專利名稱：：一種微量終點顯色鱟試驗方法
技術領域：
：本發明涉及細菌內毒素檢測技術，特別是一種微量終點顯色鱟試驗方法。
背景技術：
：細菌內毒素檢測技術在現代醫藥工業上有重要的應用價值。現行的細菌內毒素檢測方法是鱟試驗法。鱟試驗法需要使用鱟試劑(TAL或LAL)，而生產鱟試劑需要消耗珍貴的鱟資源。在我國，鱟資源已瀕臨枯竭。目前尚沒有更成熟的或更好的細菌內毒素檢測方法能夠取代鱟試驗法。如果由于鱟資源的枯竭而導致鱟試劑供應緊缺，對我國的醫藥工業將是災難性的打擊。在尚沒有更好的替代方法的今天，研究一種消耗資源更少的鱟試驗法具有重要和實際的意義。《中國藥典》2005年版收載的細菌內毒素檢測(BET)方法分類如下-工限量法凝膠法i半定量法BET方法j光度法<L顯色"動態顯色法L終點顯色法上述BET方法的鱟試劑(TAL)用量，凝膠法是每反應試管100^1，光度法是每反應試管或每反應孔50~10(Hil。以下稱每反應管(或孔)的TAL用量為每單個試驗用量，以pl/T表示(T為Test的縮寫)，如凝膠法TAL用量為100fil/T，光度法TAL用量為50100nl/T。終點顯色法鱟試驗的原理是人工合成一種顯色基質，通常是一種寡肽(三肽或四肽)，肽鏈的末端連接一個顯色基團對硝基苯胺(pNA)。當TAL與內毒素反應產生凝固酶時，凝固酶能水解顯色基質的肽鍵使pNA分離，游離的pNA使溶液呈黃色。用光度儀測定溶液的光度值可以建立內毒素濃度與光度值的線性關系。反應過程示意如下-a必a「動態濁度法廣濁度法jL終點濁度法內毒素TAL~~^凝固酶凝固酶顯色基質~L^肽+pNA(黃色)現行終點顯色法鱟試驗的實驗步驟如下(以下步驟所描述的過程是指每反應試管或每反應孔的試驗過程)(1)用水分別復溶凍干的TAL和顯色基質。(2)50plTAL+5(^1樣品_11^_^反應5~30分鐘(3)加入顯色基M~~^~~^反應5~30分鐘(4)加入10(^1反應終止液終止反應(5)用光度儀測讀反應混合溶液(共300ijI)的光度值(6)對實驗數據作回歸分析
發明內容本發明的目的是改進現行的終點顯色法鱟試驗，減少BET的TAL耗量，提供一種微量終點顯色鱟試驗方法。為實現上述發明目的，本發明采取的技術方案是一種用于細菌內毒素檢測的微量終點顯色鱟試驗方法，該方法使用一種用塑料制作的96孔微孔酶標板作為反應容器及光度測定容器，使用微量的鱟試劑(TachypleusAmebocyteLysate，TAL或LimulusAmebocyteLysate，LAL)作終點顯色法鱟試驗。所述96孔微孔酶標板外周尺寸及各孔中心位置與美國國家標準學會(AmericanNationalStandardsInstitute,ANSI)及生物分子篩選學會(SocietyforBiomolecularScreening,SBS)標準ANSI/SBS4-2004forMicroplates-WellPositions中Figure1-Wdlpositionsofa96wellmicroplate的酶標板(microplate)的外周尺寸及各孔中心位置相同；所述各孔的直徑為①3.(K5.0mm，孔深為712mm。所述96孔微孔酶標板可用作所有光度法鱟試驗的反應容器及光度測定容器，包括濁度法和顯色法鱟試驗。所述孔的最佳尺寸為直徑為04.(K4.4mm，孔深為10mm。一種微量終點顯色鱟試驗方法，其步驟如下(以下步驟所描述的過程是指每單個孔的試驗過程)(1)用水復溶凍干的顯色基質，用顯色基質溶液復溶凍干的鱟試劑，使復溶后的鱟試劑含有顯色基質；(2)取1040iJl含有顯色基質的鱟試劑加入96孔微孔酶標板的反應孔中，另加入等量的樣品(水、標準內毒素或供試品)，混勾，置適宜溫度(通常是37t:)反應一定的時間(通常是530分鐘)；(3)當反應達到預定的時間，另加入一定量的反應終止液(通常是鱟試劑量的兩倍)去終止該反應；(4)把96孔微孔酶標板放入光度儀/酶標儀中測定吸光度值(OD)，對數據作回歸分析并計算供試品的內毒素含量。