專利名稱：一種特定微生物的檢測方法
技術領域：
本發明涉及微生物的檢測，特別涉及一種特定微生物的檢測方法，如細菌 和真菌的檢測。
背景技術：
食品安全目前已成為人們非常關注的一個問題。據統計，在各種食品安全 問題中，由于微生物污染，特別是有害、致病微生物污染所引起的占了很大的 比例。因此，需要專門的技術檢測食品中的微生物。
目前，食品中微生物檢測的常規方法，大多數是以培養活的細胞生長為手 段來達到檢測目的，如平板菌落計數法等。雖然這些方法檢測靈敏度很高，但 這些方法均需要在實驗室的無菌條件下進行，并且需要一定的培養時間，所以
比較麻煩和費時，需要24小時或者更長的時間才能有結果。
在食品安全檢測中，人們總希望盡快得到檢測結果。若是像平板菌落計數
法一樣，所得到的結果往往只能作為事后的輔助驗證了。
為了解決常規檢測方法耗時長的不足，人們也開始研究各種快速的微生物
檢測方法，并得到了一定的結果，如
ATP生物發光法，就是利用微生物細胞內存在的ATP即三磷酸腺苷，當熒
光素酶系統和ATP接觸時會發光，這樣通過光強度的檢測就可以推知樣品中微
生物的含量。
法國梅里埃公司推出了一種微生物生長過程中由于新陳代謝而改變培養基 的成分，從而通過電阻抗的測量來達到微生物快速檢測的Bactometer系統。與 此相類似的還有Malthus的Malthus Microbial Analyser系統。
另外，隨著免疫技術和分子生物學的發展，人們也開發出一些基于免疫反 應或PCR技術的微生物檢測技術。
但是，上述技術，特別是快速檢測技術，還存在諸多不足，如
31、 目前所研究開發的快速檢測方法中，檢測時間還較長，檢測靈敏度還比 較低。
2、 這些快速技術都是針對總菌進行檢測的，對某一種或某一類特定菌的檢 測并沒有報道，而在實際應用中，人們所需要測量絕大多數為特定的一種或一 類細菌，如大腸桿菌、致病性大腸桿菌等，因為只有知道了細菌的具體種類， 才有可能采取相應的辦法進行處理。現在，隨著免疫技術的發展，人們也開發 出針對特定菌的快速免疫檢測方法，但是，這類方法都需要兩個抗體，首先是 一個針對某一種或某一類特定菌的檢測抗體，然后是一個用于信號檢測的酶標 抗體，比較復雜。
發明內容
為了解決現有技術中的上述不足，本發明提供了一種檢測精度高、可檢測 特定微生物、檢測靈敏度高的某一種或某一類特定微生物的檢測方法。由于本 發明所提供的方法不需細胞培養，所以也是一種快速的細菌檢測方法。
為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案
一種特定微生物的檢測方法，包括以下步驟
a、 捕捉步驟
選擇對應于特定微生物種類的抗體，通過抗體和特定種類微生物之間的特 異性反應捕捉被測樣本中的特定微生物；
b、 分離步驟
分離捕捉到的特定微生物和被測樣本；
c、 酶釋放步驟
向分離后特定微生物的溶液中加入過氧化氫酶釋放試劑，使得所述特定微 生物中的過氧化氫酶釋放，進入溶液中；
d、 檢測步驟
向上述溶液中添加過氧化氫，并等待；
檢測得到過氧化氫酶的濃度，進而得到所述特定微生物的濃度。 作為優選，在所述步驟b中，利用免疫磁珠或免疫層析方法實現分離。作為優選，在所述步驟d中，通過檢測過氧化氫濃度的變化，從而得到過 氧化氫酶的濃度。
作為優選，利用壓力傳感器或電化學方法來檢測過氧化氫濃度的變化。
本發明的技術構思是利用免疫反應捕捉特定微生物種類，然后分離特定 微生物(一種或一類)和被測樣本；再利用特定微生物自身含有的過氧化氫酶 進行檢測，從而避免了 一般免疫檢測中需要額外的第二抗體進行標記的弊端。 同時，通過對過氧化氫酶催化底物的檢測，充分利用酶的信號放大作用，實施 高靈敏的檢測。
