用葉表皮細(xì)胞死亡率鑒定楊樹耐鹽潛力的方法

            文檔序號(hào):5841058閱讀:321來源:國知局
            專利名稱:用葉表皮細(xì)胞死亡率鑒定楊樹耐鹽潛力的方法
            技術(shù)領(lǐng)域
            本發(fā)明屬于生物技術(shù)的植物檢測(cè),是一種葉表皮細(xì)胞死亡率鑒定楊樹耐鹽潛力的方法。
            背景技術(shù)
            隨著世界人口的增長和人們生活水平的提高,土地和淡水資源越來越匱乏,土地鹽堿化成為日益嚴(yán)重的環(huán)境問題之一。開發(fā)利用廣大的中重度鹽堿地,既可以阻止土壤鹽漬化的進(jìn)一步加劇,又能擴(kuò)大農(nóng)田的種植面積,解決人口增多與耕地減少的矛盾。楊樹在缺林少木的鹽堿、干旱、貧瘠和荒漠地區(qū)栽植,可迅速恢復(fù)植被,減少風(fēng)沙危害、降低地下水位、保護(hù)農(nóng)田、減少地表蒸發(fā),增加森林覆蓋率,也為紙漿用材林建設(shè)和工業(yè)商品林建設(shè)提供足夠的原材料。楊樹是楊柳科楊屬植物落葉喬木的通稱。全屬有100多種,它可以分為大葉楊、白楊、青楊、黑楊、胡楊等5類。楊樹是地球上分布很廣的一種樹種,歐、亞、北美洲都有它的足跡,中國有50多種。楊樹又是用材林、防護(hù)林和四旁綠化的主要樹種。楊樹是通過分子雜交技術(shù)和耐鹽突變體篩選,獲得了不同耐鹽性的楊樹新品種。但各種基因之間不斷地進(jìn)行重組和分離,如何準(zhǔn)確地鑒別和篩選耐鹽的優(yōu)良基因型,成為科學(xué)家苦苦探索的關(guān)鍵技術(shù)。 楊樹的評(píng)價(jià)主要是在大田條件下對(duì)生物學(xué)特征、形態(tài)特征、抗性、適應(yīng)性等指標(biāo)進(jìn)
            行評(píng)價(jià),現(xiàn)在不但注重楊樹資源的生產(chǎn)力、適應(yīng)能力,而且更加關(guān)注資源的分子遺傳多樣
            性、木材品質(zhì)和抗性等遺傳能力。楊樹的耐鹽堿篩選鑒定主要是比較其存活率、相對(duì)生長
            量、鮮干重比和脯氨酸含量等等的生物學(xué)鑒定、分子鑒定和直接鹽堿地篩選鑒定。但是楊樹
            生長期長,評(píng)價(jià)生長形狀、物候性狀、生長期等需要的時(shí)間較長,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,分子鑒定成本較
            高,耗費(fèi)人力物力,選擇一個(gè)優(yōu)良基因型需要較長時(shí)間,而且受環(huán)境因素的影響。 在高滲環(huán)境中,植物細(xì)胞由于液泡失水而使原生質(zhì)層與細(xì)胞壁分離的現(xiàn)象,叫做
            質(zhì)壁分離。質(zhì)壁分離是植物生活細(xì)胞所具有的一種特性。可以用來區(qū)別細(xì)胞的死活;也可
            用來測(cè)定細(xì)胞液的滲透壓,以及原生質(zhì)的透性、彈性、粘滯性等。造成質(zhì)壁分離的原因是細(xì)
            胞壁是全透性的膜,而質(zhì)膜和液泡膜均是選擇透過性的膜,當(dāng)外界溶液的濃度比細(xì)胞液的
            濃度高時(shí),細(xì)胞液的水分就會(huì)向外滲出,液泡的體積縮小,由于細(xì)胞壁的伸縮性有限,而原
            生質(zhì)的伸縮性較大,所以在細(xì)胞壁停止收縮后,原生質(zhì)繼續(xù)在收縮,這樣原生質(zhì)層與細(xì)胞壁
            就逐漸分開,原生質(zhì)層與細(xì)胞壁之間的空隙里就充滿了外界濃度較高的溶液。如果把發(fā)生
            了質(zhì)壁分離現(xiàn)象的細(xì)胞再浸入濃度很低的溶液或清水中,外面的水就進(jìn)入細(xì)胞,液泡變大,
