新型血清型變形鏈球菌及其利用的制作方法

專利名稱：：新型血清型變形鏈球菌及其利用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及編碼變形鏈球菌[Streptococcusmutans(S.mutans)]的新型血清型菌株、該新型血清型菌株的特異性抗體、制備該抗體的方法、使用該抗體檢測該新型菌株的方法及試劑盒，以及編碼參與S.mutatis的新型血清型菌株特異性多糖抗原生物合成的酶的多核苷酸，使用該多核苷酸檢測該新型菌株的方法及試劑盒。具體地說，涉及通過使上述抗體與從被檢樣品中提取的表面多糖抗原進行免疫反應，或通過對從被檢樣品中提取的基因組DNA使用上述多核苷酸進行雜交，或使用上述多核苷酸進行PCR反應，以檢測被檢體中S.mutans新型血清型菌株存在的方法及用于該檢測方法的試劑
背景技術：
：因變形鏈球菌(S.mutans)作為齲齒(蟲牙)的致齲菌而聞名。齲齒是由于S.mutans產生的酸溶解牙的疾病。S.mutans在口腔內增殖，分泌葡萄糖基轉移酶。此酶分解食物中的糖分，生成不溶性的多糖類葡聚糖。生成的葡聚糖與S.mutans菌體一起附著在牙表面形成菌斑(牙垢)。S.mutans在菌斑內代謝糖，生成乳酸等酸。此酸從牙表面牙釉質中溶解鈣，其結果使齲齒加重。如上所述，齲齒是牙科領域的重要疾患之一，所以，關于齲齒的治療及預防的研究也在不斷發展。細菌分類的公知的方法，可例舉出基于生理生化性狀的方法、基于醌組成、菌體脂肪酸組成或細胞壁成分等的方法、基于DNA的G+C含量的方法、基于DNA同源性的方法、使用DNA探針的方法、以及進行l6S核糖體RNA(rRNA)基因堿基序列分析的方法等。特別是，近年來，以基于l6S核糖體RNA基因的堿基序列進行系統分類的菌群(簇)為指標的細菌的分類及識別，也在進行。變形鏈球菌(mutansstreptococci),根據其細胞壁多糖類的組成及其鏈的不同，可分為Streptococcusmutans(S.mutans)(血清型c、e、f)、Streptococcussorbinus(血清型d、g)、Streptococcuscricetus(血清型a)、Streptococcusrattus(血清型b)、Streptococcusferus(血清型c)、Streptococcusmacacae(血清型c)、及Streptococcusdownei(血清型h)的8禾中血清型。而且，從感染性心內膜炎(InfectiveEndocarditis;IE)患者的血液中分離出S.mutans。感染性心內膜炎是牙科領域中最廣為人知的全身性疾病之一。感染性心內膜炎是致死性傳染病，接受了心臟瓣膜置換手術的患者或心臟具有先天性畸形的患者易患此疾病。感染性心內膜炎是在牙科治療時，病原菌侵入患者的血液中，在心內膜形成細菌塊，從而引發炎癥。此病原菌多為口腔內存在的鏈球菌(特別是Streptococcussanguinis),S.mutans也可作為病原菌。通常，感染性心內膜炎發病的患者進行牙科治療時，需在治療之前使用抗生素，并在抗生素的血藥濃度從上升到下降的期間進行治療(參照非專利文獻1及2)。〔非專利文獻l〕DajaniA.S.etal.，PreventionofBacterialEndocarditis;RecommendationsbytheAmericanHeartAssociation.Circulation199796:358-366.(非專利文獻2〕NakataniSetal.,CurrentcharacteristicsofinfectiveendocarditisinJapan;ananalysisof848casesin2000and2001.Circ.J.200367:901-905.為預防感染性心內膜炎，需使用大量的抗生素。例如，青霉素系列的抗生素阿莫西林(Sawacillin)，可用膠囊或粉末在手術前給藥，體重25kg的兒童每次l000mg。如此大量的抗生素在醫學上是必要的。但是，由于抗生素的亂用引起的耐藥性菌的出現，近年來已成為很大的問題。因此，減少抗生素的使用量以及通過抗生素的使用抑制抗性菌的出現，是很有必要的。在本發明者等以前的研究中，從拔牙處理后菌血癥患者或感染性心內膜炎患者中分離出4個鏈球菌菌株，并根據其生物學性質及l6S核糖體RNA的堿基序列，特定為S.mutans菌株(參照非專利文獻3)。通常，S.mutans菌株的約80%或大于80%被分類為血清型c，但從上述患者的血液中分離的4株S.mutans均非血清型c。這些菌株中，1株為血清型e，1株為血清型f，剩余的2株(TW295及TW871)不屬于任一種公知的血清型(c型、e型或f型)，在血清學上還未確定。決定S.mutans菌株血清型的血清型特異性多糖抗原，由具有鼠李糖基本骨架和a—或P—鍵的葡萄糖苷基側鏈的鼠李糖葡萄糖聚合物組成。上述TW295菌株及TW871菌株在血清學上未確定的性質，起因于血清型特異多糖抗原中葡萄糖側鏈量的降低。而且，血清學上未確定的菌株(為方便起見，稱為S.mutans的血清型未確定菌株)TW295及TW871的血清型特異多糖抗原，與g1uA基因(編碼催化葡萄糖側鏈供體之前生産前體的酶)失活突變株的血清型特異多糖抗原類似，g1uA基因失活突變株及S.mutans的血清型未確定菌株的任一個，血清型特異多糖抗原的葡萄糖量均低。另外，S.mutans的血清型未確定菌株，與從口腔中分離的菌株具有同等程度地高度的疏水性和蔗糖依賴性粘附能力，且證明不易受吞噬作用影響。〔非專利文獻3)Fujiwara,T.,K.Nakano，M.'Kawaguchi,T.Ooshima，S.Sobue,S.Kawabata,I.Nakagawa,andS.Hamada.2001.BiochemicalandgeneticcharacterizationofserologicallyuntypableiS^epZococcws附w^awstrainsisolatedfrompatientswithbacteremia.Eur.J.OralSci.109:330-334.上述理論認為，由于高水平的疏水性和蔗糖依賴性粘附，S.mutans的血清型未確定菌株可存在于人體的口腔內。而且，因S.mutans的血清型未確定菌株不易受吞噬作用的影響，在血液中可長期生存，所以，可從血液中分離。為了預防感染性心內膜炎，非常需要簡便地鑒定患者是否帶有感染性心內膜炎的病原菌(例如，S.mutans的血清型未確定菌株)。而且，特定感染性心內膜炎的病原菌，對選擇治療中使用的抗生素非常有用。但簡便地鑒定患者是否帶有感染性心內膜炎病原菌的方法、特定感染性心內膜炎病原菌的方法，還屬于開發過程中。如上所述，因S.mutans的血清型未確定菌株在血液中非常穩定，其結果認為，感染了S.mutans的血清型未確定菌株的患者，感染性心內膜炎發病的可能性很高。因S.mutans的血清型未確定菌株，從預防有致死可能性的感染性心內膜炎發病的觀點出發非常重要，所以，更需要分離及鑒定S.mutans的血清型未確定菌株。本發明的目的是提供分離及鑒定該S.mutans的血清型未確定菌株且，有效、高效地鑒定被檢體中是否存在的方法。
發明內容本發明者等鑒于上述課題進行悉心研究的結果，通過對免疫方法加以改良，獲得針對S.mutans的血清型未確定菌株的抗血清，并將S.mutans的血清型未確定菌株定義為新型血清型(k型)。為了分析、決定此新型血清型k型多糖抗原，特定了該k型菌株中、編碼參與S.mutans多糖抗原生物合成的酶(rgpA、rgpB、rgpC、rgpD、rgpE、rgpF、ORF7、rgpH、rgpI及ORF10)的基因全序列。對于這些基因序列，在k型菌株和已知的血清型S.mutans菌株之間比較，發現了在rgpF中存在與多個k型菌株共有的特異序列。且，本發明者等使用根據在rgpF中發現的S.mutans的k型菌株的特異性堿基序列設計的引物，通過將從被檢體中獲得的組織樣品進行PCR擴增，可有效且高效地檢測出該被檢體中S.mutans的血清型未確定菌株的存在，使本發明得以完成。艮P，本發明的多核苷酸或其片段，其特征在于，包含變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株的特異性堿基序列或該堿基序列的互補序列。優選的是，本發明的多核苷酸或其片段，其特征在于，其是編碼使變形鏈球菌特異性多糖抗原葡萄糖側鏈量降低的多肽的多核苷酸。上述多核苷酸，其特征在于，優選的是由序列號14中任一項所示的堿基序列；或序列號14中任一項所示的堿基序列中1個或數個堿基缺失、取代或附加了堿基序列所組成的多核苷酸。上述多核苷酸，其特征在于，還優選的是序列號i4中任一項所示的堿基序列組成的多核苷酸；或與由序列號14中任一項所示的堿基序列組成的多核苷酸的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交的多核苷酸。