如圖1所示，第一步，通過抗原(特定微生物種類)和抗體(對應于特定 種類微生物)之間的特異性反應，有選擇的捕捉被測樣本中的特定微生物。由 于抗體和抗原間特異性反應的高度選擇性，這樣就保證了能夠按實際要求檢測 特定微生物。
在抗原和抗體間特異性反應發生后，由于實際的被測樣本中總是會含有各 種各樣復雜的成分，而這些不確定的復雜成分可能會對下一步的測量造成干擾， 這也是很多快速檢測方法會得到錯誤信號的原因。為了避免這一問題，本發明 方法的第二步是采用分離方法，將被抗體捕捉到的特定微生物細胞和被測樣本 分離開來，然后加入特定的檢測溶液。這樣，在接下來的分析中，除了被捕捉 到的微生物細胞的數量不知道外，其他所有溶劑和溶液都是預知成分的，這樣 就大大提高了檢測的可靠性。被抗體所捕捉到的微生物細胞和被測樣本的具體 分離方法可以采用免疫磁珠方法、也可以采用層析分離的方法，這些方法都有 相關報道。
第三步，自然界的微生物可大致分為好氧、厭氧和兼氧三大類。而對食品 安全造成危害的絕大多數是好氧和兼氧菌。所有的好氧菌和兼氧性菌在呼吸的 過程中都會產生過氧化氫，而過氧化氫對細胞有毒害作用。因此，好氧菌和兼 氧性菌自身都含有過氧化氫酶以分解呼吸過程中產生的過氧化氫。本發明就是 利用這一事實，將微生物細胞內所含的過氧化氫酶釋放出來，通過檢測過氧化 氫酶的多少，來推知溶液中特定微生物細胞的濃度。因此，向特定微生物溶液 中加入過氧化氫酶釋放試劑，溶液中特定微生物含有的過氧化氫酶釋放出。第四步，向特定微生物溶液中加入一定量的過氧化氫，然后檢測在過氧化 氫酶的催化作用下， 一定時間后過氧化氫濃度的變化情況。過氧化氫濃度的檢 測可以采用電化學檢測方法，也可以采用物理的壓力檢測方法。通過過氧化氫 濃度的變化可得知溶液中過氧化氫酶的濃度，進而得到特定微生物的濃度。
與現有技術相比較，本發明創造性地將免疫反應、分離技術和酶催化反應 技術結合起來，提出了一種簡單、準確的特定微生物的檢測方法，具有諸多有 益效果，如
1、 利用本發明的方法，只需要一種抗體，而不需要免疫檢測中常需的酶標 二抗就可以檢測特定微生物(一種或一類)，簡單方便。通常的檢測特定菌的免 疫方法除了檢測抗體之外，還需要酶標抗體。酶標抗體中的抗體和酶都是生物 物質，生產保存比較復雜。同時，由于這些方法需要兩次抗體/抗原的反應，這 樣就加大了整個反應體系的復雜性，容易引起虛假、錯誤信號。而本發明直接 利用被測細胞內的過氧化氫酶來作為"酶標"。這些過氧化氫酶就是被測細胞本 身所帶有的， 一旦被測細胞被檢測抗體捕捉后就自然存在了，無需第二步的免 疫反應，所以本發明大大簡化了檢測過程，也降低了檢測成本，具有很大的優 勢。
2、 本發明中通過磁珠分離或層析分離，方便地排除掉被測樣本中可能存在 的各種干擾物質的干擾，提高了檢測的精度。在實際樣本，特別是環境樣本的 檢測，樣本內包含有各種不可預知的復雜成分。這些樣本背景成分很有可能會 對免疫檢測帶來干擾信號，這也是免疫檢測所面臨的一大挑戰。本發明中，在 避免了采用酶標抗體的基礎上，進一步提出利用分離方法，特別是磁珠分離技 術和層析分離技術，有選擇性的去除被測樣本的本底干擾信號，實現免疫檢測， 這樣對促進本發明的適用性具有極大的幫助。
3、 本發明利用了特定微生物自身所攜帶的過氧化氫酶，采用過氧化氫為底 物，方便地利用壓力法或電化學方法實現過氧化氫酶濃度的檢測，大大地簡化 了檢測裝置，提高了檢測的靈敏度。過氧化氫是一種重要的化學物質，人們也 已經開發出各種諸如分光光學、化學發光等檢測方法。本發明中結合所發明的
