專利名稱：：一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性e2抗原的方法
技術領域：
：本發明涉及作為抗原的E2蛋白的制備方法，具體說是一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原蛋白的方法。
背景技術：
：豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的是嚴重威脅養豬業，具有重要經濟意義的烈性病毒性疾病之一，被國際獸疫局(OIE)列為A類15種傳染病之一，在我國也被列為一類傳染病，可導致各生長階段豬的死亡，給養豬業造成了巨大經濟損失。CSFV是有囊膜的RNA病毒，基因組長約12.3kb，含一個大的開放式閱讀框架(ORF)，翻譯成一條約含3898個氨基酸殘基的多聚前體蛋白，其中C、Erns、El、E2為結構蛋白。豬瘟病毒E2蛋白作為病毒粒子囊膜上的主要結構糖蛋白之一，是抗豬瘟中和抗體主要誘發者，是豬瘟病毒的主要保護性抗原。近年來，證實了E2分子存在4個獨特的抗原結構域A、B、C、D，位于E2N末端的690位866位氨基酸處。A區位于766位866位氨基酸處，A區又分為三個功能區A1、A2和A3，Al、A2亞區相連，位于A區C端的795位851位之間，是E2蛋白的中心部位，為一段保守區，Al亞區能誘導產生中和抗體；A3亞區靠近B、C區，位于766813位之間，無保守性，也不誘導產生中和抗體；B區位于690773位之間，C區位于690位800位之間，兩者均為非保守區，是誘導產生中和抗體的主要部位；D區位于766800位之間，既不保守也不誘導產生中和抗體。功能上，Al亞區、B區與C區與CSFV的中和過程有關，是中和性抗原域，A2、A3亞區、D區不參與病毒的中和，是非中和抗原域。由于大腸桿菌表達的外源性蛋白常以無活性的包涵體的形式存在，需要通過變性、復性等過程才能部分恢復重組蛋白的生物學活性，更重要的是這個過程根本不可能使重組蛋白達到與天然蛋白相一致的生物學功能。這就嚴重限制了重組蛋白在科學研究中的應用。
發明內容本發明所要解決的技術問題是利用帶有GST標記原核表達載體，通過改善誘導表達條件獲得可溶性的重組E2蛋白，純化后的E2蛋白作為抗原建立檢測豬瘟病毒血清抗體間接ELISA方法，而提供一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法。本發明的技術問題通過下述技術方案解決一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法，包括下述步驟1、一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法，其特征在于，包括下述步驟A.克隆E2基因抗原結構域部分A.1、設計1對特異性寡核苷酸引物uE和dE;A.2、提取總RNA，從豬瘟兔化弱毒疫苗中提取核糖核酸-RNA;A.3、反轉錄合成cDNA，以提取的核糖核酸RNA為模板，反轉錄合成cDNA;A.4、PCR擴增E2基因，用所述的1對特異性寡核苷酸引物，進行聚合酶鏈式擴增反應擴增；B.構建重組表達載體；C.在改良的LB培養基中表達，獲得可溶性的重組E2蛋白；D.親和層析純化重組E2蛋白；E.pGST-E2表達蛋白的鑒定，十二垸基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE和免疫印跡法WesternBlotting鑒定表達的重組E2蛋白；F.利用重組E2蛋白建立檢測豬瘟血清抗體間接ELISA方法。上述步驟C所述改良的LB培養基成分中含有蛋白胨0.8%;氯化鈉0.9%;酵母提取物0.6%，葡萄糖0.l%g加無離子水，調pH=7.4所述步驟C在改良的LB培養基中表達E2蛋白的誘導溫度為20-14°C，誘導時間12-20小時，誘導劑IPTG濃度為0.10腿ol/ml。所述步驟C在改良的LB培養基中表達E2蛋白的誘導溫度為16°C，誘導時間16小時。