專利名稱：：評判孕婦早產風險的膠體金試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種試劑盒，尤其涉及一種用胎兒纖維連接蛋白(fFN)和白介素6(IL-6)聯合評判孕婦早產風險的膠體金試劑盒，本發明還涉及該試劑盒的制備方法，屬于評判孕婦早產風險的試劑領域。
背景技術：
：早產是一種嚴重的威脅健康的問題，早產兒患新生兒健康并發癥(發育不良)的危險性較高。如智力低下，腦癱，肺部以及消化道問題，喪失視覺和聽覺以至于死亡，因此預測早產對于降低早產危害具有重要意義。從1981年以來，婦女的早產率增加了30%還多。在過去的20年中，盡管科技和醫學不斷進步，早產率仍然每10年大約增加10%。目前，美國約12.5%的嬰兒是早產兒，而提早分娩是美國嬰兒發病和致死的第一原因。在中國，統計到的早產發生率為8-10%。妊娠期少于36周出生的嬰兒被稱為早產兒，其中妊娠期在34-36周約占70%，妊娠期在32-33周約占13%，妊娠期在28-31周約占10%，另有6%妊娠期不足28周。早產在中國約為分娩總數的8-15%，早產兒發育不成熟，體重輕(一般低于2500克)。中國的早產兒死亡率高達15%，10%早產兒有終身后遺癥。早產是一種嚴重的威脅健康的問題，對家庭、社會、接生醫院、醫生及早產兒本人會有較大的精神負擔和物質負擔。當前預測早產的主要有物理指標和生化指標兩種方法1、物理指標及相關檢測方法宮頸評價宮頸指數(漏斗長度+1/宮頸管長度)陰道指檢主觀性，創傷性，易感染宮頸陰道超聲檢查特異性差，影響因素較多。2、生化指標及相關檢測方法各種激素在血液和/或體液中的含量促腎上腺激素釋放素(corticotrophin-releasinghormone,CRH)，血槳中的CRH水平可預測早產，尤其是應激性早產；雌三醇(estriol，E3):唾液中E3含量的變化可預測早產(受飲食等環境干擾較大，特異性差，誤差大)；炎性因子白介素6，8(IL-6，8):白介素6在體液中的含量預測早產，尤其感染性早產。以上預測早產的方法雖各有特點，但仍然缺乏一種可靠，簡單方便，經濟快捷，靈敏度和特異性都很好的臨床檢測方法來協助婦產科醫生預測早產。胎兒纖維粘連蛋白(fFN)是一種連接胎囊與子宮內膜的生物膠。孕婦在正常妊娠22到35周之間，由于絨毛膜和蛻膜的融合，其體液中的胎膠蛋白含量極低。分娩時，胎膠蛋白會與母體和胎兒分離溶于羊水并被宮頸與陰道分泌物所溶解。孕婦宮頸陰道分泌物中胎兒纖維連接蛋白的存在是胎兒分娩的最終靈敏標志物。MatthewaGetal等在研究中發現，宮頸陰道分泌物中的IL-6預測高危婦女的早產是獨立的，并且是至少等同于宮頸擴張和FFN在預測早產中的地位，并報道IL-6>35pg/ml時預測早產的敏感度77%，特異度60%，陽性預測值12%，陰性預測值97%。大量的專業研究成果和實驗證明了孕婦體液中胎膠蛋白含量同早產的密切相關性。在妊娠22-35周期間，孕婦宮頸陰道分泌物中胎膠蛋白的存在表明"膠體"比預期提前脫離，是早產的高危信號，目前研究認為早產前宮頸分泌物中fFN水平增高的產生機制主要有兩種一種是早產前的蛋白分解及機械性破壞絨毛-脫膜細胞外基質接觸面，使fFN完整釋放或降解進入宮頸陰道分泌物中；另一種是與早產密切相關的炎癥過程使蛋白水解酶釋放，破壞絨毛細胞外基質，使fFN釋放增加。因此，宮頸陰道分泌物中fFN的出現是預測早產的較理想的指標。宮頸分泌物中的FFN和IL-6水平與早產密切相關，FFN和IL_6有相關性。FFN和IL-6均是預測早產和一周內分娩的較為敏感的指標，聯合檢測兩項指標將提高早產和一周內分娩的預測能力，可作為一種新的預測早產和一周內分娩的方法。FFN和IL-6與取樣至分娩間隔天數均呈負相關，隨著它們水平的增加，分娩間隔明顯縮短，發生早產的可能性更大，而且FFN和IL-6陽性與妊娠的不良結局fFN在早產預測中的意義和價值日益受到關注，其在早產中的預測價值，尤其是陰性預測價值已較為肯定。由于早產并非單-原因引起，因此，fFN檢測與IL-6聯合檢測對于提高早產預測值具有重要意義。[OOM]免疫層析法(Imm皿ochromatogr即hy)是九十年代在美國興起的一種基于免疫膠體金技術的快速診斷技術，臨床上應用的產品主要采用雙抗體夾心的設計，此技術與以往的任何一項檢測技術相比的突出優點，快速(全部檢測過程僅需3-20分鐘)、準確、簡便、價格低廉、人為操作誤差小、穩定性好等特點外，由于該層析法為通過硝酸纖維素膜進行橫向流動，允許并聯多個試劑條進行多項指標聯合檢測，從而達到聯檢的目的。