更優選的是，上述多核苷酸的特征為，由序列號14中任一項所示的堿基序列組成。根據上述組成，可提供具有新型血清型的變形鏈球菌菌株特異性存在的多核苷酸。艮p，本發明的寡核苷酸，其特征在于，包含變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株的特異性堿基序列或該堿基序列的互補序列。優選的是，上述寡核苷酸的特征為，其中包含序列號14中任一項所示的至少l2個連續的堿基序列或其互補序列。上述寡核苷酸，優選包含序列號810中任一項所示的堿基序列或其互補序列。根據上述組成，可提供在特異性檢測具有新型血清型的變形鏈球菌菌株時優異的寡核苷酸。艮P，本發明的多肽，其特征在于，使變形鏈球菌特異性多糖抗原的葡萄糖側鏈量降低。優選的是，本發明的多肽的特征為，其由上述多核苷酸或其片段編碼。更優選的是，本發明的多肽的特征為，其由序列號14中任一項所示的堿基序列組成的多核苷酸編碼。根據上述組成，可提供具有變形鏈球菌的血清型c、e或f菌株以外的新型血清型變形鏈球菌菌株特異性存在的多肽。艮口，本發明的變形鏈球菌菌株，其特征在于，變形鏈球菌特異性多糖抗原的葡萄糖側鏈量降低了。優選的是，本發明的變形鏈球菌菌株的特征為，其是變形鏈球菌的血清型特異多糖抗原的葡萄糖側鏈量降低了的新型血清型。一方面，本發明的變形鏈球菌菌株，優選具有上述多核苷酸，另一方面，本發明的變形鏈球菌菌株，優選表達上述多肽。根據上述組成，在具有已知血清型變形鏈球菌有關的新理論增加的同時，還可提供只靠具有已知血清型的變形鏈球菌所不能解決的、對疾病的治療及/或預防有效的變形鏈球菌菌株。即，為了解決上述課題，本發明的抗體，其特征在于，與變形鏈球菌血清型C、e或f菌株特異性多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株的多糖抗原特異性結合。艮口，本發明的抗體，其特征在于，與變形鏈球菌血清型特異多糖抗原的葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株與特異性多糖抗原結合。優選的是，本發明的抗體的特征為，與上述變形鏈球菌菌株的血清型特異多糖抗原進行特異性結合。根據上述組成，可提供用于檢測變形鏈球菌血清型特異多糖抗原的葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株，即具有新型血清型的變形鏈球菌菌株的有用的抗體。艮P，本發明的檢測被檢樣品中變形鏈球菌菌株的方法，其特征在于，包含將上述寡核苷酸作為引物使用，以進行PCR反應的步驟。優選的是，本發明的檢測被檢樣品中變形鏈球菌菌株的方法的特征為，其還包含從被檢樣品中分離細菌的步驟、及提取上述分離后的細菌的基因組DNA或總RNA的步驟。本發明的檢測被檢樣品中變形鏈球菌菌株的方法中，上述組織樣品優選從血液、唾液或牙垢中獲得。本發明的檢測被檢樣品中變形鏈球菌菌株的方法中，上述引物優選是由序列號8中所示的堿基序列組成的寡核苷酸及由序列號9或10中所示的堿基序列所組成的寡核苷酸。艮口，根據上述組成，編碼對具有新型血清型的變形鏈球菌菌株血清型特異多糖抗原的生物合成重要的酶的基因，檢測此基因的存在，即可知該新型血清型菌株的存在。艮口，為了解決上述課題，本發明的檢測被檢樣品中變形鏈球菌菌株的方法，其特征在于，包含將上述寡核苷酸作為探針使用，進行雜交反應的步驟。優選的是，本發明的檢測被檢樣品中變形鏈球菌菌株的方法的特征為，其還包含從被檢樣品中分離細菌的步驟、及提取上述分離后細菌的基因組DNA或總RNA的步驟。本發明的檢測被檢樣品中變形鏈球菌菌株的方法中，上述組織樣品優選從血液、唾液或牙垢中獲得。本發明的檢測被檢樣品中變形鏈球菌菌株的方法中，優選上述寡核苷酸由序列號810中任一項所示的堿基序列組成。本發明的檢測被檢樣品中變形鏈球菌菌株的方法中，分離上述細菌的步驟優選使用上述抗體。艮口，為了解決上述課題，本發明的通過雜交反應鑒定變形鏈球菌血清型的方法，其特征在于，用于上述雜交反應的探針，使用包含變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株、特異性的堿基序列或該堿基序列的互補序列的寡核苷酸，同時，上述特異性堿基序列，是序列號14中任一項所示的堿基序列的至少12個連續堿基序列。優選的是，本發明的通過雜交反應鑒定變形鏈球菌血清型的方法的特征為，用于上述雜交反應的探針，還可使用包含變形鏈球菌血清型c、e或f菌株的特異性的堿基序列中的、至少l2個連續堿基序列或該堿基序列的互補序列的寡核苷酸。優選的是，本發明的通過雜交反應鑒定變形鏈球菌血清型的方法的特征為，還可從被檢體的組織樣品中獲得染色體DNA或總RNA。優選的是，本發明的通過雜交反應鑒定變形鏈球菌的血清型的方法的特征為，上述組織樣品還可從血液、唾液或牙垢中獲得。優選的是，本發明的通過雜交反應鑒定變形鏈球菌的血清型的方法的特征為，還包含從唾液或牙垢中分離菌的步驟。根據上述組成，在特異性檢測變形鏈球菌的血清型c、e或f菌株的特異性多糖類葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株時，可提供優異的鑒定變形鏈球菌血清型的方法。艮P，根據上述組成，對具有新型血清型的變形鏈球菌菌株的血清型特異多糖抗原的生物合成重要的酶進行檢測，即可知該新型血清型菌株的存在。艮口，為解決上述課題，本發明的變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株的檢測方法，其特征在于，包含使用上述抗體進行免疫反應的歩驟。優選的是，本發明的檢測被檢樣品中變形鏈球菌菌株的方法，其特征在于，包含從被檢樣品中分離細菌的步驟；孵育上述分離后的細菌和權利要求9中所述的抗體的步驟；及檢測與上述抗體結合的細菌的步驟。根據上述組成，可提供對具有新型血清型變形鏈球菌有效的檢測方法。艮口，本發明的被檢樣品中變形鏈球菌菌株的血清型鑒定方法，其特征在于，使用檢測上述變形鏈球菌菌株的方法。艮P，為解決上述課題，本發明的通過PCR反應、鑒定S.mutans血清型的方法，其特征在于，作為用于上述PCR反應的引物，可以使用包含S.mutans血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的S.mutans菌株的特異性堿基序列或該堿基序列的互補序列的寡核苷酸，同時，上述特異性堿基序列，是序列號14中任一項所示的堿基序列中至少12個連續的堿基序列。優選的是，本發明通過PCR反應鑒定變形鏈球菌血清型的方法的特征為，用于上述PCR反應的引物，還可使用包含變形鏈球菌的血清型c、e或f菌株的特異性堿基序列中、至少l2個連續堿基序列或該堿基序列的互補序列的寡核苷酸。優選的是，本發明的通過PCR反應鑒定變形鏈球菌血清型的方法的特征為，還可從被檢體的組織樣品中獲得染色體DNA或總RNA。優選的是，本發明的通過PCR反應鑒定變形鏈球菌血清型的方法的特征為，上述組織樣品還可從血液、唾液或牙垢中獲得。優選的是，本發明的通過PCR反應鑒定變形鏈球菌血清型的方法的特征為，還包含從唾液或牙垢中分離菌的步驟。根據上述組成，可提供在特異性檢測變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株上優異的、鑒定變形鏈球菌血清型的方法。艮P，為解決上述課題，本發明變形鏈球菌菌株的血清型的鑒定方法，其特征在于，使用與變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株特異性結合的抗體。優選的是，本發明的鑒定變形鏈球菌菌株的血清型的方法的特征為，進一步使用與變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株特異性結合的抗體。根據上述組成，可提供在特異性檢測變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株上優異的、鑒定變形鏈球菌血清型的方法。艮P，本發明變形鏈球菌菌株的篩選方法，其特征在于，使用上述檢測變形鏈球菌菌株的方法。艮P，本發明的變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株的篩選方法，其特征在于，使用上述的多核苷酸或其片段。優選的是，本發明的變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株的篩選方法的特征為，上述多核苷酸或其片段用于PcR反應。優選的是，本發明的變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株的篩選方法的特征為，上述多核苷酸或其片段用于雜交反應。