血清學檢測CSFV抗體是豬抗體水平監測的主要手段，也是診斷豬瘟的重要工具。豬瘟病毒E2基因抗原結構域編碼的蛋白與完整的CSF粒子相比，具有無感染性、易于大量生產和純化等明顯的優勢。而改善誘導表達條件獲得的可溶性的E2蛋白，親和層析純化后的E2抗原可與豬瘟陽性血清發生反應特異性很強，純化后的重組E2蛋白可直接作為檢測用抗原建立ELISA方法，應用在臨床的豬瘟病毒血清抗體的檢測試驗中。本發明制備的可溶性的E2蛋白具有良好生物學活性，將其與高效的大腸桿菌表達系統及ELISA技術相結合，能建立檢測豬瘟病毒血清抗體的間接ELISA方法，具有與國外同類產品相當的敏感性和特異性，其單份樣品的成本僅為進口試劑盒的1/5，采用本方法純化的可溶性E2抗原與完整CSFV病毒粒子具有相同的特異性，完全可以替代其作為血清抗體檢測用抗原；在血清樣品稀釋液中添加的空載體重組菌裂解液，可以有效地阻斷因樣品血清中存在大腸桿菌抗體而產生的非特異性反應，克服了因大腸桿菌污染而導致的假陽性；檢測豬瘟病毒血清抗體的間接ELISA方法適合檢測豬體內抗豬瘟病毒血清抗體水平，效果良好。本發明檢測豬瘟病毒血清抗體的間接ELISA方法為臨床豬瘟的科學免疫提供可靠的參考依據。1、本發明改良了傳統的LB培養基，在減少LB相應成分的基礎上增加了葡萄糖，配制了iLB液體培養基，在與低溫誘導條件共同作用下，有效減少包涵體的形成，促進可溶性的E2蛋白表達；2、本發明解決了豬瘟病毒E2抗原在大腸桿菌中主要以包涵體表達的難題，獲得的可溶性E2蛋白與完整豬瘟病毒粒子具有相似的免疫學效果，可作為替代豬瘟病毒粒子的抗原，建立敏感性、特異、安全和可靠的豬瘟病毒血清抗體的檢測間接ELISA方法。具體實施例方式反轉錄合成cDNA后，采用聚合酶鏈式反應(PCR)技術和用上、下游引物(uE、dE)擴增抗原蛋白基因E2主要抗原區。PCR產物經純化、回收后、酶切，與pGEX4T-l表達載體連接，BL21(Star)感受態細胞，重組質粒命名為pGST-E2。IPTG誘導表達和親和層析純化重組E2蛋白，建立間接ELISA血清抗體診斷方法，用于豬瘟病毒血清抗體檢測。具體步驟為1.克隆E2基因抗原結構域部分1)設計表達引物設計1對特異性寡核苷酸表達引物uE和dE，同時在5端分別增加限制性內切酶位點，序列為uE:5，-GCGAATTCGGACTCACCACTACATGC-3，fc。//dE:5，-GCCTCGAGTAGCCATCTGTGCTGATTC-3，勘〃2)提取總RNA:使用組織裂解液(TRIZ0L試劑)從感染了豬瘟兔化病毒疫苗株的兔脾臟組織毒提取總RNA。3)反轉錄合成cDNA:取所提取的RNA5~10u1，加入20u1反轉錄體系中，內含1XRTbuffer(50mMTris-HCl(pH8.3)，75nMKCl，8mMMgCl2，10mMDTT)，dNTP(eachlOmM)，引物dE50pmo1，AMVRTaseIOU，RNaseinhibitor20U。在42t:下水浴lh，然后煮沸5min，置-2(TC備用。4)PCR擴增E2基因取5)4反轉錄產物加入PCR反應體系中，內含1XPCRbuffer(10mMTris-HC1，50mMKC1，1.5mMMgCl2pH8.3)0,2mMdATP，dCTP,dGTP，0.19mMdTTP，0.OlmM，250nM特異性引物uE/dE。PCR循環參數為94。C40秒，55。C30秒，72°C50秒，第一循環94°C5分鐘，最后一循環72°C延伸IO分鐘。35個循環完成擴增反應。2.重組表達載體的構建和鑒定LB液體和固體培養基，抗性及濃度均為Amp+100tig/mL。PCR擴增的E2片段用DNA片段回收Kit純化回收。限制性內切酶EcoR工和Xhol過夜雙酶切PGEX4T-1載體和E2片段，純化回收酶切后的產物。按照載體和目的片段的合適摩爾比(載體目的片段"l:3)混合后用T4DNA連接酶16。C連接過夜，連接產物轉化DH5a感受態細胞，在LB平板培養1218h。挑取單克隆，增菌后提取質粒進行酶切鑒定和PCR鑒定，鑒定得到的陽性重組質粒轉化表達菌株BL21(Star)感受態細胞，重組質粒命名為pGST-E2。