專利名稱：：液相色譜法測定獨一味中8-o-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法
技術領域：
：本發明屬于中藥領域，涉及一種藥品的檢測方法，尤其涉及一種液相色譜法測定獨一味中8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法。
背景技術：
：獨一味為傳統藏藥，相關制劑被臨床廣泛應用于各種外科手術后的鎮痛止血及口腔科、婦科、關節炎等方面的治療。《中國藥典》要求測定獨一味及其制劑中總黃酮及木犀草素含量，并設定了質量標準。但是大量藥理實驗表明以8-0-乙酰基山梔子苷甲酯為代表的環烯醚萜苷類成分具有很好的止血、鎮痛作用，是獨一味的活性物質基礎。建立獨一味制劑中8-0-乙酰基山梔子苷甲酯的含量測定方法，能更好地保障獨一味藥材及其相關提取物、制劑的質量。
發明內容本發明的目的是為了提供一種液相色譜法測定獨一味中8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法。本發明液相色譜法測定獨一味中8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水為流動相，在檢測波長230-240nm，流速0.52.0mL/min,進樣量5~50pl的色譜條件下，將制備的樣品溶液進行液相色譜分析，測定對照品溶液相應位置的色譜峰面積，按標準曲線計算相應的含量。所述流動相中乙腈:水的體積比為3:10040:100(最佳為15:85)。所述對照品溶液的制備精密稱取經五氧化二磷干燥過夜的8-0-乙酰基山梔苷甲酯對照品，用水制成濃度介于0.1-100.0ng'mr1的梯度溶液。本發明的測定方法適用于獨一味藥材及由獨一味藥材制得的提取物及制劑。所述獨一味制劑樣品溶液的制備將獨一味制劑溶于甲醇或乙醇的任何比例的水溶液中，使8-O-乙酰基山梔子苷甲酯的濃度介于0.1100.0^mr1，即得樣品溶液。其中獨一味制劑包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊劑、分散劑、3口服液體制劑、針劑、膜劑、氣霧劑、散劑及外用制劑。所述獨一味藥材樣品溶液的制備將獨一味藥材采用水提、醇提或超聲提取，所得提取液稀釋至8-0-乙酰基山梔子苷甲酯的濃度介于0.1~100.0pg.mr1，即得樣品溶液。所述獨一味提取物樣品溶液的制備將獨一味提取物溶于甲醇或乙醇的任何比例的水溶液中，稀釋至8-0-乙酰基山梔子苷甲酯的濃度介于0.1-100.0pg-mr1，即得樣品溶液。獨一味提取物包括各種分離手段從獨一味藥材中得到的提取物，如獨一味水提取物、獨一味總皂苷、獨一味總環烯醚萜苷等。下面通過具體實驗對本發明方法進行進一步說明。(1)儀器與試藥高效液相色譜儀(美國Waters公司)，包括600型二元梯度泵、996型二極管陣列紫外檢測器，BP210S電子分析天平(Sartorius公司)，SK7200H超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)。8-0-乙酰基山梔苷甲酯對照品(實驗室自制，MS,NMR確定其結構)，純化水，乙腈為色譜純(CaledonLaboratoriesLTD.Canada)。市場銷售獨一味制劑5種，見表1。表1市售5種獨一味制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>(2)色譜條件選擇SymmetryCw色譜柱(4.6mmXI50mm,5pm，Waters);洗脫流動相為乙腈-水(15:85);流速1.0ml'min";柱溫20。C;進樣量2(Hd。(3)檢測波長的選擇取8-0-乙酰基山梔苷甲酯對照品溶液，在200-400nm范圍內掃描，結果在234nm處有最大吸收，故選擇234nm作為檢測波長。(4)線形關系的考察及標準曲線的繪制分別精密吸取100pg-mr1的對照樣品母液5.0，4.0，3.0，2.0，1.0ml于25ml容量瓶中，用水注射加至刻度，得濃度分別為20.0，16.0，12.0，8.0，4.0pg'mr1梯度溶液，再精密吸取溶液20.0pg'mr1的溶液2.5，1.5ml于25ml容量瓶中，用水注射稀釋定容得2.0，1.2pg，ml—1梯度溶液，綜合起來得到1.220.0pg，mr1的7個梯度對照品溶液。分別進樣20W，測定色譜峰面積，以色譜峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性方程式及線性相關系數，結果見表2。