方法在較短時間(<30分鐘)檢測特定種類菌的目的，并考慮到本發明方法有在
6環境、食品等領域中實現現場檢測的巨大潛力，提出了主要采用壓力法或電化 學方法來對過氧化氫濃度進行檢測，從而進一步對過氧化氫酶濃度進行檢測， 這些方法具有方便、快捷優點，能夠實現現場樣本的快速檢測。
圖1是本發明檢測方法的流程示意圖2是實施例1中檢測方法的流程示意圖3是實施例2中檢測方法的流程示意圖。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例，對本發明作進一步詳盡描述。 實施例1:
一種特定微生物的檢測方法，用于檢測食品中的致病性大腸桿菌0157: H7， 如圖2所示，所述方法包括以下步驟-
a、 捕捉步驟
選擇對應于大腸桿菌0157: H7的抗體，并將所述抗體固定在磁珠上； 所述磁珠可以按文獻(如Colloids Surf. A: Physicochem. Eng. Aspects 212(2003)219)上的方法制備，也可以購買商品化的產品。所用的抗體，可以按 標準免疫方法制備，也可以購買商品化產品；抗體在磁珠上的固定也釆用常用 的分子生物固定方法；有一些商品化的產品(如自中國疾病預防控制中心傳染 病預防控制所所提供的商品)已經將大腸桿菌0157: H7抗體固定在磁珠上， 這樣商品就可以直接使用；
取免疫磁珠20微升置于試管中，再加被測液l毫升，不斷搖動防止磁珠沉 淀，同時使被測液與磁珠充分混勻并結合，被測液中的大腸桿菌0157: H7與 所述抗體發生特異性反應，從而捕捉到被測樣本中的大腸桿菌0157: H7;
b、 分離步驟
被測液與磁珠混合作用3-10分鐘后打開管蓋，用磁鐵將磁珠吸于試管底部， 小心吸出懸浮液棄掉，再用pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌磁珠多次，以確保消除被測液殘留物對測量的影響，實現大腸桿菌0157: H7與被測液的分離，同時 也提高了檢測的精度；
c、 酶釋放步驟
向試管中加入pH7.1的磷酸鹽緩沖液，使得最終的溶液體積為1毫升；
向溶液中加入過氧化氫酶釋放試劑，如氯化甲基二乙基苯胺或其他常見的
表面活性劑、殺菌劑，使得過氧化氫酶釋放試劑在溶液中的最終濃度為1%; 大腸桿菌0157: H7內含有的過氧化氫酶釋放出來，進入溶液中；
d、 檢測步驟
向溶液中加入過氧化氫，使得過氧化氫在溶液中的最終濃度為1%; 在確保試管內氣壓和外界大氣壓相同后，用橡皮塞密閉試管，并等待15分
鐘；
用針刺穿橡皮塞，用壓力傳感器測量密閉試管中的氣壓(所用的壓力傳感
器應能檢測1毫米水柱的壓力變化)；根據實際傳感器的性能，可用絕對壓力傳 感器或相對壓力傳感器；
試管中氣壓的變化對應著溶液中過氧化氫濃度的變化(由于過氧化氫在過 氧化氫酶的作用下，分解產生氧氣2/f2<92 = 2i/20 + 02;在一密閉氣室中，新產
生的氧氣將會導致氣壓上升，而且所產生的氧氣的量對應著所消耗的過氧化氫 的量)；而過氧化氫的濃度變化則對應于溶液中過氧化氫酶的濃度；在本檢測條 件下，這些變化最終對應于大腸桿菌0157: H7的濃度，從而達到檢測目的。
實施例2:
一種特定微生物的檢測方法，用于檢測食品中的沙門氏菌，如圖3所示， 所述方法包括以下步驟 a、捕捉步驟
選擇沙門氏菌抗體，并將所述抗體固定在免疫層析材料的檢測帶上； 將所述免疫層析材料的一端置于被測樣本溶液中，被測樣本中的沙門氏菌
與免疫層析材料檢測帶上的抗體發生特異性反應，從而捕捉到樣品中的沙門氏
菌；b、 分離步驟
將層析片上檢測帶部分剪下，確保消除了被測樣本殘留物對測量的影響， 同時也提高了檢測的精度；將檢測帶部分放入1毫升pH7.2的磷酸鹽緩沖液中， 完成了沙門氏菌和被測樣本的分離；