發明內容本發明目的在于應用免疫層析法研制出一種可靠的臨床檢測試劑，通過檢測fFN及IL-6兩種早產標志物，從而大大提高孕婦的早產預測值，適合孕期婦女自我檢測及臨床醫院檢測是否有早產的風險。具體的，本發明目的是通過以下技術方案來實現的—種評判孕婦早產風險的膠體金檢試劑盒，包括檢測卡、吸滴管、加樣杯和一次性注射器；所述的檢測卡自下而上依次由樣品墊、膠體金標記的結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊的各自的邊緣連接在一起后固定于背襯上而組成；其中，所述的硝酸纖維素膜上含有由抗胎兒纖維粘連蛋白單克隆抗體和抗白介素_6(IL-6)單克隆抗體分別包被而成的2條檢測線和1條由羊抗鼠IgG包被而成的對照線；其中，羊抗鼠IgG對照線靠近吸水紙一端，2條檢測線靠近膠體金結合墊一端。所述的膠體金標記的結合墊按照以下方法制備得到將抗胎兒纖維粘連蛋白單克隆抗體和抗白介素_6單克隆抗體分別用金溶膠粒標記后，將其混合，包被于玻璃纖維上，即得；其中，所述的硝酸纖維素膜可以由尼龍膜等代替。所述的背襯可以是各種硬質的支持物，只要具有一定的硬度具有附載或支持的功能都可用于本發明，例如可以是塑料板(PVC)、硬紙板等，優選為PVC。本發明試劑盒的使用方法及評判標準(1)檢測對象用于檢測女性陰道分泌物中fFN及IL-6;(2)標本采集常規消毒外陰，窺器擴張陰道暴露宮頸，將無菌棉簽置于宮頸管內lOs，取出后置于PBS液lmL中，放置在一7(TC冰箱保存待用；(3)檢測用吸滴管將標本(陰道分泌物)收集在加樣杯中，將試紙刻度線(標記)以下浸入樣本中。等候約1分鐘，將樣本完全被吸收之后，取出鑒定片進行鑒定；[OO32](4)測定原理本發明檢測試劑盒采用兩點夾心固相免疫層析法定性檢測陰道分泌物中的fFN及IL-6。在試劑盒的檢測區分別包被有抗fFN及IL-6單克隆抗體，質控區包被有羊抗鼠IgG抗體。檢測時陰道分泌物中的fFN或IL-6與試劑盒上事先包被的膠體金標記抗fFN或IL-6單克隆抗體結合成結合物，該結合物隨著膜的毛細管作用向上遷移到達檢測區，與膜上的抗fFN或IL-6抗體起反應，出現一條或兩紅色條帶。無論標本中是否存在fFN或IL-6，當液面繼續遷移至固定羊抗鼠IgG區帶時，質控區應該會出現一條紅色條帶。如果如果檢測區(T)同時出現兩條紅色條帶，質控區出現一條紅色條帶，則表明被測者出現早產的風險非常高；如果檢測區(T)只出現一條紅色條帶，質控區出現一條紅色條帶，則表明被測者存有一定的早產風險；如果只有質控區(C)出現紅色條帶，而檢測區(T)沒有出現紅色條帶，則表明被測者出現早產的可能性極低；如果質控區(C)沒有出現紅色條帶，則需要重新判定樣本量是否足夠或需要分析層析過程是否正常等本發明為免疫層析膠體金快速檢測技術，定性或者半定量檢測陰道分泌物中的胎兒纖維連接蛋白及IL-6，將已純化的抗fFN及IL-6的單克隆抗體利用自動微量噴點設備，分別固定在已經過預處理硝酸纖維素膜上，再將已用膠體金標記的抗fFN及IL-6單克隆金標抗體分別固定在玻璃纖維膜上，制備成金結合物墊，再輔以恰當的樣品處理墊(聚酯膜)，組合成為檢測卡。采用雙抗體夾心法原理，可快速檢測孕早期婦女陰道分泌物中的fFN及IL-6。本發明采用了兩種標志物聯合檢測早產，克服了以前分開檢測方法的敏感性差的缺點，本發明3分鐘后可以判斷結果，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結果。準確、快速、操作簡單，可單人份使用，適用于家庭自助檢測等需要快速檢測的用途。