所述微量終點顯色鱟試驗方法-(1)鱟試驗使用96孔微孔酶標板作反應容器及光度測定容器；(2)使用顯色基質溶液復溶鱟試劑，使鱟試劑溶液含有顯色基質；(3)鱟試劑用量為10^4(Hd/T;(4)顯色基質存在于反應全過程。本發明的微量終點顯色鱟試驗方法消耗的TAL量僅是現行鱟試驗方法的10~20%，即1(K20nl/T，而且實驗操作更簡便快捷。本發明的部分內容同樣可以應用到其它光度法鱟試驗，使TAL的用量減少8(K900/。。本發明從如下兩方面進行探索研究，以達到減少TAL用量之目的-1.反應容器現行顯色法鱟試驗使用的反應容器是一種用塑料制作的，有96個孔，孔徑(D6.4^6.7mm，孔深10mm的標準微孔板(microplate,也稱酶標板或細胞培養板)。反應孔結構及尺寸與TAL用量有極大關系。1)一般認為，只要減少被測溶液的體積，就可以相應減少TAL的用量。這只是一種簡單的直覺。光度法測定的原理是基于被測量參數(如內毒素濃度C)與光度值的相關性。簡單地減少被測溶液的體積會影響到被測參數與光度值的相關性。根據吸光度公式A=8LC,要保證光度值(A)對被測參數(C)的變化有足夠的敏感性，被測溶液必須維持一定的深度(L，即透射光程)。以標準微孔板為例，如果想減少被測溶液的體積，又要不影響C與A的相關性，就要保持大致的溶液深度L。要使體積減少而深度不變，只能通過縮小反應孔的孔徑①去實現。為此，本發明的96孔微孔酶標板的孔徑只有O)3.05.0mm。根據公式V=r2nh，lOOpl的反應混合液(50(JlTAL+50yl樣品)在標準微孔板上達到的液深為2.86mm，而同樣的液深在(D3.0mm的特制微孔板上只需20pl反應混合液就可以達到。20jj1的反應混合液只需要lOpl的TAL。2)最小孔徑雖然反應孔徑越小節省TAL越多，但確定最小孔徑值時必須考慮如下因素(1)光度儀的透射光束直徑光度儀的投射光束直徑通常在O2.0mm左右，因此反應孔徑的最小值理論上應不小于2.0mm，否則投射光會打在反應孔的邊緣，影響光度值測量的準確性。(2)實驗操作的適用程度反應孔徑太小，會增加實驗操作的難度。經過實驗比較，反應孔徑在0)35mm，孔深在7~12mm較適宜。3)反應孔位置現行的標準96孔微孔板適合絕大多數的光度儀/酶標儀使用。為了提高本發明的適用性，本發明的96孔微孔酶標板，各孔的圓心位置及板的周邊尺寸與美國標準96孔微孔板[1]完全相同。這意味著凡適用標準96孔微孔板的光度儀/酶標儀都適用本發明的96孔微孔酶標板。本發明的96孔微孔酶標板的結構及尺寸見圖1。2.實驗方法學本發明大幅度減少TAL的用量，要使內毒素檢測所依據的酶促反應至少保持原有的特性(靈敏度、反應速度以及抗干擾能力)，還需要改進實驗的方法。現行的顯色鱟試驗方法分為動態法和終點法兩種，主要區別如下動態法終點法內驗鵬Q"^gjMSTT)內驗喊C)JM^像OD)分另蛉肺梟分另鵬娜含顯^^TAL繊力瞎fflfp口口^S^娜tal娜瞎fifR賺液<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>特征①顯色基質存在于反應全過程①顯色基質在反應后過程才加入參與反應②靈敏度高②靈敏度相對低實驗操作方便繁瑣制備技術要求高較低制備成本高較低終點顯色法鱟試驗的靈敏度一般為0.1EU/mL，而動態顯色法鱟試驗的靈敏度可達0.005甚至0.001EU/mL。動態法鱟試驗靈敏度高的原因主要有兩個一是反應的時間較長；二是顯色基質始終存在于反應的全過程。動態法的試劑制備是把顯色基質與TAL混合在一起冷凍干燥而成。這種制備方法對TAL和顯色基質的純度要求以及制備技術要求非常高，因而制備成本也相對高。使用時，用水復溶凍干的TAL，TAL溶液就已經含有顯色基質。當TAL與內毒素反應把TAL中的凝固酶原激活成凝固酶時，凝固酶能馬上水解溶液中的顯色基質，使其釋放出顯色基團pNA。