優選的是，木發明的變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株的篩選方法，使用上述的抗體。根據上述組成，可提供變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株的優異的篩選方法。艮P，本發明的變形鏈球菌菌株，其特征在于，由上述的篩選方法獲得。即，本發明的變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株，其特征在于，通過上述篩選方法分離。根據上述組成，可提供新篩選的變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株。艮P，為解決上述課題，本發明的變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株，其特征在于，通過上述篩選方法篩選。根據上述組成，可進一步提供具有新型血清型的變形鏈球菌菌株。即，用于檢測本發明的變形鏈球菌菌株的試劑盒，其特征在于，具備上述的寡核苷酸。本發明的用于檢測變形鏈球菌菌株的試劑盒中，上述寡核苷酸，優選為由序列號9中所示的堿基序列組成的寡核苷酸。本發明的用于檢測變形鏈球菌菌株的試劑盒中，優選進一步具備由序列號8中所示的堿基序列組成的寡核苷酸。本發明的用于檢測變形鏈球菌菌株的試劑盒中，優選進一步具備由序列號io中所示的堿基序列組成的寡核苷酸。本發明的用于檢測變形鏈球菌菌株的試劑盒，優選用于PCR反應或雜交反應。艮P，為解決上述課題，本發明的用于鑒定變形鏈球菌菌株血清型的試劑盒，其特征在于，具備包含變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株的特異性堿基序列或該堿基序列的互補序列的寡核苷酸，同時，上述特異性堿基序列，是序列號14中任一項所示的堿基序列中的至少12個連續堿基序列。優選的是，本發明的用于鑒定變形鏈球菌菌株血清型的試劑盒的特征為，還具備包含對變形鏈球菌的血清型c、e或f菌株特異性的堿基序列的至少12個連續堿基序列或其互補序列的寡核苷酸。優選的是，本發明的用于鑒定變形鏈球菌菌株血清型的試劑盒的特征為，還包含用于從被檢體的組織樣品中獲得染色體DNA或總RNA的試劑。優選的是，本發明的用于鑒定變形鏈球菌菌株血清型的試劑盒的特征為，上述組織樣品還可從血液、唾液或牙垢中獲得。優選的是，本發明的用于鑒定變形鏈球菌菌株血清型的試劑盒的特征為，還包含用于從唾液或牙垢中分離菌的試劑。優選的是，本發明的用于鑒定變形鏈球菌菌株血清型的試劑盒的特征為，還包含用于PCR反應的試劑。優選的是，本發明的用于鑒定變形鏈球菌菌株血清型的試劑盒的特征為，還包含用于雜交反應的試劑。優選的是，本發明的用于鑒定變形鏈球菌菌株血清型的試劑盒的特征為，上述寡核苷酸還被標記。根據上述組成，可提供在特異性檢測變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株上優異的、用于鑒定變形鏈球菌血清型的試劑盒。艮口，根據上述組成，對具有新型血清型的變形鏈球菌菌株特異性多糖抗原的生物合成重要的酶，檢測編碼此酶的基因的存在，即可知該新型血清型菌株的存在。艮口，為解決上述課題，本發明的用于鑒定變形鏈球菌菌株血清型的試劑盒，其特征在于，具備與變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株特異性結合的抗體。優選的是，本發明的用于鑒定變形鏈球菌菌株血清型的試劑盒，其特征在于，具備與具有新型血清型的變形鏈球菌菌株特異性結合的上述抗體。根據上述組成，可提供對具有新型血清型變形鏈球菌菌株檢測有效的試劑盒。優選的是，本發明的用于鑒定變形鏈球菌菌株血清型的試劑盒，其特征在于，還具備與變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株的多糖抗原特異性結合的抗體。根據上述組成，可提供特異性檢測變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株，即具有新型血清型的變形鏈球菌菌株優異的、用于鑒定變形鏈球菌血清型的試劑盒。艮P，為解決上述課題，本發明的抗體的制造方法，其特征在于，是改良以往的免疫方法的方法。一方面，本發明的抗體的制造方法，優選包含將懸浮于磷酸緩沖生理鹽水的上述變形鏈球菌菌株連續5日進行兔耳緣靜脈注射的步驟。本發明的抗體的制造方法，優選進一步包含間隔一星期后，再在2星期內，每星期5日反復注射懸浮于磷酸緩沖生理鹽水中的上述變形鏈球菌菌株的步驟。根據上述方法，可提供與變形鏈球菌血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的變形鏈球菌菌株，即具有新型血清型的變形鏈球菌菌株特異性結合的抗體的制造方法。根據上述組成，可提供對于用以往的免疫方法未能獲得的、具有新型血清型變形鏈球菌的表面抗原的抗體。艮口，本發明的細菌檢測器具，其特征在于，包含具有新型血清型變形鏈球菌菌株的特異性堿基序列或其互補序列的寡核苷酸固定于載體上。優選的是，本發明的細菌檢測器具中，上述堿基序列的特征為，其是對于具有新型血清型變形鏈球菌菌株特異性多糖抗原的生物合成重要的酶進行編碼的多核苷酸堿基序列的至少l2個連續堿基序列。根據上述組成，可檢測鑒定樣品中含有的具有新型血清型的變形鏈球菌菌株。還可根據上述組成，進行樣品中含有的變形鏈球菌菌株的全面檢査。本發明進一步的其他的目的、特征、及優點，根據以下所示的記載可十分明了。且本發明的益處，在參照附圖的如下的說明中也會十分清楚。圖lAE是S.mutansTW295菌株的特異性抗血清及TW871菌株的特異性抗血清與由TW295菌株、TW871菌株、c型菌株、e型菌株及f型菌株制備的RANTU-RANDOR(RR)抗原反應的示意圖。圖2AC是S.mutans中PA、CA—GTF及CF—GTF表達的Western印跡法結果的示意圖。圖3AB是S.mutans的口腔分離菌株及血液分離菌株吞噬率的示意圖。圖4是通過比較S.mutans的血清型c型和k型中的rgpF基因前半部的堿基序列，表示突變存在的示意圖。圖5是S.mutans的血清型c型和k型中的rgpF基因前半部堿基序列的比較圖，表示圖4的延續。圖6是S.mutans的血清型c型和k型中的rgpF基因前半部堿基序列的比較圖，表示圖5的延續。圖7是S.mutans的血清型c型和k型中的rgpF基因前半部堿基序列的比較圖，表示圖6的延續。圖8是S.mutans的血清型c型和k型中的rgpF基因前半部堿基序列的比較圖，表示圖7的延續。圖9是S.mutans的血清型c型和k型中的rgpF基因前半部堿基序列的比較圖，表示圖8的延續。圖lO是S.mutans的血清型c型和k型中的rgpF基因前半部堿基序列的比較圖，表示圖9的延續。圖11是S.mutans的血清型c型和k型中的rgpF基因前半部堿基序列的比較圖，表示圖10的延續。圖l2是S.mutans的血清型c型和k型中的rgpF基因前半部堿基序列的比較圖，表示圖l1的延續。圖13是S.mutans的血清型c型和k型中的rgpF基因前半部堿基序列的比較圖，表示圖l2的延續。圖14是使S.mutans的血清型c型和k型中的堿基序列聯配，比較rgPF基因前半部堿基序列的示意圖。圖l5是最佳PCR條件的示意圖。圖16是稀釋從MT8148菌株(c型)、TW295菌株(k型)及FTl菌株(k型)提取的基因組DNA，以此為模板，使用血清型特異性引物進行PCR擴增，從而求出檢測靈敏度結果的示意圖。圖17AB是以從各種血清型的S.mutans菌株及各種鏈球菌中提取的基因組DNA為模板，使用血清型特異性引物進行PCR擴增的結果示意圖。圖l8AB是以唾液樣品中提取的基因組DNA為模板，使用血清型特異性引物進行PCR擴增的結果示意圖。圖19AB表示S.mutans中CA_GTF表達及CF—GTF表達的Western免疫印跡的檢測。具體實施例方式以下詳細說明本發明的一實施方式，但本發明不限于以下的記載。1(1)血清型k的S.mutans菌株S.mutans，有時能從患感染性心內膜炎的患者的血液中分離，但其侵入機制及生存機制還有不明之處。從患菌血癥或感染性心內膜炎患者得到的4株血液分離菌株中的2株(TW295菌株及TW871菌株)，經過免疫沉淀試驗，在血清學上還不確定。對于上述血清型未確定菌株使用抗血清進行免疫擴散分析，從l0O人的被檢體中得到的l0O菌株口腔分離菌株中，有2株顯示了陽性反應。再對從50人的被檢體中得到的250O菌株的口腔分離菌株進一歩進行免疫擴散分析，從單一患者得到的5Q個分離菌株，全部未與抗c型抗血清、抗e型抗血清、及抗f型抗血清反應，而與抗TW295抗血清及抗TW871抗血清反應。這些菌株顯示了與對照菌株S.mutans菌株MT8148同樣的生物學特性[例如，高水平的蔗糖依賴性粘附及菌體疏水性、以及葡萄糖基轉移酶及蛋白質抗原(PA)的表達]。