c、 酶釋放步驟
向溶液中加入過氧化氫酶釋放試劑，如氯化甲基二乙基苯胺或其他常見的 表面活性劑、殺菌劑，使得過氧化氫酶釋放試劑在溶液中最終的濃度為1%; 沙門氏菌內含有的過氧化氫酶釋放出來，進入溶液中；
d、 檢測步驟
向溶液中加入過氧化氫，使得其在溶液中的最終濃度為1%; 在確保試管內氣壓和外界大氣壓相同后，將試管用橡皮塞密閉，等待15分
鐘；
過氧化氫在過氧化氫酶的作用下，分解產生氧氣；在一密閉氣室中，新產 生的氧氣將會導致氣壓上升，而且所產生的氧氣的量對應著所消耗的過氧化氫
采用標準電化學三電極安培檢測法，檢測溶液中的過氧化氫濃度；鉑電極上 的所施加的工作電壓為相對于銀/氯化銀參比電極的電壓為0.7伏；由于過氧化 氫為一電化學活性物質，在此外加電壓的鉑工作電極上，過氧化氫將會被氧化 分解
過氧化氫的氧化電流和溶液中過氧化氫的濃度成一定的比例關系，因此通 過電流的測量就可以推知溶液中過氧化氫的濃度；比較反應前后溶液中過氧化 氫濃度的變化，即可推知過氧化氫酶的濃度，進而得到沙門氏菌的濃度，從而 達到檢測的目的。
需要指出的是，上述實施方式不應理解為對本發明保護范圍的限制。本發 明的關鍵是，利用免疫反應捕捉特定微生物，然后分離特定微生物和被測樣本; 向特定微生物溶液中加入過氧化氫，從而檢測得到特定微生物自身含有的過氧 化氫酶，進而得到特定微生物的濃度。在不脫離本發明精神的情況下，對本發明作出的任何形式的改變均應落入本發明的保護范圍之內。
權利要求
1、一種特定微生物的檢測方法，包括以下步驟a、捕捉步驟選擇對應于特定微生物種類的抗體，通過抗體和特定種類微生物之間的特異性反應捕捉被測樣本中的特定微生物；b、分離步驟分離捕捉到的特定微生物和被測樣本；c、酶釋放步驟向分離后特定微生物的溶液中加入過氧化氫酶釋放試劑，使得所述特定微生物中的過氧化氫酶釋放，進入溶液中；d、檢測步驟向上述溶液中添加過氧化氫，并等待；檢測得到過氧化氫酶的濃度，進而得到所述特定微生物的濃度。
2、 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于在所述步驟b中，利用 免疫磁珠或免疫層析方法實現分離。
3、 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于在所述步驟d中，通過 檢測過氧化氫濃度的變化，從而得到過氧化氫酶的濃度。
4、 根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于利用壓力傳感器或電化 學方法來檢測過氧化氫濃度的變化。
全文摘要
本發明公開了一種特定微生物的檢測方法，包括以下步驟a.捕捉步驟，選擇對應于特定微生物種類的抗體，通過抗體和特定種類微生物之間的特異性反應捕捉被測樣本中的特定微生物；b.分離步驟，分離捕捉到的特定微生物和被測樣本；c.酶釋放步驟，向分離后特定微生物的溶液中加入過氧化氫酶釋放試劑，使得所述特定微生物中的過氧化氫酶釋放，進入溶液中；d.檢測步驟，向上述溶液中添加過氧化氫，并等待；檢測得到過氧化氫酶的濃度，進而得到所述特定微生物的濃度。本發明具有檢測精度高、檢測靈敏度高、可檢測特定微生物等優點，可廣泛應用在食品安全檢測中。
文檔編號G01N7/18GK101446538SQ20081016393
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月26日 優先權日2008年12月26日
發明者堅 吳 申請人:聚光科技(杭州)有限公司