3.pGST-E2在LB培養基中的試表達挑取5個單克隆菌株，接種到5個5mLLB液體培養基試管中，220r/min，37。C過夜振蕩培養；然后分別從5管中取50uL菌液到新的5個LB液體培養基試管中，250r/min34h至OD,"O.50.6，在其中的4個管中加入IPTG的終濃度分別為0.lmol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L,剩余1管作為陰性對照，37°C200r/min振蕩培養46h。4.pGST-E2表達蛋白的鑒定1)SDS-PAGE鑒定重組E2蛋白取lmL重組菌到Ep管中，10000r/min離心lmin，棄掉上清，加入100uLTrisp朋.8，100。C煮5min，10000r/min離心15min。配制15X的SDS-PAGE蛋白質電泳凝膠，每個樣品加10uL上清，加入標準蛋白Marker5uL，80v濃縮膠，120v分離膠，膠塊考馬斯亮藍染色，脫色后觀察到了E2蛋白成功表達。2)WesternBlotting:結果表明，重組E2蛋白可以被豬瘟陽性血清識別，具有良好的特異性。3)重組E2抗原與完整豬瘟病毒抗原生物學活性的比較間接ELISA法分別將純化的重組E2抗原和充分滅活的豬瘟病毒抗原以適當濃度包被96孔ELISA平板。按照標準的間接ELISA操作程序，利用事先制備的2份已知豬瘟抗體陽性血清(P)和已知無豬瘟特異性抗體的2份陰性血清(N)作為第一抗體，分別作1:20稀釋，與兩種抗原作用，每份血清作2孑L，以辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG作為第二抗體，TMB作為底物，酶標儀0D450波段讀結果，見表一。表一重組E2抗原和豬瘟全病毒抗原活性比較0D450<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>根據間接ELISA常用的結果判斷公式:陽性血清0D值/陰性血清0D值〉2.1(即P/N〉2.1)，可知重組E2抗原和全病毒抗原具有幾乎相同的與豬瘟病毒抗體陽性血清反應原性，重組E2抗原完全可以替代全病毒抗原用于豬瘟病毒血清抗體的檢測。5.pGST-E2表達蛋白的大量表達及純化1)重組菌的大量表達LB培養基成分中含蛋白胨8.0g;氯化鈉9.0g;酵母提取物6g，葡萄糖lg加無離子水至1L，調pH二7.4，將重組菌1%的接種量接到1LLB，37。C震蕩增菌至OD6。。=0.50.6，然后分別在37。C誘導4h、3(TC誘導8h、20。C誘導12h、16。C誘導16h和14。C誘導24h;5000r/min，離心10min，用緩沖液lXPBS收集菌體，振蕩混勻；分別超聲破菌，冰浴條件下，工作4s，間歇6s，50cycles，超聲三次；4°C，15000r/min離心30min。保留上清樣品和沉淀樣品，進行15%的SDS-PAGE蛋白質電泳凝膠鑒定重組E2蛋白的表達形式，見表二。表二E2蛋白誘導的表達條件<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表一可知，E2重組蛋白的最佳表達條件為iLB，16'C，IPTG濃度為0.10,1/ml2)親和層析純化融合蛋白將離心后的上清樣品上樣到谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B柱上，在4°C條件下，重復34次，用1XPBS(150咖ol/LNaCl，32mmol/LNa2HP04，4mmol/LNaH2P04，pH7.3)洗雜蛋白，然后用含有15腿ol/L還原型谷胱甘肽(GSH)的50mmol/LTris.ClpH8.0洗融合蛋白，整個洗脫過程中用蛋白指示劑監測洗脫情況，并且預留穿透的樣品和洗脫后融合蛋白通過SDS-PAGE蛋白質電泳觀察結果。3)蛋白質濃縮洗脫后的E2重組蛋白在濃縮管3200r/min，離心濃縮，4。C條件下濃縮至體積為lmL，取樣留做鑒定，其余的樣品液氮速凍后，保存在-7(TC低溫冰箱。