表2線形關系考察結果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表2的線形關系考察得到線性方程為Y=23459X+271.21;線性相關系數r=0.9999。表明8-0-乙酰基山梔苷甲酯在1.2~20.0pg.ml"濃度范圍內與峰面積呈良好線性關系。(5)精密度試驗精密取8.0pgTnl"對照品溶液20^1，分別于第一天，第二天，第三天各重復進樣5次，并測定8-0-乙酰基山梔苷甲酯峰積分面積及保留時間，實驗結果見表3。從表3的實驗結果可以看出，日內、日間精密度，積分面積日內RSD分別為0.08，0.13，和0.52%，日間精密度RSD為0.390/。，保留時間日內RSD分別為0.18，1.44，和0.31%,日間精密度RSD為2.14。/。。表3精密度試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(6)穩定性試驗精密吸取同一樣品溶液分別在0，2，4，8，12,24，48h測定峰面積積分值(見表4)，計RSD為0.102%，表明樣品溶液在48小時內基本穩定。表4穩定性試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(7)重現性試驗照含量測定項下操作，對同一種獨一味樣品6份進行測定，求得標準偏差RSD為0.53y。，結果見表5。表5重現性試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(8)加樣回收率試驗取己知樣品含量的樣品適量9份，1-3份加入對照品0.59mg，4-6份加入對照品0.984mg，7-9份加入對照品1.476mg，混勻，按上述方法制備樣品溶液，按上述方法測定色譜峰面積，計算其中8-0-乙酰基山梔苷甲酯的含量及相應的加樣回收率，結果見表6。表6加樣回收率試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(9)最低檢測限的測定精密吸取8pg'mr1的對照品溶液適量，以注射用水稀釋成8，0.8ng'mr1的對照品溶液，分別進樣20pl，測定色譜圖，以色譜峰積分面積大于3倍該處噪音算，8-0-乙酰基山梔苷甲酯的檢測限可達到0.8ng'mr1，可以滿足獨一味制劑中的含量測定。(10)樣品中的含量測定精密吸取樣品溶液20.0)al，以上述色譜條件，注入高效液相色譜儀中，測定與8-0-乙酰基山梔苷甲酯標準品相同位置的色譜峰面積，根據標準曲線計算制劑中8-0-乙酰基山梔苷甲酯的含量，同時根據制劑相應包裝，計算每粒(袋)中8-0-乙酰基山梔苷甲酯含量，結果見表7。表7樣品含量測定(n=2)樣品編號制劑名稱含量(mg/g)每粒、袋重量(g)每粒、袋含量(mg/g)1獨一味片劑10.730.283.002獨一味膠囊劑10.360.33.113獨一味軟膠囊7.030.644.54獨一味軟膠囊0.430.550.245獨一味顆粒劑0.8673.02.6結果表明獨一味不同制劑中均可檢測出8-0-乙酰基山梔苷甲酯，但含量相差很大。具體實施例方式實施例一獨一味膠囊中8-0-乙酰基山梔苷甲酯含量的測定獨一味膠囊由甘肅獨一味生物制藥股份有限公司提供，批號0710025331。色譜條件與波長選擇用十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水(體積比為15:85)為流動相；檢測波長234nm。對照品溶液的制備精密稱取經五氧化二磷干燥過夜的8-0-乙酰基山梔苷甲酯對照品適量，加注射用水制成每lml含0.1mg的對照品母液。樣品溶液的制備精密稱取獨一味膠囊內容物1.0g于具塞三角錐瓶中，加入50ml50%的甲醇溶液，稱定重量，于7(TC水浴加熱30min，時時振搖，冷卻后再稱定，加50%甲醇補齊失去的重量。過濾，續濾液適當稀釋，即得樣品溶液。標準曲線的制備精密吸取對照品溶液5.0，4.0，3.0，2.0，1.0ml于25ml容量瓶中，用注射用水加至刻度，得濃度分別為20.0，16.0，12.0，8.0，4.0^mr1梯度溶液，再精密吸取溶液20.0pgTiir1的溶液2.5，1.5ml于25ml容量瓶中，注射用水稀釋定容得2.0，1.2)ag'mr1梯度溶液，綜合起來得到1.220.0叫-mr1間的7個梯度對照品溶液。分別進樣20W，測定色譜峰面積，以色譜峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。