專利名稱:蛋白質結晶條件的篩選方法
技術領域:
本發明涉及一種蛋白質結晶條件的篩選方法,特別是通過溫度掃描對蛋白質結晶條件進 行篩選的方法。
背景技術:
結構生物學是分子生物學的前沿和主流,對蛋白質結構與功能的研究已經成為揭示基因 組功能的重要途徑。獲取高質量及合適尺寸的蛋白質晶體是完成結構解析的瓶頸,而結晶條 件的篩選是獲得高質量蛋白質晶體的第一步,也是最關鍵的一步。
影響蛋白質結晶條件篩選的因素是多方面的,其中溫度可通過改變蛋白質的溶解性,進 而影響蛋白質在溶液中的過飽和度,而成為影響蛋白質結晶的一個重要因素。但一直以來, 人們很少在實踐中運用此特點開發蛋白質結晶條件篩選技術。
通常的蛋白質結晶條件篩選是在某個特定溫度下進行的。文獻"Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. 1991, Vol. 24: 409-41 l"公開了 一種蛋白質結晶條 件的篩選方法,選擇Hampton公司貨號為HR2-110的Crystal Screen試劑盒構建結晶溶液體 系。蛋白質晶體在恒溫4'C和室溫下生長,統計蛋白質在50種結晶緩沖液中出現晶體的成功 率。實驗結果得出溶菌酶結晶成功率為10%,胰島素結晶成功率為4%,過氧化氫酶結晶成 功率為10%,核糖核酸酶A結晶成功率為8。/。,胃蛋白酶結晶成功率為6%。由于對不同蛋白 質而言,最適合結晶的溫度可能有所不同,因此在某個特定的溫度下進行篩選時,適宜在其 它溫度條件下結晶的緩沖液就不能產生晶體。如此將使這部分實際可以出現晶體的溶液條件 被標記為不能結晶的溶液,從而降低篩選的成功率。為了提高蛋白質結晶條件篩選的成功率, 應盡可能在所有可能結晶的溫度條件下進行篩選。但這樣的篩選策略在實踐中由于工作量及 樣品消耗量極大,實現困難。
發明內容
為了克服現有蛋白質結晶條件篩選技術中,因篩選溫度覆蓋不全而導致不能發現全部結 晶條件的不足,本發明提供了一種新的蛋白質結晶條件的篩選方法。該方法通過溫度掃描, 可覆蓋篩選過程中可能結晶的每一個溫度點,以此提高蛋白質結晶篩選的成功率。
本發明解決其技術問題的技術方案是, 一種蛋白質結晶條件的篩選方法,其特征在于包
括以下步驟
(a)用緩沖液溶解蛋白質,使蛋白質的終濃度達到5 50mg/ml,用0.22 pm的濾膜過濾 除去雜質;(b) 用不同的結晶緩沖液來篩選蛋白質的結晶條件;
(c) 蛋白質晶體的形核和生長,在密閉的可設定變溫程序的控溫箱中進行,預先設定該 密閉環境的溫度,控溫箱從1 4-C開始線性升溫,8 336小時后升溫至30 60°C,然后從 30 60'C線性降溫,8 336小時后降至1 4°C,完成一個循環周期;或者設定控溫箱從30 60'C線性降溫,8 336小時后降至1 4°C,再從1 4'C開始線性升溫,8 336小時后升溫 至30 60'C,完成一個循環周期;
(d) 上述結晶體系在密閉溫控箱中完成一個溫度循環周期后取出,在顯微鏡下統計出蛋 白質晶體的條件數目。
本發明的有益效果是由于采用了溫度掃描方式,可以通過一次實驗覆蓋適宜于蛋白質 結晶的所有可能溫度,而不用在所有可能結晶的溫度點下一一建立實驗組進行篩選,從而提 高實驗效率,并節約結晶緩沖液和蛋白質樣品。通過本發明,可使蛋白質結晶條件篩選成功 率由過去的4 10%提高至14 50%。
下面結合實施例對本發明作詳細說明。
具體實施例方式
實施例l:溶菌酶結晶條件的篩選。
第一步將經過六次重結晶的日本Seikagaku公司的貨號為100940的溶菌酶,溶于pH 為4.60, 0.1 mol/L的醋酸鈉緩沖液中,使其終濃度為20 mg/ml,用0.22 pm的濾膜濾去雜質。