圖1本發明試劑盒中的檢測卡示意圖；從左至右依次由樣品墊、膠體金標記的結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊連接在一起后固定于背襯之上。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式5進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1本發明膠體金診斷試劑盒的制備1、制備抗fFN及IL-6的單克隆抗體分別用純化的fFN(請給出)及IL-6膜蛋白免疫純系小鼠，小鼠血清產生相應的抗體時，即可將小鼠脾細胞和SP2/0細胞融合。利用HAT選擇雜交瘤細胞，并用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)對McAb進行檢測。對于檢測抗體陽性的雜交瘤應用有限稀釋法進行克隆，同時保存陽性細胞株，利用BALB/c純系小鼠制備大量的單克隆抗體，同時對抗體特異性的鑒定、識別抗原表位的鑒定、親合力的鑒定及配對試驗，篩選出效果最好的一對細胞株。將篩選到的細胞株重新植入小鼠腹腔中，過5-6天取出腹水，利用硫酸銨鹽析及親和層析純化得到單克隆抗體。2、膠體金試紙條的制備2.1膠體金的制備(1)用5毫升微量移液槍取3ml1%的四氯金酸于500ml的圓底燒瓶中，量取297ml的超純水亦加入燒瓶中，配制成0.01%的四氯金酸反應液，充分攪拌混勻；(2)連接上蛇形冷凝管，開啟冷凝水，并置于磁力加熱攪拌器上，加熱煮沸；(3)放入攪拌子，劇烈攪拌，然后一次性，快速準確的加入3ml檸檬酸鈉溶液；(4)金黃色的氯金酸水溶液首先變成灰色，約2分鐘后變為紫紅色，繼續煮沸5分鐘；(5)關閉磁力加熱攪拌器，待膠體金冷卻后，分裝于500ml的玻璃試劑瓶中，外面覆上鋁箔，按規定貼上標簽；制備的膠體金應呈現透亮的紫紅色，沒有聚合物及肉眼可見的沉淀；取適量于530nm波長處測定，紫外吸收值在1.3之間。2.2制備免疫金(1)根據用擬標記的膠體金的總量計算出所需要的待標記蛋白質的總量，本工藝每ml膠體金標記12ug/抗體，標記的抗體量為3.6mg;(2)用0.1M的碳酸鉀或者0.1M鹽酸調節膠體金的ra值為7.8;(3)在電磁攪拌下，將抗體蛋白質溶液加入膠體金溶液中，加入蛋白質時應逐滴加入，lmg的蛋白質大約5min加完；(4)抗體和膠體金反應5分鐘后，在磁力攪拌下加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為1%;(5)10分鐘后，加入3%的PEG20000至終濃度為0.3%;(6)繼續反應1小時或者過夜；(7)將標記好的膠體金溶液于2000r/min，4。C離心10min，吸出上清，棄去沉淀，以去除大的聚合物；(8)調整離心機的轉速為10000g/min，在4。C離心30分鐘，棄上清，將沉淀以原體積的0.Olmol./1PBSpH8.2(內含1%BSA)溶解，重復離心3次;(9)最后一次小心棄去上清，沉淀溶于溶于原體積的1/50PBS(內含1%BSA)中，即得免疫金；2.3檢測線和對照線包被(將檢測抗體固定在硝酸纖維膜上)檢測線劃線分別將抗fFN及IL-6膜蛋白單克隆抗體裝入BioDot噴膜機中(蛋白微量噴膜系統)，在硝酸纖維素膜上按1P1/cm的量劃上(膜規格為25mmX310mm);對照線劃線羊抗鼠抗體包被液裝入BioDot噴膜機中(蛋白微量噴膜系統)，在硝酸纖維素膜上按1P1/cm的量劃上(膜規格為25mmX310mm);包被37°C包被2小時；封閉37°C封閉30分鐘；干燥將包被后的硝酸纖維素膜放入真空干燥器內干燥20小時，密閉保存待用。2.4結合墊制備(1)開啟點膜儀，預熱30分鐘，用蒸餾水作10個循環；(2)調整免疫金的0D值為30，將免疫金加入機器左邊的塑料容器內，設置程序，調整2#噴頭噴量為2.5UL/CM，將免疫金均勻噴涂在玻璃纖維結合墊上，噴線的位置在結合墊的中央；(3)噴完結合墊后，置于37t:烘箱中干燥30分鐘；干燥將標記后玻璃纖維放入真空干燥器內干燥20小時，取出密閉保存待用。