測定方法精密吸取樣品溶液20^，注入高效液相色譜儀，測定與標準品相應位置的色譜峰面積，根據標準曲線計算得每0.3g獨一味膠囊(相當于生藥lg)中含8-0-乙酰基山梔子苷甲酯為3.11mg，即8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量為1.033%。實施例二獨一味片劑中8-0-乙酰基山梔苷甲酯的測定獨一味片劑由廣州白云山制藥總廠提供，批號1070013。色譜條件與波長選擇用十八垸基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水(體積比15:85)為流動相；檢測波長234nm。對照品溶液的制備精密稱取經五氧化二磷干燥過夜的8-0-乙酰基山梔苷甲酯對照品適量，加注射用水制成每1ml含0.1mg的對照品母液。樣品溶液的制備獨一味片劑20粒，去處包衣，研勻，精密稱取1.0g于具塞三角錐瓶中，加入50ml50。/。甲醇溶液，稱定重量，于70。C水浴加熱30min，時時振搖，冷卻后再稱定，加50%甲醇補齊失去的重量。過濾，續濾液適當稀釋，即得樣品溶液。標準曲線的制備精密吸取對照品溶液5.0，4.0，3.0，2.0，1.0ml于25ml容量瓶中，注射用水加至刻度，得濃度分別為20.0，16.0，12.0，8.0，4.0pgTiir1梯度溶液，再精密吸取溶液20.0pg'mr1的溶液2.5，1.5ml于25ml容量瓶中，注射用水稀釋定容得2.0，1.2嗎'ml—1梯度溶液，綜合起來得到1.2—20.0pg-ml—1間的7個梯度對照品溶液。分別進樣20pl，測定色譜峰面積，以色譜峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。測定方法精密吸取樣品溶液20)Lll，注入高效液相色譜儀，測定與標準品相應位置的色譜峰面積，根據標準曲線計算得每0.28§獨一味片劑(相當于生藥lg)中含8-O-乙酰基山梔子苷甲酯為3.0mg，即8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量為1.073%。實施例三獨一味藥材中8-0-乙酰基山梔苷甲酯的測定獨一味藥材于2007.8月采自甘肅省瑪曲縣，主要為其地上部分。色譜條件與波長選擇用十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水(體積比15:85)為流動相；檢測波長234nm。對照品溶液的制備精密稱取經五氧化二磷干燥過夜的8-0-乙酰基山梔苷甲酯對照品適量，加注射用水制成每1ml含0.1mg的對照品母液。樣品溶液的制備獨一味藥材，研碎，過20目篩，精密稱取1.0g于250ml圓底燒瓶中，加入50ml甲醇溶液，稱定重量，于75-C回流加熱30min，冷卻后再稱定，加甲醇補齊失去的重量。過濾，續濾液適當稀釋，即得樣品溶液。標準曲線的制備精密吸取對照品溶液5.0，4.0，3.0,2.0，1.0ml于25ml容量瓶中，注射用水加至刻度，得濃度分別為20.0，16.0,12.0，8.0，4.0嗎'mr1梯度溶液，再精密吸取溶液20.0pg'mr1的溶液2.5，1.5ml于25ml容量瓶中，注射用水稀釋定容得2.0，1.2pg'mr1梯度溶液，綜合起來得到1.2-20.0)Lig-mr1間的7個梯度對照品溶液。分別進樣20pl，測定色譜峰面積，以色譜峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。測定方法精密吸取樣品溶液20^d，注入高效液相色譜儀，測定與標準品相應位置的色譜峰面積，根據標準曲線計算得每lg獨一味藥材中含8-0-乙酰基山梔子苷甲酯為8.0mg,即8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量為0.80%。實施例四獨一味環烯醚萜苷提取物中8-0-乙酰基山梔苷甲酯的測定獨一味環烯醚萜苷提取物由蘭州軍區蘭州總院提供。色譜條件與波長選擇用十八垸基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-水(體積比15:85)為流動相；檢測波長234nm。對照品溶液的制備精密稱取經五氧化二磷干燥過夜的8-0-乙酰基山梔苷甲酯對照品適量，加注射用水制成每1ml含0.1mg的對照品母液。樣品溶液的制備精密稱取獨一味環烯醚萜苷提取物0.1g于100ml容量瓶中，加入注射用用水，定容，適當稀釋，即得樣品溶液。