6.豬瘟病毒血清抗體間接ELISA方法的建立6.1抗原包被用碳酸鹽緩沖液(0.05mol/LNaC03/NaHC03,pH9.6)將抗原稀釋至工作濃度(13.75iig/ml)，每孔50u1，4°C過夜。以洗滌緩沖液1XPBST(0.01mol/LPBS加0.05XTween20，pH7.4)洗滌4次，每孔230ul，最后一次棄凈孔內液體，每孔加入50ul封閉液(0.5%明膠，5%蔗糖，10X馬血清的PBST)37。C封閉40分鐘，洗滌4次，拍干。風機吹干或真空干燥后，每塊立即與4袋lg用干燥劑一起放入鋁箔真空袋內，包裝機真空包裝，4'C保存。6.2加入待檢和標準陰、陽性對照血清用血清稀釋液對陽性和陰性對照血清做1:20稀釋，每孔加入50化，陰陽性對照血清各做兩孔；同時待檢血清樣品用血清稀釋液做1:20稀釋，密封，37。C結合45分鐘。同時設兩孔不加任何血清樣品的空白對照；6.3洗板棄去孔內液體，然后將25XPBST洗滌液用滅菌水或超純水稀釋成1XPBST，每孔加入220300叱洗板，重復4次，最后一次棄凈孔內液體。6.4加入酶結合物濃縮酶標記抗體用酶結合物稀釋液做1:100稀釋，每孔加入50化,密封,37"C結合45分鐘。注意(從加入第一孔時開始計時間；并且現用現配，配置好的工作溶液不易儲存超過6小時)。6.5重復步驟6.3洗板。6.6加入底物將底物溶液A和B以1:50的體積比混勻，每孔加入50化,輕輕震蕩混勻，密封，37"C或室溫避光作用15分鐘。6.7終止反應每孔加入50叱終止液，輕搖混勻，測定吸光度OD450nm。6.8結果計算試驗成立條件陽性對照、陰性對照血清孔各有兩個值，需計算平均吸光度值，陽性標準血清0D450》0.60，陰性標準血清0D450《0.25，且陽性對照血清0D450/陰性對照血清0D450》2.10判定為試驗成立。計算公式比值=血清樣品0D450/陰性對照血清OD450>2.106.8.2結果判定比值>2.10血清樣品豬瘟病毒抗體判定為陽性；比值〈2.10血清樣品豬瘟病毒抗體判定為陰性。本實施方式所用試材等來源1、毒株和血清樣品由中國農業科學院蘭州獸醫研究所采集保存。2、引物合成和測序由Takara公司合成。3、Sigma公司酶標儀、辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG、底物TMB、誘導劑IPTG、核酸電泳和蛋白電泳所用試劑。4、Takara公司組織總RNA提取試劑盒、擴增用單核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、高保真的r^酶、限制性核酸內切酶(fco/M、J力WI)、T4DNA連接酶。5、安瑪西亞瓊脂糖4B填料、還原型谷胱甘肽、超濾濃縮管和咪唑。6、深圳金燦華有限公司96孔板、血清管。實施例11.克隆E2基因抗原結構域部分1)設計表達引物設計1對特異性寡核苷酸表達引物uE和dE，同時在5端分別增加限制性內切酶位點，序列為uE:5，-GCGAATTCGGACTCACCACTACATGC-3，^c。vJdE:5'-GCCTCGAGTAGCCATCTGTGCTGATTC-3，J力o//2)提取總RNA:使用組織裂解液(TRIZOL試劑)從感染了豬瘟兔化病毒疫苗株的兔脾臟組織毒提取總RNA。3)反轉錄合成cDNA:取所提取的RNA510u1，加入20u1反轉錄體系中，內含1XRTbuffer(50mMTris-HC1(pH8.3)，75nMKCl，8mMMgCl2,lOmMDTT)，dNTP(eachlOmM)，引物dE50pmo1，AMVRTase10U，RNaseinhibitor20U。在42'C下水浴lh，然后煮沸5min，置-2(TC備用。4)PCR擴增E2基因取5W反轉錄產物加入50WPCR反應體系中，內含1XPCRbuffer(10mMTris-HCl，50mMKC1，1.5mMMgCl2pH8.3)0.2mMdATP，dCTP，dGTP，0.19mMdTTP，0.OlmM，250nM特異性引物uE/dE。