            整個(gè)原生質(zhì)層又慢慢恢復(fù)到原來的狀態(tài),這種現(xiàn)象叫做質(zhì)壁分離的復(fù)原。對(duì)楊樹而言,鹽脅
            迫首先是通過滲透勢(shì)的改變引起細(xì)胞內(nèi)容物的外流,從理論上講也會(huì)出現(xiàn)質(zhì)壁分離。在相
            同的鹽脅迫環(huán)境中,耐鹽基因型的質(zhì)壁分離情況和不耐鹽的基因型應(yīng)該有明顯的區(qū)別。

            發(fā)明內(nèi)容
            本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種葉表皮細(xì)胞死亡率鑒定楊樹耐鹽潛力的方法。只需20-30分鐘就能準(zhǔn)確判斷基因型的耐鹽潛力,省工省時(shí),工作效率極高。
            本發(fā)明的技術(shù)方案是 —種用葉表皮細(xì)胞死亡率鑒定楊樹耐鹽潛力的方法,其特征在于
            1)耐鹽能力不同的楊樹基因型,其葉表皮細(xì)胞在鹽溶液中的死亡率有很大的差 異;在高鹽溶液中處理一定的時(shí)間,葉表皮細(xì)胞的死亡率,能快速準(zhǔn)確地反映基因型的耐鹽 能力;細(xì)胞死亡率高的耐鹽能力低,細(xì)胞死亡率低的耐鹽能力高; 2)以對(duì)植物無毒的活體染料中性紅為指示劑,在微堿性環(huán)境中對(duì)楊樹植株的葉表 皮細(xì)胞進(jìn)行染色,活細(xì)胞的液泡被染成櫻桃紅色,原生質(zhì)和細(xì)胞壁一般不著色;死細(xì)胞由于 原生質(zhì)變性凝固,胞液不能維持在液泡內(nèi),用中性紅染色后,不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象。
            選擇化學(xué)純的NaCl,溶液濃度一般以4M為宜,處理時(shí)間10_15分鐘;楊樹葉表皮 細(xì)胞對(duì)鹽脅迫的靈敏度在基因型間有明顯差異 以對(duì)細(xì)胞無害的0. 03%活體染料中性紅為指示劑,對(duì)在鹽溶液中處理一定時(shí)間楊 樹的葉表皮細(xì)胞染色8-10分鐘,活細(xì)胞呈櫻桃紅色,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞死亡率,從而判斷耐鹽能力 不同的楊樹基因型。 染色時(shí)間10分鐘;葉表皮厚度應(yīng)均勻一致。
            本發(fā)明效果是 利用葉表皮細(xì)胞死亡率鑒定技術(shù),只需20-30分鐘就能準(zhǔn)確判斷基因型的耐鹽潛 力,省工省時(shí),工作效率極高,具有非常廣闊的應(yīng)用前景。對(duì)其他植物耐鹽潛力的快速鑒定 具有重要參考價(jià)值。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)1.該技術(shù)體系以植物細(xì)胞的質(zhì)壁分離現(xiàn) 象和中性紅染料的著色原理為依據(jù),只需少量的楊樹葉片表皮細(xì)胞,就能迅速地鑒定出植 株的耐鹽能力,具有效率高、重復(fù)性好、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)。2.根據(jù)葉表皮細(xì)胞死亡率試驗(yàn)淘 汰大量不耐鹽的基因型,可以有效地壓縮田間試驗(yàn)的規(guī)模,節(jié)約時(shí)間和人力,大幅度提高優(yōu) 良耐鹽基因型的篩選效率,加速耐鹽植物育種的步伐。


            圖1. 1107楊葉表皮細(xì)胞經(jīng)2. 0M NaCL處理后葉表皮細(xì)胞染色 圖1. 2中天楊葉表皮細(xì)胞經(jīng)2. 0M NaCL處理后葉表皮細(xì)胞染色 圖2. 1107楊葉表皮細(xì)胞經(jīng)4. 0M NaCL處理后葉表皮細(xì)胞染色 圖2. 2中天楊葉表皮細(xì)胞經(jīng)4. 0M NaCL處理后葉表皮細(xì)胞染色 葉表皮細(xì)胞死亡率試驗(yàn)的結(jié)果表明,在4M NaCl溶液中放置10-15分鐘,耐鹽品種