第二步本實施例用Hampton公司貨號為HR2-110的Crystal Screen試劑盒的50種結晶 緩沖液對溶菌酶結晶條件進行篩選。
第三步將整個結晶體系放置于可進行程序溫度控制的溫控箱中,其溫控熱源為可編程 的高低溫循環水浴,型號為PolyScience 9712AA2Y。具體溫控程序為從rC線性升溫168
小時至60°c,然后再以同樣變溫速率從6(Tc降溫至rc,即一個溫控周期為 ix^^6ot:,^i"c。或者從60t:線性降溫i68小時至it:,然后再以同樣變溫速率從i°c
線性升溫至60°C。
第四步樣品在溫控箱中放置一個溫度循環周期后,在顯微鏡下觀察統計出溶菌酶晶體 的條件數目,并計算結晶篩選的成功率。
經過統計得到如下結果有21種結晶條件出現了溶菌酶晶體,結晶成功率為42%。與現 有技術在4'C和室溫篩選結晶條件的結果相比,成功率提高了 4.2倍。
實施例2:胰島素結晶條件的篩選。
第一步將美國Sigma公司貨號為15500的胰島素,溶于1 mol/L的氨水中,使其終濃度 為30 mg/ml,用0.22 pm的濾膜濾去雜質。第二步本實施例用Hampton公司貨號為HR2-110的Crystal Screen試劑盒的50種結晶
緩沖液對胰島素的結晶條件進行篩選。
第三步將整個結晶體系放置于可進行程序溫度控制的溫控箱中,其溫控熱源為可編程 的高低溫循環水浴,型號為PolyScience 9712AA2Y。具體溫控程序為從2'C線性升溫24小 時至35°C,然后再以同樣變溫速率從35'C降溫至2°C,即一個溫控周期為 2'c"^^35'c2"^"l2"C。或者從35-C線性降溫24小時至2'C,再以同樣變溫速率從2'C線性 升溫至35'C。
第四步樣品在溫控箱中放置一個溫度循環周期后,在顯微鏡下觀察統計出胰島素晶體 的條件數目,并計算結晶篩選的成功率。
經過統計得到如下結果有25種結晶條件出現了胰島素酶晶體,結晶成功率為50%。與 現有技術在4'C和室溫篩選結晶條件的結果相比,成功率提高了 12.5倍。
實施例3:過氧化氫酶結晶條件的篩選。
第一步將美國Sigma公司貨號為C0615的過氧化氫酶,溶于pH為7.00, 0.025 mol/L HEPES-Na緩沖液中,使其終濃度為40 mg/ml,用0.22 pm的濾膜濾去雜質。
第二步本實施例用Hampton公司貨號為HR2-110的Crystal Screen試劑盒的50種結晶 緩沖液對過氧化氫酶的結晶條件進行篩選。
第三步將整個結晶體系放置于可進行程序溫度控制的溫控箱中,其溫控熱源為可編程 的高低溫循環水浴,型號為PolyScience 9712AA2Y。具體溫控程序為從4"C線性升溫8小 時至30'C,然后再以同樣變溫速率從3(TC降溫至4'C。或者從3(TC線性降溫8小時至4"C, 然后再以同樣變溫速率從4'C線性升溫至30°C 。
第四步樣品在溫控箱中放置一個溫度循環周期后,在顯微鏡下觀察統計出過氧化氫酶 晶體的條件數目,并計算結晶篩選的成功率。
經過統計得到如下結果有13種結晶條件出現了過氧化氫酶晶體,結晶成功率為26%。 與現有技術在4。C和室溫篩選結晶條件的結果相比,成功率提高了 2.6倍。
實施例4:核糖核酸酶A結晶條件的篩選。
第一步將美國Sigma公司貨號為R5500的核糖核酸酶A,溶于pH為7.00, 0.025 mol/L HEPES-Na緩沖液中,使其終濃度為5 mg/ml,用0.22 ^un的濾膜濾去雜質。
第二步本實施例用Hampton公司貨號為HR2-110的Crystal Screen試劑盒的50種結晶 緩沖液對核糖核酸酶A的結晶條件進行篩選。