本發明者等將此生物命名為血清型k。本發明者等從人體的血液樣品及口腔樣品中分離出血清型k的新型S.mutans菌株，并賦予其特征。發現了血清型k菌株的血清學特征與MT8148的g1uA失活突變株(MT8148GD)的特征同樣。血清型k的口腔分離菌株與血液分離菌株及MT8148GD同樣，對吞噬作用顯示了抵抗性。這些結果表明，S.mutans血清型k菌株不僅存在于人體的口腔內，還因其對吞噬作用感受性低，所以可生存于血液中。MT8148GD對玻璃表面的蔗糖依賴性粘附、對唾液被覆的羥基磷灰石的非蔗糖依賴性粘附、葡聚糖結合活性、及細胞結合型(cell-associated)葡萄糖基轉移酶(GTF)活性等的生物學特性，比其親本MT8148菌株顯著低下。而且，Western印跡分析顯示出，血清型k中GTFB/GTFC的表達率比雖較MT8148有所減少，但對于大鼠的齲齒誘發能力，MT8148、MT8148GD及血清型k的口腔分離菌株之間程度相同。上述結果表明，S.mutans的血清型特異性多糖中葡萄糖側鏈的缺失可與齲齒的誘發能力相關，但比其他主要的表面蛋白質(例如，GTF、PAc等)的程度低。本發明中，通過對以往的免疫方法加以改良，獲得了血清型k的S.mutans菌株的抗血清。特定與S.mutans菌株血清型特異多糖抗原生物合成有關的基因群的序列，比較血清型k和己知菌株的結果，鑒定了與血清型k的S.miitans菌株共存的rgpF基因的序列突變。(A)多核苷酸本發明提供編碼使變形鏈球菌特異性多糖抗原葡萄糖側鏈量降低的多肽的多核苷酸。在本說明書中使用時，"使變形鏈球菌特異性多糖抗原葡萄糖側鏈量降低的多肽"可與"參與血清型k的S.mutans菌株特異性多糖抗原生物合成的多肽"或"參與血清型k的S.mutans菌株血清型特異多糖抗原生物合成的多肽"互換使用。在一實施方式中，本發明提供具有序列號14中任一項所示的堿基序列的多核苷酸或其片段。在本說明書中使用時，術語"多核苷酸"可與"核酸"或"核酸分子"交換使用，指核苷酸的聚合體。在本說明書中使用時，術語"堿基序列"可與"核酸序列"或"核苷酸序列"交換使用，作為脫氧核糖核苷酸(省略為A、G、C及T)的序列表示。且"包含序列號14中任一項所示的堿基序列的多核苷酸或其片段"，是指包含由序列號i4的各脫氧核苷酸A、G、C及/或T表示的序列的多核苷酸或其片段部分。本發明涉及的多核苷酸，可以RNA(例如mRNA)的形態或DNA的形態(例如，cDNA或基因組DNA)存在。DNA可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈(也稱為有義鏈)，或其也可以是非編碼鏈(也稱為反義鏈)。在本說明書中使用時，術語"寡核苷酸"是指數個數十個核苷酸結合而成，可與"多核苷酸"交換使用。寡核苷酸中短的被稱為二核苷酸(二聚物)、三核苷酸(三聚物)，長的用30鏈節(mers)或l00鏈節聚合的核苷酸數表示。寡核苷酸可作為更長的多核苷酸的片段生成，也可被化學合成。本發明的多核苷酸的片段，是指至少為l2nt(核苷酸)、優選為約l5nt、更優選至少約為20nt、且尤其優選至少約為30nt、最優選至少約為40nt長度的片段。例如，"序列號14中任一項所示的核苷酸序列的至少20nt長度的片段"，是指包含序列號14中任一項所示的核苷酸序列中的20或大于2O的連續堿基片段。參照本說明書，可提供序列號14中任一項所示的核苷酸序列，所以，本領域技術人員可容易地制備此種DNA片段。例如，通過限制性核酸內切酶切割或超聲波剪切，可方便地用于制備各種長短的片段。或此種片段可由合成制備。適合的片段(寡核苷酸)，可通過AppliedBiosystemsIncorporated(ABI,850LincolnCenterDr.,FosterCity,CA94404)392型合成儀等合成。本發明與是否編碼參與血清型k的S.mutans菌株特異性多糖抗原生物合成的多肽無關，與序列號14中任一項所示的堿基序列的至少12個連續序列或其互補序列組成的多核苷酸有關。特定的多核苷酸不編碼參與對血清型k的S.mutans菌株特異性多糖抗原生物合成涉及的多肽時，本領域技術人員應很容易理解，上述多核苷酸，例如可作為聚合酶鏈式反應(PCR)的引物、或雜交探針使用。因本發明的多核苷酸，可將編碼參與血清型k的S.mutans菌株特異性多糖抗原生物合成的多肽的多核苷酸進行特異性PCR擴增，所以，本發明的多核苷酸，還可作為與編碼參與血清型k的S.mutam菌株特異性多糖抗原生物合成的多肽的多核苷酸特異性雜交的雜交探針來利用。不編碼與血清型k的S.mutans菌株特異性多糖抗原生物合成有關的多肽的本發明多核苷酸的其他用途，可以舉出Verma等的HumanChromosomes:aManualofBasicTechniques,PergamonPress,NewYork(1988)中所述的，對用于提供正確的染色體位置的分裂中期染色體展開物的原位雜交(例如，FISH);及用于檢測參與特定組織中血清型k的S.mutans菌株特異性多糖抗原生物合成的多肽的mRNA表達的Northern印跡分析。例如，"長度至少為20nt"的多核苷酸的部分，是指參照的多核苷酸的核苷酸序列中20或大于20的相連的核苷酸。優選的實施方式中，本發明的此部分，作為通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行靶序列擴增用的引物，或作為按照以往的DNA雜交技術的探針，均在診斷上有用。另一方面，本發明提供，在嚴謹雜交條件下，包含上述本發明的多核苷酸(例如，由序列號14中任一項所示的堿基序列組成的多核苷酸)或其一部分雜交的多核苷酸的分離的多核苷酸。術語"嚴謹雜交條件"，是指在雜交溶液[含有50%甲酰胺、5XSSC(150mM的NaC1、15mM的檸檬酸三鈉)、50mM的磷酸鈉(pH7.6)、5X模板(Denhardt)溶液、10%硫酸葡聚糖、及20ug/m1的變性的剪切鮭魚精子DNA]中，42r培育一夜后，在約65°C，在0.1XSSC中洗滌雜交膜。與多核苷酸的"一部分"雜交的多核苷酸，是指與參照的多核苷酸的至少約15個核苷酸(nt)、優選至少約為20nt、更優選至少約為30nt、且最優選約為3070nt雜交的多核苷酸(DNA或RNA的任一個)。這些，作為本說明書中更詳細考察的、診斷用引物及診斷用探針是有用的。把參與血清型k的S.nrntans菌株血清型特異多糖抗原生物合成的多肽編碼的本發明的多核苷酸，不限于以下舉例根據其自身，把成熟多肽的氨基酸序列編碼的多核苷酸；成熟多肽的編碼序列及更多的序列(例如，編碼前導序列的序列)[例如，前體蛋白(preprotein)序列或原蛋白(proprotein)序列或前原蛋白(preproprotein)序列)；內含子、非編碼5'序列及非編碼3，序列[例如，轉錄、mRNA加工(包含拼接及多聚酰苷酸化信號)中起作用的轉錄非翻譯序列];把提供具有更多功能的更多氨基酸進行編碼的更多編碼序列。因此，例如把多肽編碼的序列，可與標記序列(例如，使融合的多肽的純化易進行的肽進行編碼的序列)融合。在本發明的此方面特定的優選實施方式中，標記氨基酸序列是六聚組氨酸肽[例如，pQE媒體(Qiagen，Inc.)中提供的標簽]，很多其他的可由公開的及/或商業性手段獲得。例如，如Gentz等，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)中所述，六聚組氨酸提供融合蛋白質的簡便的純化。"HA"標簽，是用于對來源于流感紅血球凝集素(HA)蛋白質的表位純化有用的其他的肽，其如Wilson等在Cell37:767(1984)中所述。其他的此種融合蛋白質，包含在N末端或C末端與Fc融合的、參與血清型k的S.mutans菌株特異性多糖抗原生物合成的多肽或其片段。把參與血清型k的S.mutans菌株血清型特異多糖抗原生物合成的多肽或其片段編碼的本發明涉及的多核苷酸，可與含有用于在宿主細胞中增殖的選擇性標記的載體結合。一般地，質粒載體導入如磷酸鈣沉淀物的沉淀物中，或與帶電的脂質復合的復合體中。另外，如下詳述，也可使用DEAE葡聚糖法、電穿孔法。載體是病毒時，載體可使用適當的包裝細胞株進行體外包裝后，轉導至宿主細胞。本發明還涉及把參與血清型k的S.mutans菌株血清型特異多糖抗原生物合成的多肽編碼的本發明多核苷酸突變體。突變體如天然的等位基因突變體一樣，可天然生成。"等位基因突變體"，是指占據生物染色體規定基因座的基因的一些可交替形式中的一個。非天然存在的突變體，例如可使用該領域中公知的誘變技術生成。這樣的突變體，包含由本發明的多核苷酸中l個或數個核苷酸經取代、缺失、或附加后生成的突變體。取代、缺失、或附加，可含有l個或大于l個的核苷酸。突變體可在編碼或非編碼區域、或其兩者中變化。編碼區域中的突變，可生成保留或非保留的氨基酸取代、缺失、或附加。