2.5檢測卡的制備(1)在塑料底板的中央撕去覆于上面的膠帶，貼上包被好抗體的硝酸纖維膜；(2)撕去塑料板中央下面的寬為5mm的膠帶，貼上噴上膠體金的結合墊，結合墊前端與硝酸纖維膜重疊2mm;(3)撕去塑料板最下面寬為20mm的膠帶，貼上經過預處理的樣品墊，樣品墊的前端與結合墊重疊約5mm;(4)撕去塑料底板的最上端約為25mm的膠帶，貼上吸水紙，吸水紙與硝酸纖維膜重疊約2mm;(5)組裝完后，將每一個配件都壓實，檢查粘貼的效果，將組裝好的大卡用切條機切成3mm寬的試紙條；(6)把切好的試紙條裝在測試卡中，即得。2.6試劑盒的組裝將吸滴管、樣品加樣杯、一次性注射器、制備好的檢測卡和使用說明書組裝在一個盒子里，即得本發明試劑盒；試驗例1本發明試劑盒臨床評判孕婦早產風險幾率的試驗選擇2007年3月一2008年9月在黑龍江省人民醫院產前門診及住院治療孕2834周初產婦141例，分為3組。I組41例，入選標準①有不規則宮縮^4次/h;②宮口擴張<2cm;③胎膜完整。II組40例，入選標準①有規律性子宮收縮；②子宮頸擴張^2cm或有進行性子宮頸容受及子宮頸擴張；③有陰道血性分泌物或胎膜已破。2組均為單胎妊娠。III組(對照組)60例，為相同孕周的單胎正常孕婦。所有孕婦無產科及內、外科并發癥。3組的年齡、孕次和取樣孕周無顯著性差異。應用本發明制備的試劑盒進行檢測，統計結果見表1:表1本發明試劑盒臨床檢測孕婦早產的試驗結果(％)7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>臨床研究表明，本發明聯合檢測fFN與IL-6膠體金聯檢診斷試劑盒可以準確的評判出孕婦所存在的早產風險，能夠顯著提高早產的檢出率，靈敏度高、特異性強，且檢測過程非常快速(全部檢測過程僅需3分鐘)。權利要求一種評判孕婦早產風險的膠體金檢試劑盒，包括檢測卡、吸滴管、加樣杯和一次性注射器；其中，所述的檢測卡自下而上依次由樣品墊、膠體金標記的結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊的各自的邊緣連接在一起后固定于背襯上而組成；其中，所述的硝酸纖維素膜上含有由抗單克隆抗體和抗白介素-6單克隆抗體分別包被而成的2條檢測線和1條由羊抗鼠IgG包被而成的對照線。2.按照權利要求1所述的膠體金檢試劑盒，其特征在于所述的膠體金標記的結合墊按照以下方法制備得到將抗胎兒纖維粘連蛋白單克隆抗體和抗白介素_6單克隆抗體分別用金溶膠粒標記后，將其混合，包被于玻璃纖維上，即得。3.按照權利要求1或2所述的膠體金檢試劑盒，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上羊抗鼠IgG對照線靠近吸水紙一端，2條檢測線分別靠近膠體金結合墊一端。4.按照權利要求1或2所述的膠體金檢試劑盒，其特征在于所述的硝酸纖維素膜由尼龍膜代替。5.按照權利要求1或2所述的膠體金檢試劑盒，其特征在于所述的背襯是各種硬質的支持物。6.按照權利要求5所述的膠體金檢試劑盒，其特征在于所述的背襯是塑料板。全文摘要本發明公開了一種評判孕婦早產風險的膠體金試劑盒及其制備方法。本發明試劑盒包括檢測卡，吸滴管、樣品加樣杯和一次性注射器；所述的檢測卡依次由樣品墊、膠體金標記的結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊連接組成。本發明分別將抗胎兒纖維連接蛋白單克隆抗體和抗白介素-6的單克隆抗體固定在硝酸纖維素膜或尼龍膜的不同位置上；用金顆粒標記上述兩種單克隆抗體，將上述金標抗體混合后制備成金結合物墊，再加上樣品墊和吸水墊，組合成為檢測。臨床研究表明，本發明試劑盒可以準確的評判出孕婦所存在的早產風險，顯著提高早產的檢出率，靈敏度高、特異性強，全部檢測過程僅需3分鐘，不需要特殊儀器，可肉眼直接判讀結果。文檔編號G01N33/577GK101750500SQ200810186280公開日2010年6月23日申請日期2008年12月22日優先權日2008年12月22日發明者張廣秋申請人:哈爾濱奧正醫藥科技開發有限公司