爾森氏菌感染的免疫層析試紙，包括一層硝酸纖維素膜，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上設置有一條檢測線和質控線，所述的檢測線為鼠疫耶爾森氏菌多糖抗原，所述的質控線為能與金黃色葡萄球菌蛋白A結合的抗體，所述的硝酸纖維素膜設置在一層吸水墊上，所述的硝酸纖維素膜上設置有一層金標墊，所述的金標墊為玻璃纖維膜或聚酯膜，所述的玻璃纖維膜或聚酯膜中設置有金黃色葡萄球菌蛋白A標記膠體金探針溶液，所述的金標墊上設置有一層樣品墊。
2. —種用于檢測鼠疫耶爾森氏菌感染的免疫層析試紙的制備方法，其特征在于包括一個鼠疫耶爾森氏菌多糖抗原的制備方法， 一個將鼠疫耶爾 森氏菌多糖抗原以及可與金黃色葡萄球菌蛋白A結合的抗體固化在硝酸 纖維素膜上形成檢測線和質控線的步驟， 一個將硝酸纖維素膜粘貼在吸水紙墊上的步驟，一個制備金黃色葡萄球菌蛋白A標記膠體金探針的步驟， 一個制備金標墊的步驟， 一個在金標墊上粘貼樣品墊的步驟，得到 用于檢測鼠疫耶爾森氏菌感染的免疫層析試紙。
全文摘要
一種用于檢測鼠疫耶爾森氏菌感染的免疫層析試紙，包括一層硝酸纖維素膜，所述的硝酸纖維素膜上設置有一條檢測線和質控線，所述的檢測線為鼠疫耶爾森氏菌多糖抗原，所述的質控線為能與金黃色葡萄球菌蛋白A結合的抗體，所述的硝酸纖維素膜設置在一層吸水墊上，所述的硝酸纖維素膜上設置有一層金標墊，所述的金標墊上設置有一層樣品墊。本發明還提供了一種用于檢測鼠疫耶爾森氏菌感染的免疫層析試紙的制備方法。本發明的檢測鼠疫耶爾森氏菌感染的免疫層析試紙及其制備方法與現有的其他方法相比，特異性強、更簡便、更快速，更適于臨床和特殊情況下現場使用。
文檔編號G01N33/569GK101676723SQ20081020002
公開日2010年3月24日 申請日期2008年9月18日 優先權日2008年9月18日
發明者葛海鵬 申請人:上海海泰金芯生物分子檢測技術有限公司