這就是動態顯色法鱟試驗靈敏度高的重要原因之一。終點顯色法試劑的制備方法是把TAL與顯色基質分開凍干。這樣對TAL原料和顯色基質的要求相對低，制備技術也較簡單，因而制備成本也較低。使用時要用水分別復溶TAL和顯色基質，先用TAL與樣品反應，樣品中的內毒素使TAL的凝固酶原激活成凝固酶。反應過一段時間后，才加入顯色基質，讓溶液中的凝固酶水解顯色基質釋放出顯色基團pNA。這種分段反應的方式使得終點法的靈敏度、反應速度以及抗干擾能力均遜于連續反應方式的動態法。此外，分段反應方式還使得實驗操作繁瑣，增加了影響實驗精確性的因素。正是終點法的這些缺陷導致了該方法的應用日漸式微，在今天終點顯色法鱟試驗已幾乎退出市場，取而代之的是動態法鱟試驗。本發明選擇顯色法作為研究對象，是因為顯色法鱟試驗使用顯色基質參與反應，替代了TAL的部分功能。而顯色基質是一種人工合成的寡肽，不存在資源問題。本發明選擇終點顯色法鱟試驗作為研究改進的對象，是因為終點法不需要動態法所必需的較昂貴的光度儀，使本發明易于推廣。但是，本發明要解決的一個關鍵問題是在大幅度減少TAL用量的條件下，如何使鱟試驗保持足夠的靈敏度、反應速度以及抗干擾能力。本發明分析了動態顯色法鱟試驗具有較好性能的原因，認為關鍵在于動態法采用的是連續反應方式，顯色基質始終存在于反應溶液中。進而考慮，如果終點法鱟試驗借鑒動態法的連續反應方式，是否具有動態法同樣的良好性能呢？我們使用動態顯色法試劑來作微量終點顯色法試驗，實驗結果表明我們的推測是完全正確的。如前所述，動態顯色法試劑的制備技術要求要比終點顯色法高，制備成本也高。本發明的目的不僅要研制一種微量的鱟試驗方法，而且要使該方法易于被推廣應用，包括它的優良性能及低制造成本。我們分析了動態顯色法試劑的制備工藝，認為該工藝的主要特點在于TAL與顯色基質混合凍干，使得制備工藝對原材料及處理的要求比終點顯色試劑更為嚴格。除了混合凍干法外，是否還有其它方法使顯色基質始終存在于反應溶液中呢？經過大量的試驗比較，我們找到一種最簡捷有效的方法，就是使用顯色基質溶液來溶解TAL，使復溶的TAL中含有所需濃度的顯色基質，這相當于用水復溶動態顯色法試劑的效果。使用這種方法，制備試劑時可以與制備普通的終點顯色法試劑一樣分別凍干TAL和顯色基質，避免象制備動態顯色法試劑所需的高要求高成本。使用試劑時，先用水復溶顯色基質，再用顯色基質溶液去復溶凍干的TAL。這樣在實驗操作上比動態法鱟試驗略顯繁瑣，但比現行的終點顯色法鱟試驗省略了一個重要且耗時的操作步驟。綜上所述，本發明的微量終點顯色法鱟試驗在實驗方法學上與現行終點顯色法有明顯的差異。兩種方法比較如下現行終點顯色法微量終點顯色法相關變量C國ODC-ODTAL與顯分別冷凍干燥，分別保存色基質存在形態使用方式①用水分別復溶TAL和顯色基質；②取50~100|J1TAL溶液加等量樣品溶液反應一定激隊顯^^再鵬"^11司;④加入反應終止液終止反應分別冷凍干燥，分別保存①用水復溶顯色基質，用顯色基質溶液復溶TAL;②取1040|Jl含顯色基質的TAL溶液加等量樣品溶液反應一定時間；③加入反應終止液終止反應反應機理特征第①步TAL凝固i第②步:顯色,肽+pNA(黃色)①顯色基質在反應后過程才加入參與反應②靈敏度相對低，抗干擾能力相對差TAL~^美顯色^固酶I肽+pNA(黃色)①顯色基質存在于反應全過程②靈敏度較高，抗干擾能力較好實驗操作制備技術較低相對方便、快捷較低制備成本較低較低圖1是本發明塑料96孔微孔酶標板結構示意圖。具體實施例方式舉例使用微量終點顯色鱟試驗法對一種供試品進行細菌內毒素檢查的方法及步驟如下。一、制備終點顯色法鱟試驗使用的鱟試劑(TAL)。二、制備終點顯色法鱟試驗使用的顯色基質。三、制備細菌內毒素檢查用水(BET水)。