所以，可以說，本發明涉及的多核苷酸，至少含有序列號14中任一項所示的堿基序列或其突變體即可。且本發明涉及的多核苷酸的堿基序列，可用適當的連接肽編碼的多核苷酸連接。艮P，本發明的目的是提供，把參與血清型k的S.mutans菌株特異性多糖抗原生物合成的多肽編碼的多核苷酸、及用于檢測該多核苷酸的多核苷酸(寡核苷酸)，但不局限于本說明書中具體記載的多核苷酸制備方法等。因此，必須注意，由上述各方法以外的方法獲得的把參與血清型k的S.mutans菌株特異性多糖抗原生物合成的多肽編碼的多核苷酸、及用于檢測該多核苷酸的多核苷酸(寡核苷酸)，也屬于本發明的范圍。(B)多肽本發明者等發現了新型血清型(k型)的S.mutans菌株，還發現了參與決定此血清型的多糖抗原生物合成酶中的一種，即rgpF中存在著突變。在本說明書中使用時，術語"多肽"可與"肽"或"蛋白質"交換使用。且多肽的"片段"是指該多肽的部分片段。本發明涉及的多肽，可從天然供給源分離，也可化學合成。術語"被分離"的多肽或蛋白質，是指由其天然環境中獲取的多肽或蛋白質。例如，在宿主細胞中表達重組產生的多5t及蛋白質，與通過任意的適當的技術、實質上被純化的天然或重組的多肽及蛋白質同樣，可認為是被分離。本發明涉及的多肽，包含天然的純化產物、化學合成工序的產物、及由原核生物宿主或真核生物宿主(例如，包含細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆蟲細胞、及哺乳動物細胞)通過重組技術產生的產物。根據重組產生工序中使用的宿主，本發明涉及的多肽可糖基化，或非糖基化。而且本發明涉及的多肽，在一些情況下，其宿主介導過程的結果，還可包含改變起始的蛋氨酸殘基。一方面，本發明提供k型S.mutans菌株的rgpF多肽。在本說明書中使用時，"k型S.mutans菌株的rgpF多肽"，是指參與新型血清型k的S.mutans菌株多糖抗原生物合成酶的rgpF多肽。在一種的實施方式中，本發明提供通過序列號14中任一項所示的堿基序列編碼的多肽。本發明優選的多肽，可以舉出含在成熟多肽、細胞外結構域、跨膜結構域、細胞內結構域、或跨膜結構域的全部或一部分缺失的細胞外及細胞內結構域的多肽。本發明還進一步提供實質上顯示了k型S.mutans菌株rgpF多肽活性的k型S.mutans菌株的rgpF多肽的突變體。在一種實施方式中，本發明提供由序列號14中任一項所示的堿基序列編碼的多肽中，1個或數個氨基酸取代、附加或缺失了的，顯示k型S.mutans菌株的rgpF多肽活性的多肽的突變體。在本說明書中使用時，術語"k型S.mutans菌株的rgpF多肽活性"，是指參與公知的血清型S.mutans菌株中不存在的多糖抗原，即，k型S.mutans菌株特異性多糖抗原生物合成的rgpF多肽的特征。這種突變體包含缺失、插入、倒位、重復、及類型(type)取代[例如，親水性殘基被其他殘基取代(通常強親水性殘基不被強疏水性殘基取代)]。"中性"氨基酸取代，一般基本上不影響活性。多肽的氨基酸序列中的一些氨基酸，不顯著影響此多肽的結構或功能，易被改變，在該領域是眾所周知的。而且，不僅可人為改變，而且，在天然蛋白質中存在不使該蛋白質的結構或功能發生顯著變化的突變體，也是眾所周知的。本領域技術人員使用眾所周知的技術，可容易地使多肽的氨基酸序列中1個或數個氨基酸產生突變。例如，根據公知的點突變導入法，可使編碼多肽的多核苷酸的任意堿基產生突變。另外，設計對應編碼多肽的多核苷酸的任意部位的引物，可制備缺失突變體或附加突變體。而且，使用本說明書中記載的方法，可很容易地鑒定出所制備的突變體是否具有所希望的活性。優選的突變體具有保留或非保留的氨基酸取代、缺失、或附加。優選的是沉默取代、附加、及缺失，特別優選的是保留取代。上述這些的其k型S.mutans菌株的rgpF多肽活性不發生變化。被認為是代表性的保留取代，是脂肪族氨基酸A1a、Va1、Leu、及I1e中1個氨基酸被其他的氨基酸取代；羥基殘基Ser及Thr的取代、酸性殘基Asp及G1u的取代、酰胺殘基Asn及G1n之間的取代、堿性殘基Lys及Arg的取代、以及芳香族殘基Phe、Tyr之間的取代。如上詳述，哪一種氨基酸的變化可能是沉默表達型(g卩，是否可能會對功能具有顯著的有害作用)，關于這一點的進一步的指導，可參考Bowie，J.U.VDecipheringtheMessageinProteinSequences:TolerancetoAminoAcidSubstitutions",Science247:1306—1310(1990)(在本說明書中作為參考引用)。其他方面，本發明涉及的多肽，可通過融合蛋白質的被改變的形態重組表達。例如，附加的氨基酸，特別是帶電氨基酸區域，為改善宿主細胞內的純化期間或繼續純化操作及保存期間的穩定性及持續性，可在多肽的N末端在特定的情況下，本發明涉及的k型S.mutans菌株的rgpF多肽，例如，可將編碼使融合多肽的純化容易進行的肽的序列的標簽[標簽(tag)序列或標記物(marker)序歹!j]附加到N末端或C末端。此類序列可在多肽的最終制備前除去。本發明此方面的特定優選實施方式中，標簽(tag)氨基酸序列是六聚組氨酸肽[例如，pQE載體(Qiagen，Inc.)提供的標簽(tag)]，其中，多數可通過公開的及/或商業手段獲得。例如，如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821_824(1989)(本說明書中也作為參考引用)中所述，六聚組氨酸提供融合蛋白質的簡便的純化。"HA"標簽，是用于對來源于流感紅血球凝集素(HA)蛋白質的表位純化有用的另一種肽，其如Wi1son等，Cell37:767(1984)(本說明書中也作為參考引用)中所述。其他的融合蛋白質，包含在N或C末端與Fc融合的、本實施方式涉及的k型S.mutans菌株的rgpF多肽或其片段。本發明涉及的k型S.mutans菌株的rgpF多肽，可按如下詳述重組生成，也可化學合成。重組生成可使用該領域中眾所周知的方法進行，例如，可使用以下詳述的載體及細胞。合成肽可使用化學合成的公知的方法合成。例如，Houghten記載的用不滿4個星期制備的，且賦予特征的HA1多肽片段的單一氨基酸改變體，合成l020mg的248不同的13殘基肽的多數肽的簡單方法。Houghten，R.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5131—5135(1985)。此"SimultaneousMultiplePeptideSynthesis(SMPS)"方法，還在Houghten等(1986)的美國專利第4，631，21l號中作了記載。此方法中，用于各種肽固相合成的各種樹脂，包含于各自的溶劑滲透性袋中，在與固相法相關聯的多個相同的重復步驟中得到最佳使用。完整的使用方法，可同時進行5001000或大于1000的合成(Houghten等，前面已出現，5134)。這些文獻在本說明書中也作為參考引用。一方面，本發明涉及具有本說明書中所述的k型S.mutans菌株rgpF多肽表位攜帶部分的氨基酸序列的多肽。具有本發明k型S.mutaris菌株rgPF多肽表位攜帶部分的氨基酸序列的多肽，含有至少具有6個、7個、8個、9個、1O個氨基酸的多肽部分，還包含由序列號14中任一項所示的堿基序列編碼的、到本發明k型S.mutans菌株的rgpF多肽的全氨基酸序列長度為止、任意長度(包含全體)的表位攜帶部分的多肽。本發明k型S.mutans菌株rgpF多肽的表位部分，用該領域公知的方法鑒定。例如，Geysen等(1984)公開了，將用于酶聯免疫吸附試驗反應的十分純的幾百個肽同時于固相載體上迅速合成的手法。因與合成肽的抗體相互作用，故不需將其從載體上除去，即可方便地檢測。此種方式中，攜帶所希望的蛋白質免疫原性表位的肽，易被本領域技術人員鑒定。例如，口蹄疫病毒外殼蛋白的免疫學上重要的表位，是由Geysen等通過覆蓋蛋白質213個氨基酸序列全體的全部208個可能的六肽的重複組(set)的合成，由7個氨基酸的解明而定位。之后，全部2O個氨基酸按順序在表位內的各位置，合成被取代的肽的完整取代組(set)，且鑒定了賦予抗體反應特異性的特定氨基酸。因此，本發明的表位攜帶肽的肽信號，可通過此方法日常地制備。Geysen(1987)的美國專利第4,708,781號，進一步記載了此鑒定攜帶所需蛋白質免疫原性表位的肽的方法。"免疫原性表位"定義為，蛋白質全體為免疫原時，誘發抗體應答的蛋白質的一部分。這些免疫原性表位，被限制在分子上的2、3個位點。同時，抗體可結合的蛋白質分子的區域，被定義為"抗原性表位"。蛋白質的免疫原性表位的數量，一般比抗原性表位的數量少。例如，可參照Geysen,H.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002(1984)。