PCR循環參數為94。C40秒，55。C30秒，72°C50秒，第一循環94°C5分鐘，最后一循環72nC延伸10分鐘。35個循環完成擴增反應。2.重組表達載體的構建和鑒定LB液體和固體培養基，抗性及濃度均為Amp+100ixg/mL。PCR擴增的E2片段用DNA片段回收Kit純化回收。限制性內切酶EcoRI和Xhol過夜雙酶切PGEX4T-1載體和E2片段，純化回收酶切后的產物。按照載體和目的片段的合適摩爾比(載體目的片段"l:3)混合后用T4DNA連接酶16X:連接過夜，連接產物轉化DH5a感受態細胞，在LB平板培養1218h。挑取單克隆，增菌后提取質粒進行酶切鑒定和PCR鑒定，鑒定得到的陽性重組質粒轉化表達菌株BL21(Star)感受態細胞，重組質粒命名為pGST-E2。3.pGST-E2在LB培養基中的試表達挑取單克隆菌株，接種到5mLLB液體培養基試管中，220r/min，37。C過夜振蕩培養；然后取50uL菌液到新的LB液體培養基試管中，250r/min34h至0D6。。^0.50.6，在管中加入IPTG的終濃度為O.lmol/L，并留l管作為陰性對照，37°C200r/min振蕩培養46h。4.pGST-E2表達蛋白的鑒定1)SDS-PAGE鑒定重組E2蛋白取lmL重組菌到Ep管中，10000r/min離心lmin，棄掉上清，加入100txLTrispH6.8，100。C煮5min，10000r/min離心15min。配制15X的SDS-PAGE蛋白質電泳凝膠，每個樣品加10uL上清，加入標準蛋白Marker5uL，80v濃縮膠，120v分離膠，膠塊考馬斯亮藍染色，脫色后觀察到了E2蛋白成功表達。2)WesternBlotting:結果表明，重組E2蛋白可以被豬瘟陽性血清識別，具有良好的特異性。3)重組E2抗原與完整豬瘟病毒抗原生物學活性的比較間接ELISA法分別將純化的重組E2抗原和充分滅活的豬瘟病毒抗原以適當濃度包被96孔ELISA平板。按照標準的間接ELISA操作程序，利用事先制備的2份已知豬瘟抗體陽性血清(P)和已知無豬瘟特異性抗體的2份陰性血清(N)作為第一抗體，分別作1:20稀釋，與兩種抗原作用，每份血清作2孔，以辣根過氧化物酶標記的兔抗豬IgG作為第二抗體，TMB作為底物，酶標儀0D450波段讀結果。根據間接ELISA常用的結果判斷公式陽性血清OD值/陰性血清OD值〉2.1(即P/N〉2.1)，可知重組E2抗原和全病毒抗原具有幾乎相同的與豬瘟病毒抗體陽性血清反應原性，重組E2抗原完全可以替代全病毒抗原用于豬瘟病毒血清抗體的檢測。5.pGST-E2表達蛋白的大量表達及純化1)重組菌的大量表達LB培養基成分中含蛋白胨8.0g;氯化鈉9.0g;酵母提取物6g，葡萄糖lg加無離子水至1L，調pH=7.4，將重組菌1%的接種量接到1LLB，37。C震蕩增菌至OD卿二O.50.6，然后在16。C誘導16h;5000r/min，離心10min，用緩沖液lXPBS收集菌體，振蕩混勻；超聲破菌，冰浴條件下，工作4s，間歇6s，50cycles，超聲三次；4°C，15000r/min離心30min。保留上清樣品和沉淀樣品，進行15%的SDS-PAGE蛋白質電泳凝膠鑒定重組E2蛋白的表達形式。2)親和層析純化融合蛋白將離心后的上清樣品上樣到谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B柱上，在4°C條件下，重復34次，用1XPBS(150咖ol/LNaCl，32mmol/LNa2HP04，4mmol/LNaH2P04，pH7.3)洗雜蛋白，然后用含有15mmol/L還原型谷胱甘肽(GSH)的50咖ol/LTris.ClpH8.0洗融合蛋白，整個洗脫過程中用蛋白指示劑監測洗脫情況，并且預留穿透的樣品和洗脫后融合蛋白通過SDS-PAGE蛋白質電泳觀察結果。3)蛋白質濃縮洗脫后的E2重組蛋白在濃縮管3200r/min，離心濃縮，4。C條件下濃縮至體積為lmL，取樣留做鑒定，其余的樣品液氮速凍后，保存在-7(TC低溫冰箱。6.