標準曲線的制備精密吸取對照品溶液5.0，4.0，3.0，2.0，1.0ml于25ml容量瓶中，注射用水加至刻度，得濃度分別為20.0，16.0，12.0，8.0，4.0lig'mr1梯度溶液，再精密吸取溶液20.0pg'mr1的溶液2.5，1.5ml于25ml容量瓶中，注射用水稀釋定容得2.0，1.2pg'mr1梯度溶液，綜合起來得到1.2-20.0pg-mr1間的7個梯度對照品溶液。分別進樣20pl，測定色譜峰面積，以色譜峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。測定方法精密吸取樣品溶液20pl，注入高效液相色譜儀，測定與標準品相應位置的色譜峰面積，根據標準曲線計算得每lg獨一味環烯醚萜苷提取物中含8-0-乙酰基山梔子苷甲酯為189.6mg，即8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量為18.96%。權利要求1、液相色譜法測定獨一味中8-O-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法，其特征在于以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水為流動相，在檢測波長230～240nm，流速0.5～2.0mL/min，進樣量5～50μl的色譜條件下，將制備的樣品溶液進行液相色譜分析，測定對照品溶液相應位置的色譜峰面積，按標準曲線計算相應的含量。2、如權利要求1所述液相色譜法測定獨一味中8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述獨一味為獨一味藥材及由獨一味藥材制得的提取物及制劑。3、如權利要求1所述液相色譜法測定獨一味中8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述流動相中乙腈:水的體積比為3:10040:100。4、如權利要求1所述液相色譜法測定獨一味中8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述對照品溶液的制備精密稱取經五氧化二磷干燥過夜的8-0-乙酰基山梔苷甲酯對照品，用水制成濃度介于0.1-100.0嗎'mr1的梯度溶液。5、如權利要求1所述液相色譜法測定獨一味中8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述獨一味制劑樣品溶液的制備將獨一味制劑溶于甲醇或乙醇的任何比例的水溶液中，使8-0-乙酰基山梔子苷甲酯的濃度介于o.i-ioo.o嗎Tnr1，即得樣品溶液。6、如權利要求1所述液相色譜法測定獨一味中8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述獨一味藥材樣品溶液的制備將獨一味藥材采用水提、醇提或超聲提取，所得提取液稀釋至8-0-乙酰基山梔子苷甲酯的濃度介于0.1100.0pg'mr1，即得樣品溶液。7、如權利要求1所述液相色譜法測定獨一味中8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述獨一味提取物樣品溶液的制備將獨一味提取物溶于甲醇或乙醇的任何比例的水溶液中，稀釋至8-0-乙酰基山梔子苷甲酯的濃度介于0.1-100.0^mr1，即得樣品溶液。8、如權利要求5所述液相色譜法測定獨一味中8-0-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述獨一味制劑包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊劑、分散劑、口服液體制劑、針劑、膜劑、氣霧劑、散劑及外用制劑。全文摘要本發明提供了一種液相色譜法測定獨一味中8-O-乙酰基山梔子苷甲酯含量的方法，該方法以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水為流動相，在檢測波長230～240nm，流速0.5～2.0mL/min，進樣量5～50μl的色譜條件下，將制備的樣品溶液進行液相色譜分析，測定對照品溶液相應位置的色譜峰面積，按標準曲線計算相應的含量。本發明的測定方法適用于獨一味藥材及由獨一味藥材制得的提取物及制劑。文檔編號G01N30/02GK101308123SQ20081015027公開日2008年11月19日申請日期2008年7月1日優先權日2008年7月1日發明者李茂星,賈正平申請人:李茂星