本發明的抗原性表位攜帶肽，在激發含有與本發明的多肽特異性結合的單克隆抗體的抗體上有用。因此，由用抗原表位攜帶肽免疫的供體的脾臟細胞融合所獲得的雜交瘤的大部分，一般分泌與天然蛋白質具有反應性的抗體。由抗原性表位攜帶肽激發的抗體，對檢測模擬蛋白質有用，而對于不同的肽的抗體，可在追蹤接受了翻譯后加工的蛋白質前體各種區域的蹤跡時使用。在免疫沉淀試驗中，既可與短肽(例如，約9個氨基酸)，又可與更長的肽結合、取代，所以，肽及抗肽抗體，可用于模擬蛋白質的各種定性的或定量的檢觀!J，例如，在競爭試驗中使用。例如，參照Wilson,I.A.等，Cell37:767-778(1984)777。本發明的抗肽抗體，還在模擬蛋白質的純化(例如，使用該領域中眾所周知的方法，通過吸附色譜法)中有用。根據上述指導設計的本發明的抗原性表位攜帶肽，優選包含在本發明的多肽的氨基酸序列中含有的至少7個，更優選至少為9個，最優選為約15約30個氨基酸之間的序列。但是，包含本發明多肽的氨基酸序列約30約50個氨基酸或到全體為止的任意長度及全體的長度，含有本發明多肽的氨基酸序列更大部分的肽或多肽，也是本發明的表位攜帶肽，且在誘導與模擬蛋白質反應的抗體時有用。表位攜帶肽的氨基酸序列，優選在水性溶劑中選擇時，提供實質性溶解性的(即，其序列含有較親水性殘基，且優選避免高度疏水的序列)；而且特別優選含有脯氨酸殘基的序列。使用本發明多核苷酸的重組方式，通過制備包含上述方式的肽時使用的任意以往的手段，可產生本發明的表位攜帶肽。例如，短的表位攜帶氨基酸序列，在重組體產生及純化過程中、以及在用于產生抗肽抗體的免疫過程中，能與作為載體起作用的更大的多肽融合。表位攜帶肽還可使用化學合成的公知的方法合成。本發明的表位攜帶肽，可通過該領域眾所周知的方法，在誘導抗體時使用。例如，參照Chow,M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:910-914;及Bittle,F.J.等，J.Gen.Virol.66:2347-2354(1985)。一般地，動物可用游離肽免疫；但是，抗肽抗體的效價，可通過將肽與高分子載體[例如，鑰孔血藍素(keyholelimpethaemocyanm)(KLH)或破傷風類毒素]偶聯，進行加強免疫。例如，含有胱氨酸的肽，可使用間一馬來酰亞胺苯酰基(maleimidebenzoyl)—N一羥基琥珀酰亞胺酯(hydoxysuccinimideester)(MBS)鏈節(U>力隱)與載體偶聯，另外，其他的肽可使用如戊二醛等更一般的連接劑與載體偶聯。兔子、大鼠及小鼠等動物，是使用游離或載體偶聯肽的任一種，例如，含有約100Pg的肽或載體蛋白質及福式(Freund)佐劑的油質乳劑，通過腹腔內及/或皮內注射進行免疫。一些加強免疫注射，例如為使用吸附于固體表面的游離肽，提供可由ELISA試驗檢測的有用效價的抗肽抗體，例如，約需間隔2星期。免疫動物的血清中抗肽抗體的效價，通過抗肽抗體的選擇，例如，可根據該領域眾所周知的方法，通過肽在固相載體上的吸附及選擇的抗體的洗脫，可得以增加。(C)載體及細胞本發明涉及用于生成k型S.mutans菌株的rgpF多肽的載體。本發明涉及的載體，可以是用于體外翻譯的載體，也可以是用于重組表達的載體。本發明還涉及，用于重組生成本發明涉及的k型S.mutans菌株rgpF多肽的，通過用含有本發明涉及的多核苷酸的重組構建物轉化的宿主細胞及重組技術，產生k型S.mutans菌株的rgpF多肽或其片段的方法。重組構建物可使用感染、轉導、轉染、電穿孔法、及轉化的眾所周知的技術導入宿主細胞。作為重組構建物的載體，例如，可以是噬菌體載體、質粒載體、病毒載體、或反轉錄病毒載體。反轉錄病毒載體可以復制或復制缺損。為后者時，病毒的增殖一般只在互補宿主細胞中產生。把以表達為目的的多肽加以編碼的多核苷酸，可使用該領域中眾所周知的方法獲得。公知的蛋白質的部分序列，可對所需位點設計引物，通過PCR擴增，獲得對應的多核苷酸后，插入表達載體，即可在細胞內容易地獲得。對目的插入多核苷酸具有順式作用調控區域的載體是優選的。適當的反式作用因子，可由宿主供給，可由互補載體供給，或可由向宿主導入時載體自身供給。在特定的實施方式中，載體，優選的是提供具有誘導性及/或細胞特異性的特異性表達的載體。此種載體中特別優選的載體，是通過操作容易的環境因子，如溫度及營養添加物調節的誘導性載體。本發明中有用的表達載體，可例舉為是染色體載體、附加型載體、及來源于病毒的載體[例如，細菌質粒、噬菌體(bacteriophage)、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒(例如，桿狀病毒(Baculovirus)、乳多空病毒(papovavirus)、牛痘病毒(Vacciniavirus)、腺病毒(Adenovirus)、鳥痘病毒(poxvirus)、偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus)、及反轉錄病毒(retrovirus)]、以及來源于其組合的載體[例如，粘粒及噬菌粒(phagmid)]。DNA插入物，應與適合的啟動子(例如，噬菌體APL啟動子、E.c01i1ac啟動子、trp啟動子、及tac啟動子、SV40早期啟動子及晚期啟動子、以及反轉錄病毒LTR的啟動子)可起作用地連接。其他適當的啟動子，為本領域技術人員公知。表達構建物，包含用于轉錄開始、轉錄終止的部位、及轉錄區域中用于翻譯的核糖體結合部位。由構建物表達的成熟轉錄物的編碼部分，包含應被翻譯的多肽在開始時的轉錄起始密碼子，且包含終止時位于適當位置的終止密碼子。表達載體，優選至少含有l個選擇性標記。此種標記，可例舉為真核生物細胞培養時的雙氫葉酸還原酶或新霉素抗性基因、E.co1i及其他的細菌培養時的四環素抗性基因或氨芐青霉素抗性基因。適合的宿主的代表例，可例舉為細菌(例如E.co1i細胞、Streptomyces細胞、及Salmonellatyphimurium細胞)；真菌細胞(例如酵母細胞)；昆蟲細胞(例如Drosophi1aS2細胞及SpodopteraSf9細胞)；動物細胞[例如，CHO細胞、COS細胞、及Bowes黑素瘤細胞(melanomacells)];以及植物細胞。用于上述宿主細胞的適當的培養培養基及條件，是該領域眾所周知的。優選的實施方式中，本發明涉及的載體，可表達細菌(特別是E.co1i)中本發明涉及的k型S.mutans菌株的rgpF多肽。細菌中優選使用的載體中，包含PQE70、pQE60、及pQE—9(可由Qiagen獲得)；pBS載體、Phagescript載體、B1uescript載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(可由Stratagene獲得)；以及ptrc99a、pKK223—3、pKK233—3、pDR540、pRIT5(可由Pharmacia獲得)。適于本發明中使用的公知的細菌啟動子，包含E.co1iacI及lacZ啟動子、T3啟動子及T7啟動子、gpt啟動子、XPR啟動子及APL啟動子、以及trp啟動子。適合的真核生物啟動子，可例舉為CMV即刻早期啟動子、HSV胸腺嘧啶核苷激酶啟動子、早期SV40啟動子及晚期SV40啟動子、反轉錄病毒LTR的啟動子[例如，勞斯肉瘤病毒(Roussarcomavirus)(RSV)的啟動子]、以及金屬巰基組氨酸三甲基內鹽(metallothionneine)啟動子(例如，小鼠金屬巰基組氨酸三甲基內鹽I啟動子)。其他的實施方式中，本發明涉及的載體，可表達高等真核生物細胞中本發明涉及的k型S.mutans菌株的rgpF多肽。高等真核生物細胞DNA的轉錄，可通過在載體中插入增強子序列來使其增大。為使所需的宿主細胞中啟動子的轉錄活性增大，增強子通常為約l0300bp的DNA的順式作用元件。增強子可例舉為，SV40增強子(其位于復制起點的晚期側上的100270bp處)、巨細胞病毒的早期啟動子增強子、復制起點的晚期側上的多瘤病毒增強子、及腺病毒增強子。優選的真核生物的載體，可例舉為pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、及pSG(可由Stratagene獲得)；以及pSVK3、pBPV、pMSG、及pSVL(可由Phrmacia獲得)。其他適合的載體，是本領域技術人員眾所周知的。向宿主細胞的構建物的導入，可通過磷酸鈣轉染、DEAE葡聚糖介導轉染、陽離子脂質體介導轉染、電穿孔法、轉導、感染或其他的方法進行。這些方法在如Davis等，BasicMethodsInMolecularBiology(1986)(在本說明書中作為參考引用)的很多標準化研究室使用指南中均有所記載。通過高等真核生物的DNA的轉錄，可通過在載體中插入增強子序列而使其增大。為使所需的宿主細胞中啟動子的轉錄活性增大，增強子通常為約10300bp的DNA的順式作用元件。