豬瘟病毒血清抗體間接ELISA方法的建立6.1抗原包被用碳酸鹽緩沖液(0.05mol/LNaC03/NaHC03，pH9.6)將抗原稀釋至工作濃度(13.75iig/ml)，每孔50u1，4。C過夜。以洗滌緩沖液1XPBST(0.Olmol/LPBS加0.05^Tween20，pH7.4)洗滌4次，每孔230ul，最后一次棄凈孔內液體，每孔加入50yl封閉液(0.5%明膠，5%蔗糖，10X馬血清的PBST)37。C封閉40分鐘，洗滌4次，拍干。風機吹干或真空干燥后，每塊立即與4袋lg用干燥劑一起放入鋁箔真空袋內，包裝機真空包裝，4"C保存。6.2加入待檢和標準陰、陽性對照血清用血清稀釋液對陽性和陰性對照血清做1:20稀釋，每孔加入50叱，陰陽性對照血清各做兩孔；同時待檢血清樣品用血清稀釋液做1:20稀釋，密封,37"結合45分鐘。同時設兩孔不加任何血清樣品的空白對照；6.3洗板棄去孔內液體，然后將25XPBST洗滌液用滅菌水或超純水稀釋成1XPBST，每孔加入220300叱洗板，重復4次，最后一次棄凈孔內液體。6.4加入酶結合物濃縮酶標記抗體用酶結合物稀釋液做1:100稀釋，每孔加入50叱，密封，37"C結合45分鐘。注意(從加入第一孔時開始計時間；并且現用現配，配置好的工作溶液不易儲存超過6小時)。6.5重復步驟6.3洗板。6.6加入底物將底物溶液A和B以1:50的體積比混勻，每孔加入5(HiL，輕輕震蕩混勻，密封，37。C或室溫避光作用15分鐘。6.7終止反應每孔加入50叱終止液，輕搖混勻，測定吸光度0D450nm。6.8結果計算試驗成立條件陽性對照、陰性對照血清孔各有兩個值,需計算平均吸光度值，陽性標準血清0D450》0.60，陰性標準血清0D450《0.25，且陽性對照血清0D450/陰性對照血清0D450>2.10判定為試驗成立。計算公式比值=血清樣品0D450/陰性對照血清0D450》2.106.8.2結果判定比值>2.10血清樣品豬瘟病毒抗體判定為陽性；比值〈2.10血清樣品豬瘟病毒抗體判定為陰性。實施例2重復實施例1的方法，只是步驟5大量誘導表達的誘導溫度為20°C，誘導時間12h。CSFV抗體檢測方法E2核苷酸序列表OrganizationApplicantStreet:徐家坪1，鹽場路City:蘭州State:甘肅Country:P.R.ChinaPostalCode:730046PhoneNumber二0931—8342706FaxNumber:0931—8342052EmailAddress:yinshuanghuikangri@163.com〈110〉0rganizationName:中國農業科學院蘭州獸醫研究所ApplicationProject<120〉Title:—種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法<130〉AppFileReference:G.Swensvoort，1989.TopographicalandFunctionalMappingofEpitopesonHogCholeraVirus.J.Gen.Virol,70:2865-2876.<140〉CurrentAppNumber:<141>CurrentFilingDate:_-_-—Sequence<213>OrganismName:豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2基因〈400〉PreSequenceString:gaagattacaggtacgcaatatcgtcaaccgatgagatagggctacttggggccggaggt60ctcaccaccacctggaaggaatacaaccacgatttgcaactgaatgacgggaccgtcaag120gccagttgcg180ttggcgtcat240ggg3CC33CC300gatacgagtc360tatcttgtct420actctgagga480gattgtgtga540tggacatgtg558〈212