            中天楊的葉表皮細(xì)胞的死亡率,比普通品種107的葉表皮細(xì)胞死亡率低很多。107楊表皮細(xì)
            胞大部分喪失活力,細(xì)胞死亡率在95%以上。說明楊樹植株的耐鹽能力和葉表皮細(xì)胞的耐
            鹽能力高度相關(guān),用4M NaCl溶液進(jìn)行處理,通過統(tǒng)計(jì)葉表皮細(xì)胞死亡率,能快速、準(zhǔn)確地篩
            選出耐高于0. 6% NaCl的楊樹植株。
            具體實(shí)施例方式
            針對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)鑒定植物耐鹽潛力所需時(shí)間長、所需材料多、工作效率低的問題,發(fā) 明人進(jìn)行了大量的研究工作,最終建立了利用葉表皮細(xì)胞死亡率技術(shù)快速鑒定楊樹耐鹽潛 力的新方法。以葉表皮死亡的細(xì)胞在被觀察細(xì)胞中所占的比率為依據(jù),可以快速、準(zhǔn)確地確定不同基因型的耐鹽潛力,從而篩選耐鹽潛力高的優(yōu)良基因型,在短時(shí)間內(nèi)淘汰大量的無用材料,進(jìn)而選育出耐鹽的優(yōu)良楊樹新品種。 本發(fā)明旨在提供一種科學(xué)高效的耐鹽快速鑒定方法,通過該方法淘汰大量不耐鹽的基因型,實(shí)現(xiàn)耐鹽基因和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)基因的結(jié)合,加速耐鹽楊樹新品種的選育。
            本發(fā)明的目的通過如下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)
            楊樹葉片表皮細(xì)胞染色技術(shù)的研究 中性紅是對(duì)植物無害的常用活體染料之一,用其染色不會(huì)影響細(xì)胞的生命活動(dòng)以直引起細(xì)胞死亡,它是一種弱堿性PH指示劑,變色范圍在p朋.4 8. 0之間(由紅變黃)。它在酸性及中性范圍內(nèi)解離度很強(qiáng),帶色的陽離子呈櫻桃紅色,在pH7以上時(shí),它不解離而以分子態(tài)溶解于水,呈黃色的溶液。當(dāng)介質(zhì)呈微堿性時(shí),中性紅分子的解離作用很弱,主要以分子狀態(tài)存在,不易被細(xì)胞壁吸附,但較易透過質(zhì)膜和液泡膜進(jìn)入液泡。由于液泡內(nèi)溶液呈酸性,因此中性紅在液泡中發(fā)生解離,將液泡染成紅色,此時(shí)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁不顯色。死細(xì)胞由于原生質(zhì)變性凝固,胞液不能維持在液泡內(nèi),用中性紅染色后,不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象。 把楊樹葉表皮放入0. 03%中性紅染色液8-10分鐘,細(xì)胞染成櫻桃紅色全為活細(xì)胞,死細(xì)胞能觀察到玻璃膠狀的細(xì)胞質(zhì);楊樹葉表皮經(jīng)過一定的鹽溶液處理后放在中性紅染色8-10分鐘,部分細(xì)胞成分紅色,為活細(xì)胞,其余為死細(xì)胞。隨著鹽濃度的提高或鹽溶液浸泡時(shí)間的延長,不同的基因型楊樹表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離程度不同,質(zhì)壁分離引起的死亡率也不同。當(dāng)鹽濃度過高或在鹽溶液中浸泡時(shí)間過長時(shí),細(xì)胞膜破損,細(xì)胞內(nèi)外成一體,染色淺,觀察不到紅色球團(tuán)。 