增強子，可例舉為SV4O增強子(其位于復制起點的晚期側的100270bp處)、巨細胞病毒的早期啟動子增強子、復制起點的晚期側上的多瘤病毒增強子、及腺病毒增強子。為向翻譯后的蛋白質內質網的內質網內腔、或周質空間內、或細胞外環境分泌適宜的分泌信號，可整合進表達的多肽中。信號對于多肽可以是內因性的，或其還可以是異種信號。因此，多肽可以融合蛋白質的被改變了的形態表達，并且不僅可包含分泌信號，還可包含附加的異種功能區域。例如，附加的氨基酸、特別是帶電氨基酸區域，為改善宿主細胞內、純化過程中、或繼續操作及保存期間的穩定性及持續性，可附加于多肽的N末端。另外，為使純化容易進行，可向多肽附加肽部分。這樣的區域，可在多肽的最終制備前除去。尤其是，為產生分泌或排出、改善穩定性、及使純化容易進行的肽部分向多肽的附加，是在本領域為人所知、日常的技術。優選的融合蛋白質，包含來源于對蛋白質可溶化有用的免疫球蛋白的異種區域。例如，EPA0464533(另外，對應加拿大的申請2045869)公開了，在其他的人體蛋白質或其一部分，同時，在免疫球蛋白分子中含有恒定區的各種部分的融合蛋白質。很多情況下，融合蛋白質中的Fc部分，對治療及診斷中使用十分有利，因此，例如產生改善了的藥物動態學的特性(EPA0232262)。另外，對于一些使用如記載的有利形式中，融合蛋白質優選在表達、檢測、及純化后，Fc部分缺失。這是因為Fc部分在治療及診斷中，成為使用中的障礙(例如，融合蛋白質應作為免疫用抗原使用時)。在藥物探索中，例如hIL—5的人體蛋白質，為了用于鑒定hIL—5拮抗物的、高處理能力的篩選檢測，可與Fc部分融合。參照D.Bennett等，JournalofMolecularRecognitionVol.8:52-58(1995)、及K.Johanson等，TheJournalofBiologicalChemistryVol.270，No.16，9459-9471頁(1995)。k型S.mutans菌株的rgpF多肽，可根據眾所周知的方法(例如，硫酸銨沉淀或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜法、磷酸纖維素色譜法、疏水作用色譜法、親和層析法、羥基磷灰石色譜法、及外源凝集素色譜法)從重組細胞培養物中回收、純化。最優選使用高效液相色譜法("HPLC")純化。因此，本發明涉及的載體，至少含有本發明涉及的多核苷酸即可。艮P，還應注意，表達載體以外的載體也包含于本發明技術范圍內。另夕卜，本發明涉及的細胞，可以說至少包含本發明涉及的載體即可。艮口，還應注意市場銷售的細胞以外的初代培養細胞，也包含于本發明的技術范圍內。也就是說，本發明的目的，是提供含有本發明涉及的多核苷酸的載體、及含有該載體的細胞，而并非本說明書中具體記載的各種載體種及細胞種、以及載體制備方法及細胞導入方法。因此，必須注意，使用上述以外的載體種及細胞種、以及載體制備方法及細胞導入方法獲得的載體及細胞，也屬于本發明的范圍。(D)細菌本發明提供分離的血清型k的S.mutans菌株。本發明血清型k的S.mutans菌株，優選使用以下詳述的、與血清型k的S.mutans菌株特異性結合的抗體，由生物學樣品分離。優選的血清型k的S.謹tans菌株，可例舉為血液分離菌株2菌株(TW295及TW871)、口腔分離菌株154菌株(FT1FT51、SU1SU51、及YK1YK50、以及AT1及YT1)，但不限于此。術語"生物學樣品"，是指可從個體、體液、細胞株、組織培養物、或血清型k的S.mutans菌株蛋白質或含有其DNA或mRNA的其他的供給源中獲得的、任意的生物學樣品。生物學樣品，可例舉為含有血清型k的S.mutans菌株蛋白質的體液(例如血液、唾液、牙垢、血清、血漿、尿、滑液及髓液)或具有表達血清型k的S.mutans菌株蛋白質可能性的組織供給源。在本說明書中使用時，術語"組織樣品"，是指由組織供給源中獲得的生物學樣品。用于從哺乳動物中獲得組織活檢及體液的方法，是該領域眾所周知的。生物學樣品含有mRNA時，組織活檢是優選的供給源。在本說明書中使用時，術語"樣品"也可例舉為，在上述生物學樣品及上述組織樣品以外，從上述生物學的樣品及上述組織樣品中提取的基因組DNA樣品及/或總RNA樣品。一方面，本發明提供S.mutans的血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的S.mutans菌株。在本說明書中使用時，術語"S.mutans的血清型c、e或f的菌株特異性多糖類的葡萄糖側鏈量降低"，是指使用S.mutans的血清型c、e或f菌株特異性的已知的抗體不能檢出之意。因此，參照本說明書，此術語不是指完全沒有S.mutans的血清型c、e或f菌株特異性多糖抗原的葡萄糖側鏈，而是指對于S.mutans的血清型c、e或f菌株特異性已知的抗體，其抗原性顯著降低了的狀態，本領域技術人員應容易理解。(E)抗體本發明提供與S.mutans的血清型c、e、或f菌株特異性多糖抗原的葡萄糖側鏈量降低了的血清型菌株特異性結合的抗體。本發明優選提供與血清型k的S.mutans菌株特異性結合的抗體。在本說明書中使用時，術語"抗體"是指免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及這些的Fab片段、F(ab')2片段、Fc片段)，例如，可例舉為多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體、抗獨特型抗體及人源化抗體，但不限于此。本發明的抗體，用以往的免疫方法不能獲得，但通過不斷創造免疫方法可以獲得。而且，本發明的抗體，是將具有k型以外血清型的已知的S.mutans菌株，使用由公知的葡萄糖側鏈的缺失方法制備的突變株進行制備。而且，本發明的抗體，是將本發明的多肽用作抗原來制備。本發明的抗體對血清型k的S.mutans菌株的檢測及/或診斷有用。在本說明書中使用時，術語"血清型k的S.mutans菌株的抗體"，是指包含可與血清型k的S.mutans菌株抗原特異性結合的完整分子及抗體片段[例如，Fab及F(ab，)2片段]。Fab及F(ab，)2片段缺少完整抗體的Fc部分，通過循環可進一步迅速除去，且基本不具有完整抗體的非特異性組織結合[Wahl等，J.Nucl.Med.24:316-325(1983)]。因此，這些片段也是優選的。或者，可與血清型k的S.mutans菌株抗原進一步結合的抗體，可通過抗獨特型抗體的使用，由兩步驟產生。此種方法，使用抗體自身即抗原的事實，因此，可得到與二次抗體結合的抗體。根據此方法，血清型k的S.mutans菌株特異性抗體在動物(優選小鼠)免疫時使用。之后，此種動物的脾細胞，用于產生雜交瘤細胞時使用，并且雜交瘤細胞，為了鑒定產生與血清型k的S.mutans菌株特異性抗體結合的能力，通過血清型k的S.mutans菌株抗原產生被阻斷的抗體的克隆，而進行篩選。此類抗體含有對血清型k的S.mutans菌株特異性抗體的抗獨特型抗體，且把用于誘導更多的血清型k的S.mutans菌株特異性抗體形成的動物，用于免疫。已很明確，Fab及F(ab')2以及本發明抗體的其他片段，可按照本說明書中公開的方法使用。此種片段，代表性地可使用如木瓜蛋白酶(產生Fab片段)或胃蛋白酶[產生F(ab，)2片段]的酶，通過蛋白質分解由切斷產生。或血清型k的S.mutans菌株結合片段，可通過重組DNA技術的適用或化學合成而產生。為在人體中診斷，使用生物體內成像，檢測上升水平的血清型k的S.mutans菌株時，可優選使用"人源化"嵌合單克隆抗體。此種抗體，可使用來源于生成上述單克隆抗體的雜交瘤細胞的遺傳構建物生成。生成嵌合抗體所用的方法，是該領域中公知的。總的來說，可參照Morrison,Science229:1202(1985);Oi等，BioTechniques4:214(1986);Cabilly等美國專利第4,816,567號；Taniguchi等，EP171496;Morrison等，EP173494;Neuberger等，WO8601533;Robinson等，WO8702671;Bouli腿e等，Nature312:643(1984);Neuberger等，Nature314:268(1985)。因此，本發明涉及的抗體，可以說至少具備識別本發明涉及的k型S.mutans菌株的抗體片段[例如，Fab及F(ab，)2片段]即可。即應注意，由識別本發明涉及的k型S.mutans菌株的抗體片段、與不同的抗體分子的Fc片段組成的免疫球蛋白也包含于本發明。艮卩，本發明的目的，是提供識別本發明涉及的k型S.mutans菌株的抗體，而不局限于本說明書中具體記載的各個免疫球蛋白的種類(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)、嵌合抗體的制備方法、肽抗原制備方法等。