第三步將整個結晶體系放置于可進行程序溫度控制的溫控箱中,其溫控熱源為可編程 的高低溫循環水浴,型號為PolyScience 9712AA2Y。具體溫控程序為從4'C線性升溫72小時至50。C,然后再以同樣變溫速率從5(TC降溫至4'C。或者從50'C線性降溫72小時至4'C, 然后再以同樣變溫速率從4'C線性升溫至50'C。
第四步樣品在溫控箱中放置一個溫度循環周期后,在顯微鏡下觀察統計出核糖核酸酶 A晶體的條件數目,并計算結晶篩選的成功率。
經過統計得到如下結果有6種結晶條件出現了核糖核酸酶A晶體,結晶成功率為12%。 與現有技術在4'C和室溫篩選結晶條件的結果相比,成功率提高了 1.5倍。
實施例5:胃蛋白酶結晶條件的篩選。
第一步將美國Sigma公司貨號為R5500的胃蛋白酶,溶于pH為7.00, 0.025 mol/L HEPES-Na緩沖液中,使其終濃度為50mg/ml,用0.22 pm的濾膜濾去雜質。
第二步本實施例用Hampton公司貨號為HR2-110的Crystal Screen試劑盒的50種結晶 緩沖液對胃蛋白酶的結晶條件進行篩選。
第三步將整個結晶體系放置于可進行程序溫度控制的溫控箱中,其溫控熱源為可編程 的高低溫循環水浴,型號為PolyScience 9712AA2Y。具體溫控程序為從4'C線性升溫336 小時至60'C,然后再以同樣變溫速率從6(TC降溫至4'C。或者從6(rC線性降溫336小時至4'C, 然后再以同樣變溫速率從4°C線性升溫至60°C 。
第四步樣品在溫控箱中放置一個溫度循環周期后,在顯微鏡下觀察統計出胃蛋白酶晶 體的條件數目,并計算結晶篩選的成功率。
經過統計得到如下結果有7種結晶條件出現了胃蛋白酶晶體,結晶成功率為14%。與 現有技術在4'C和室溫篩選結晶條件的結果相比,成功率提高了 2.33倍。
除上述的實施例外,用本方法還通過變溫方式分別對胰凝乳蛋白酶、伴刀豆球蛋白、蛋 白酶K和枯草桿菌蛋白酶的結晶條件進行了篩選,結果這些蛋白的結晶篩選成功率均得到了 明顯的提高。
權利要求
1、一種蛋白質結晶條件的篩選方法,其特征在于包括下述步驟(a)用緩沖液溶解蛋白質,使蛋白質的終濃度達到5~50mg/ml,用0.22μm的濾膜過濾除去雜質;(b)用不同的結晶緩沖液來篩選蛋白質的結晶條件;(c)蛋白質晶體的形核和生長,在密閉的可設定變溫程序的控溫箱中進行,預先設定該密閉環境的溫度,控溫箱從1~4℃開始線性升溫,8~336小時后升溫至30~60℃,然后從30~60℃線性降溫,8~336小時后降至1~4℃,完成一個循環周期;或者設定控溫箱從30~60℃線性降溫,8~336小時后降至1~4℃,再從1~4℃開始線性升溫,8~336小時后升溫至30~60℃,完成一個循環周期;(d)上述結晶體系在密閉溫控箱中完成一個溫度循環周期后取出,在顯微鏡下統計出蛋白質晶體的條件數目。
全文摘要
本發明公開了一種蛋白質結晶條件的篩選方法,首先用不同的緩沖液中溶解蛋白質,使蛋白質的終濃度達到5~50mg/ml,用0.22μm的濾膜過濾出去雜質;用不同的結晶緩沖液來篩選蛋白質的結晶條件;在密閉的可設定變溫程序的控溫箱中生長蛋白質,控溫箱從1~4℃開始線性升溫,8~336小時后升溫至30~60℃,然后從30~60℃線性降溫,8~336小時后降至1~4℃,完成一個循環周期;或者以前述方式線性降溫—線性升溫—線性降溫,完成一個循環周期;一個溫度循環周期后取出,在顯微鏡下統計出蛋白質晶體的條件數目。由于采用了溫度掃描方式,蛋白質結晶條件篩選成功率由現有技術的4~10%提高至14~50%。
文檔編號G01N25/14GK101320006SQ200810150369
公開日2008年12月10日 申請日期2008年7月17日 優先權日2008年7月17日
發明者盧慧甍, 葉雅靜, 尹大川, 張辰艷, 李海生, 王璽凱, 郭云珠, 郭衛紅, 鹿芹芹 申請人:西北工業大學