四、制造一種塑料96孔微孔酶標板1(Microplate)，該酶標板各孔2的直徑為O3.0~5.0nwn,孔深為712mni，酶標板外周尺寸及各孔中心位置與美國國家標準學會及生物分子篩選學會標準ANSI/SBS4-2004forMicroplates-WellPositions中Figurel-WellPositionsofa96wellmicroplate的酶標板的夕卜周尺寸及各孔中心位置相同。五、制備內毒素標準系列溶液(C溶液)，如0.5、0.25、0.125、0.06EU/mL，制備方法應符合《中國藥典》細菌內毒素檢査法(BET法)的要求。六、制備供試品溶液(A溶液)和陽性供試品對照溶液(B溶液)，制備方法應符合BET法要求。七、按使用說明用BET水復溶凍干的顯色基質，輕輕搖勻，然后按TAL的標示裝量吸取相應量的顯色基質溶液復溶TAL，輕輕搖勻。八、取步驟四所述的塑料96孔微孔酶標1板一塊，按下表設置的反應項目加入相應溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>九、加液完畢，把酶標板置振板器上振310秒，然后置酶標板于37。C恒溫孵育530分鐘。十、孵育到預定的時間后，往每孔加入40pl反應終止液，然后把酶標板置振板器上振310秒。十一、把酶標板放入光度測定儀/酶標儀中測定每孔的吸光度值(OD)，對OD數據作回歸分析，建立標準內毒素濃度與OD關系的標準曲線；用此標準曲線計算供試品的內毒素含量。權利要求1.一種微量終點顯色鱟試驗方法，其特征是該方法使用塑料96孔微孔酶標板作為反應容器及光度測定容器，使用微量的鱟試劑作終點顯色法鱟試驗。2、據權利要求1所述的微量終點顯色鱟試驗方法，其特征是所述塑料96孔微孔酶標板(1)外周尺寸及各孔(2)中心位置與美國國家標準學會及生物分子篩選學會標準中的酶標板的外周尺寸及各孔中心位置相同；所述各孔(2)的直徑為①3.05.0mm，孔深為712mm。3、據權利要求2所述的微量終點顯色鱟試驗方法，其特征是所述各孔(2)的直徑為04.(K4.4mm，孔深為10mm。4、據權利要求2或3所述的微量終點顯色鱟試驗方法，其特征是所述塑料96孔微孔酶標板(1)可用作所有光度法鱟試驗的反應容器及光度測定容器，包括濁度法和顯色法鱟試驗。5、據權利要求1所述的微量終點顯色鱟試驗方法，其特征是使用微量的鱟試劑TAL或LAL作終點顯色法鱟試驗，其步驟如下，以下步驟所描述的過程是指每單個孔的試驗過程-a)用水復溶凍干的顯色基質，用顯色基質溶液復溶凍干的鱟試劑，使復溶后的鱟試劑含有顯色基質；b)取1040|J1含有顯色基質的鱟試劑加入到96孔微孔酶標板(1)的反應孔(2)中，另加入等量的樣品，混勻，在溫度為37匸的條件下反應530分鐘；所述樣品為水、標準內毒素或供試品-,c)當反應達到預定的時間，另加入反應終止液，加入量通常是鱟試劑量的兩倍，去終止該反應；d)把96孔微孔酶標板(1)放入光度儀/酶標儀中測定吸光度值OD，對數據作回歸分析并計算供試品的內毒素含量。6、據權利要求5所述的微量終點顯色鱟試驗方法，其特征在于a)鱟試驗使用塑料96孔微孔酶標板(1)作反應容器及光度測定容器；b)使用顯色基質溶液復溶鱟試劑，使鱟試劑溶液含有顯色基質；c)鱟試劑用量為d)顯色基質存在于反應全過程。全文摘要本發明涉及細菌內毒素檢測技術，特別是一種微量終點顯色鱟試驗方法。該方法使用96孔微孔酶標板作為反應容器及光度測定容器，使用微量的鱟試劑(TachypleusAmebocyteLysate，TAL或LimulusAmebocyteLysate，LAL)作終點顯色法鱟試驗。本發明的微量終點顯色鱟試驗方法消耗的TAL量僅是現行鱟試驗方法的10～20％，即10～20μl/T，而且實驗操作更簡便快捷。本發明的部分內容同樣可以應用到其它光度法鱟試驗，使TAL的用量減少80～90％。文檔編號G01N33/579GK101368967SQ200810198228公開日2009年2月18日申請日期2008年8月28日優先權日2008年8月28日發明者馮聚錦,群韋申請人:湛江安度斯生物有限公司