楊樹葉表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離臨界鹽濃度的確定 把從葉片上剝離下來的葉表皮放在0. 5M、1. 0M、2. 0M和4. OM的NaCl溶液中處理10-15分鐘,O. 03%中性紅溶液中染色I(xiàn)O分鐘,然后把染色后的表皮放在在15X10倍的光學(xué)顯微鏡下觀察。0. 5M NaCl溶液處理的表皮細(xì)胞質(zhì)壁分離程度較輕;鹽濃度越高,相同處理時(shí)間內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)壁分離程度越嚴(yán)重。2. OM和4. OM NaCl溶液處理的表皮細(xì)胞出現(xiàn)大量的死亡,死亡細(xì)胞因膜喪失選擇透性而無法被中性紅染色,耐鹽品種的表皮細(xì)胞死亡率明顯較低(圖1,2) 。 4M NaCl處理時(shí),107楊比中天楊細(xì)胞死亡率明顯增加,而且對(duì)時(shí)間長短的靈敏性較低,可重復(fù)性較好。因此,我們把4M作為NaCl脅迫的臨界鹽濃度。
            葉表皮細(xì)胞死亡率與耐鹽性的相關(guān)性研究 葉表皮細(xì)胞死亡率試驗(yàn)的結(jié)果表明,在4. OM NaCl溶液中放置10-15分鐘,耐鹽品種中天楊的葉表皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象,鹽脅迫引起的細(xì)胞死亡率在75%以內(nèi);楊樹107的葉表皮細(xì)胞大部分喪失活力,細(xì)胞死亡率在95%以上。說明楊樹植株的耐鹽能力和葉表皮細(xì)胞的耐鹽能力高度相關(guān),用4. 0M NaCl溶液進(jìn)行葉表皮細(xì)胞死亡率試驗(yàn),能快速、準(zhǔn)確地篩選出耐0. 6%以上NaCl溶液的楊樹植株。 施例1從中科院弓l進(jìn)的中天楊PoulusXxiaozhuanica 'zhongtian,禾口 107號(hào)楊"populus Xeuranericana cL , 74/76",。 中天楊是由中國科學(xué)院、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東金水木抗逆植物研究院在重大科技攻關(guān)項(xiàng)目支持下,采用生物轉(zhuǎn)基因技術(shù),歷經(jīng)8年時(shí)間培育成功的抗鹽堿、耐干旱楊樹新品種。目前"中天楊"已獲得國家專利和植物新品種保護(hù)權(quán),國家林業(yè)局也將其列為鹽堿干旱地區(qū)優(yōu)良品種和重點(diǎn)推廣新品種。 歐美楊107起源于意大利,是卡薩歹"蒙費(fèi)拉托楊樹栽培研究所SekaWain博士于 1973年進(jìn)行人工控制雜交選育出來的。107號(hào)是中國林科院承擔(dān)的國家〃 七五〃 科技成 果〃 國外楊樹引種及區(qū)域化試驗(yàn)〃 中重點(diǎn)推出的新品種,又名〃 美麗天使〃 楊。該項(xiàng)目曾 獲得1991年能源部科技進(jìn)步三等獎(jiǎng),1993年林業(yè)部科技進(jìn)步二等獎(jiǎng),1996年國家科技進(jìn)步 三等獎(jiǎng)殊榮。經(jīng)近十年的苗期、無性系對(duì)比林測(cè)試和區(qū)域化試驗(yàn),歐美楊107號(hào)表現(xiàn)良好, 適合我國黃河流域、淮河流域及遼河以南流域廣泛栽植,成為我國北方包括西北地區(qū)防護(hù) 林帶、用材林的主要造林樹種之一。 取中天楊和107楊相同大小枝條,在不同海鹽條件下水培,通過生長表現(xiàn)和根系 發(fā)育狀況進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)研究,中天楊能在0. 6%海鹽條件下,107楊在0. 4%條件下能正 常生長。 首先從中天楊和107楊的葉片上輕輕剝下表皮細(xì)胞,放在4. OMNaCl溶液中處理10 分鐘,然后轉(zhuǎn)移到0. 03%的中性紅溶液中處理10分鐘。在15X 10倍的光學(xué)顯微鏡下,觀察 到中天楊的表皮細(xì)胞中,一部分呈現(xiàn)出粉紅色的活細(xì)胞,而107的表皮細(xì)胞中,只有極少數(shù) 個(gè)別粉紅色活細(xì)胞。說明4. OM的NaCl溶液能夠把耐鹽基因型鑒別出來。