〉Type:DNA〈211〉Length:558SequenceName:E2SequenceDescription:FeaturetggcaggttcctttaaagtcacagcacttaatgtggtcagtaggaggtattgcataagaaggctttacccacttccgtgacattcgagctcctgttcgaccatcaactgaggaaatgggagatgacttcaggtccgggctgtgcccgtttctgttgttaagggaaagtacaatacgaccttgttgaacggtaatgctttcgcccaatagggtggacgggtgtcatagagtgcacagcagtgagcccaacacagaagtggtaaagaccttcaggagagacaagccctttccgcacagagrtgccaxxatagtggaaaatgaagatttattctattgtaagttggggggcaactgaaaggcSequence:E2:〈221〉FeatureKey:CDS<222〉LocationFrom:1<222〉LocationTo:558OtherInformation:CSFVE2geneCDSJoin:Yes權利要求1、一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法，其特征在于，包括下述步驟A.克隆E2基因抗原結構域部分A.1、設計1對特異性寡核苷酸引物uE和dE；A.2、提取總RNA，從豬瘟兔化弱毒疫苗中提取核糖核酸-RNA；A.3、反轉錄合成cDNA，以提取的核糖核酸RNA為模板，反轉錄合成cDNA；A.4、PCR擴增E2基因，用所述的1對特異性寡核苷酸引物，進行聚合酶鏈式擴增反應擴增；B.構建重組表達載體；C.在改良的LB培養基中表達，獲得可溶性的重組E2蛋白；D.親和層析純化重組E2蛋白；E.pGST-E2表達蛋白的鑒定，SDS-PAGE和WesternBlotting鑒定表達的重組E2蛋白；F.利用重組E2蛋白建立檢測豬瘟血清抗體間接ELISA方法。上述步驟C所述改良的LB培養基成分中含有蛋白胨0.8％；氯化鈉0.9％；酵母提取物0.6％，葡萄糖0.1％g加無離子水，調pH＝7.4。2、根據權利要求1所述的一制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法，其特征在于所述步驟C在改良的LB培養基中表達E2蛋白的誘導溫度為20-16°C，誘導時間12-16小時，誘導劑IPTG濃度為0.10mmol/ml。3、根據權利要求1所述的一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法，其特征在于所述步驟C在改良的LB培養基中表達E2蛋白的誘導溫度為16°C，誘導時間16小時。全文摘要一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法，包括下述步驟A.克隆E2基因抗原結構域部分；B.構建重組表達載體；C.在LB培養基中表達，獲得可溶性的重組E2蛋白；D.親和層析純化重組E2蛋白；E.pGST-E2表達蛋白的鑒定，SDS-PAGE和WesternBlotting鑒定表達的重組E2蛋白；F.利用重組E2蛋白建立檢測豬瘟血清抗體間接ELISA方法。本發明改良了傳統的LB培養基，促進可溶性的E2蛋白表達；解決了豬瘟病毒E2抗原在大腸桿菌中主要以包涵體表達的難題，獲得的可溶性E2蛋白與完整豬瘟病毒粒子具有相似的免疫學效果，可作為替代豬瘟病毒粒子的抗原，建立敏感性、特異、安全和可靠的豬瘟病毒血清抗體的檢測間接ELISA方法。文檔編號G01N33/53GK101418304SQ20081015030公開日2009年4月29日申請日期2008年7月6日優先權日2008年7月6日發明者劉湘濤,劉艷紅,孫世琪,尚佑軍,尹雙輝,宏田,韓雪清申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所