            權(quán)利要求
            一種用葉表皮細(xì)胞死亡率鑒定楊樹耐鹽潛力的方法,其特征在于1)耐鹽能力不同的楊樹基因型,其葉表皮細(xì)胞在鹽溶液中的死亡率有很大的差異;在高鹽溶液中處理一定的時(shí)間,葉表皮細(xì)胞的死亡率,能快速準(zhǔn)確地反映基因型的耐鹽能力;細(xì)胞死亡率高的耐鹽能力低,細(xì)胞死亡率低的耐鹽能力高;2)以對(duì)植物無毒的活體染料中性紅為指示劑,在微堿性環(huán)境中對(duì)楊樹植株的葉表皮細(xì)胞進(jìn)行染色,活細(xì)胞的液泡被染成櫻桃紅色,原生質(zhì)和細(xì)胞壁一般不著色;死細(xì)胞由于原生質(zhì)變性凝固,胞液不能維持在液泡內(nèi),用中性紅染色后,不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象。
            2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用葉表皮細(xì)胞死亡率快速鑒定楊樹耐鹽植株方法,其特征在于選擇化學(xué)純的NaCl,溶液濃度一般以4M為宜,處理時(shí)間10-15分鐘;楊樹葉表皮細(xì)胞對(duì)鹽脅迫的靈敏度在基因型間有明顯差異;以對(duì)細(xì)胞無害的0. 03%活體染料中性紅為指示劑,對(duì)在鹽溶液中處理一定時(shí)間楊樹的葉表皮細(xì)胞染色8-10分鐘,活細(xì)胞呈櫻桃紅色,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞死亡率,從而判斷耐鹽能力不同的楊樹基因型。
            3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用葉表皮細(xì)胞死亡率快速鑒定楊樹耐鹽植株方法,其特征在于染色時(shí)間10分鐘;葉表皮厚度應(yīng)均勻一致。
            全文摘要
            一種用葉表皮細(xì)胞死亡率鑒定楊樹耐鹽潛力的方法。楊樹的葉表皮細(xì)胞在高鹽環(huán)境中,發(fā)生質(zhì)壁分離,不同耐鹽能力的細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離的程度不同,質(zhì)壁分離程度大的不能恢復(fù),即死亡;以染料中性紅為指示劑,對(duì)楊樹的葉表皮細(xì)胞進(jìn)行染色,活細(xì)胞、死細(xì)胞的著色不同,從而判斷耐鹽能力不同的楊樹基因型。在高鹽溶液中處理一定的時(shí)間,葉表皮細(xì)胞的死亡率,能快速準(zhǔn)確地反映基因型的耐鹽能力。利用葉表皮細(xì)胞的死亡率鑒定技術(shù),只需20-30分鐘就能準(zhǔn)確判斷基因型的耐鹽潛力,省工省時(shí),工作效率極高,具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
            文檔編號(hào)G01N21/25GK101726576SQ20081015247
            公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
            發(fā)明者劉仲齊, 周祥明, 宋建, 張?jiān)? 王珠, 聶莉莉, 薛俊, 郟艷紅, 郝志愚, 金鳳媚 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心
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