因此，必須注意，根據上述各方法以外的方法獲得的抗體，也屬于本發明的范圍內。(2)血清型k的S.mutans菌株的檢測法及診斷法本發明涉及的S.mutans的血清型檢測法及診斷法，是檢測及診斷可存在于被檢體中的血清型k的S.mutans菌株的方法。含有感染粒子、或代謝產物、核酸、及蛋白質的疾病指標的分子的檢測，是醫學上疾病的診斷及治療、以及研究中基本的要素。很多的方法論在現今的檢測中仍然使用。這些方法論，一般可分為，對引發疾病的因子的成分進行編碼的遺傳物質核酸的診斷檢測、及對引發疾病的因子或疾病的副產物的任一成分的蛋白質的抗體為基礎的診斷檢測。本發明提供在生物學樣品中，特別是從被檢體中獲得的組織或其他的細胞或體液中，通過檢測把參與血清型k的S.mutans菌株特異性多糖抗原生物合成的酶加以編碼的多核苷酸，診斷血清型k的S.mutans菌株相關障礙的方法。(A)對核酸的檢測法及診斷法對核酸的檢測，涉及從用于檢測多核苷酸(核酸分子)存在的放射性標記探針的Northern印跡雜交法的單純方法，到通過雜交技術，于序列檢測中使用的、用于擴增非常少量的特定核酸序列的聚合酶鏈式反應(PCR)的范圍。核苷酸探針，可使用市場銷售的染料、或酶、熒光、化學發光、或放射性的標記進行標記。這些探針，在通過雜交，檢測細胞中或組織試樣中的基因或相關序列(此處，其基因是通常的成分)的表達，及篩選被懷疑具有由生物感染產生的疾病的人體血清或組織試樣時使用。弓I物還可在使用反轉錄酶或DNA聚合酶及聚合酶鏈式反應制備的、組織或液體中非常少量存在的多核苷酸的檢測時使用。聚合酶鏈式反應(PCR)，特別是在克隆、基因表達的分析、DNA序列鑒定、遺傳作圖、藥物發現等方面適用，且是非常重要的手段。例如，參照Innis等，PCRProtocolsAguidetoMethodsandApplications,AcademicPress,SanDiego(1990);及美國專利第4,683,195,4,683號。本發明提供檢測血清型k的S.mutans菌株的方法，該法包括將由序列號14中所示的堿基序列的至少12個連續堿基序列或其互補序列組成的寡核苷酸作為引物使用，以進行PCR反應的步驟。PCR試劑及方法，可由PerkinElmer,761MainAve.,Norwalk,Conn.06850;或RocheMolecularSystems,1145AtlanticAve.,Suite100,Alameda,CA94501獲得。優選的PCR反應，將2Om1的PCR反應液[含有20ng/u1的基因組DNA5ii1、dNTP混合物2^1、10XPCR緩沖液2y1、正向引物(20pmol/ul)lul、反向引物(20pmol/ul)lu1、AmpliTaqGold0.1til、MilliQ水8.9u1]，用94°C、預變性5分鐘后，進行94°C30秒、60°C30秒、72°C30秒的30個循環，之后再用72°C、延伸7分鐘，但并不限于此。在本說明書中使用時，術語"至少l2個"是指l2、13、14、15、或其以上的整數。根據本發明，可有效且高效地鑒定出，從被檢體所得到的樣品中是否存在血清型k的S.mutans菌株。傳統的技術中，PCR及雜交過程是分別操作進行的。但是，通過組合PCR及雜交過程所獲得的優點也有很多(i)只需單一的試劑添加步驟，由此，不需打開反應試管，即可進行此組合的反應，由此可減少樣品混合及樣品污染的機會；(ii)需要的試劑更少量；(iii)需要的試劑添加步驟更少，自動化更容易；并且(iv)在正常的方法中，為了保護熱循環期間細胞樣品的完整性而把使用的樣品密閉(containment)組裝以防不必要的分解。單一的反應中，將PCR與雜交過程組合的1種存在的方法是作為"Taqman"的已知技術。例如，參照Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7276-7280(1991)。原位的PCR，是指為使特定擴增后的核酸在原本含有靶核酸序列的細胞或下位的細胞結構中實質性含有，而在被固定的細胞中實行的PCR擴增。細胞可在水性懸浮液中，或也可以是組織樣品的部分(例如，組織化學的切片或細胞化學的彌散條帶)。在本說明書中使用時，術語"組織化學的切片"，是指被凍結或化學方式固定，通過包埋在蠟或塑料中固定，于薄板(代表性的是數微米的厚度)上切片，并且附著在固相載體(例如，顯微鏡幻燈片)的生物學組織的固體樣品，而術語"細胞化學的彌散條帶"是指被化學方式固定，且附著于顯微鏡幻燈片的細胞(例如，血球)的懸浮物。細胞，優選通過如蛋白酶酶切、使用表面活性劑或有機溶劑的液體提取、或透過(permeabilization)法等其他的方法，使其對PCR試劑為透過性。在本說明書中使用時，術語"被固定的細胞"，是針對通過溶劑變化、溫度變化、機械壓力、或干燥產生破裂而強化的細胞結構(特別是膜)進行化學處理后的生物學細胞樣品。細胞，可固定于懸浮物中，或作為組織樣品的部分被固定，任一種均可。細胞固定液，一般是通過使細胞結構的蛋白質組成要素，最一般性地是與蛋白質氨基反應而交聯的化學藥品。優選的固定液，含有福爾馬林緩沖液、95%乙醇、甲醛、多聚甲醛、及戊二醛。被固定的細胞的透過性，可通過蛋白酶、或表面活性劑、或用溶解膜脂質的有機溶劑處理而使增加。本發明提供檢測血清型k的S.mutans菌株的方法，該法進一步包含將序列號14中所示的堿基序列的至少12個連續堿基序列或其互補序列組成的寡核苷酸作為探針使用，以進行雜交反應的步驟。根據本發明，可有效且高效地鑒定出由被檢體獲得的樣品中存在的S.mutans菌株。本發明的寡核苷酸，作為通過與染色體原位雜交而進行基因作圖，以及作為通過例如Northern印跡法分析，檢測人體組織中血清型k的S.mutans菌株表達用的探針是有用的。如以下的詳細記載，檢測特定組織中血清型k的S.mutans菌株基因表達的變化，可提示特定的疾病及/或病灶。在優選的實施方式中，本發明的寡核苷酸被標記。作為適當的標記，例如，可以舉出來源于通過催化與底物反應、生成過氧化氫的氧化酶群的酶。葡萄糖氧化酶，因其具有良好的穩定性，且其底物(葡萄糖)易獲得，所以特別優選。氧化酶標記的活性，可通過測定由酶一標記抗體/底物反應形成的過氧化氫的濃度進行檢測。除酶以外，其他適當的標記，可例舉為放射性同位素[例如，碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)、及锝(99mTc)]、以及熒光標記(例如，熒光素(Fluorescein)及羅丹明)以及生物素。(B)針對蛋白質的檢測法及診斷法對蛋白質的檢測方法，可進一步分為分子(通常抗體)與被檢蛋白質間的結合反應；或包含可使酶活化，產生可檢測的顏色變化的底物裂開，酶與酶結合的目的分子間的反應。多數的結合檢測，含有染料、酶或放射性或熒光標記，増強檢測。針對蛋白質的抗體，可從患者、免疫動物、或抗原特異性單克隆細胞株獲得。這些抗體檢測，包含夾心ELISA檢測、Western印跡法、放射性免疫測定、及免疫擴散檢測等檢測。其他的檢測，采用用于分子固定化及檢測的抗生物素蛋白及生物素等分子。制備這些試劑的技術及使用它的方法，是本領域技術人員公知的。本發明提供檢測血清型k的S.mutans菌株的方法，該法包含使用變形鏈球菌的血清型c、e、或f菌株特異性多糖類葡萄糖側鏈量降低了的血清型的菌株特異性結合的抗體，進行免疫反應的步驟。。在本說明書中使用時，術語"免疫反應"，可例舉為夾心ELISA檢測、Western印跡法、放射性免疫測定、及免疫擴散檢測等檢測，但不限于此。根據本發明，可有效且高效地鑒定出，從被檢體獲得的樣品中是否存在血清型k的S.mutans菌株。如上所述，根據本發明，可鑒定出侵入血液中時是否攜帶不易受多型核白血球吞噬作用的S.mutans菌株。而且，通過與其他主要的病原菌鑒定法組合，可使預防感染性心內膜炎的對象者減少，使抗生素的使用量降低，通過抗生素的使用，還可抑制抗性菌的出現。本發明進一步提供，使用與本說明書中所述的血清型k的S.mutans菌株特異性結合的抗體、診斷血清型k的S.mutans菌株的方法。作為使用抗體的檢測方法，可例舉為夾心ELISA檢測、Western免疫印跡法、放射性免疫檢測、及免疫擴散檢測的檢測。其他的檢測，采用用于進行分子固定化及檢測的抗生物素蛋白及生物素等分子。這些試劑的制備技術及其使用方法，是本領域技術人員公知的。生物學樣品中血清型k的S.mutans菌株蛋白質水平的檢測，可使用該領域任意的公知方法進行。基于抗體的技術，在用于檢測生物學樣品中血清型k的S.mutans菌株的蛋白質水平時是優選的。例如，組織中血清型k的S.mutans菌株蛋白質的表達，可用包含Western印跡法檢測或點印跡法檢測的、傳統的免疫組織化學方法進行研究。此時，特異性識別雖可通過一次抗體(多克隆或單克隆)提供，但二次檢測體系可利用由熒光、酶、或其他結合的二次抗體。其結果是，可得到用于病理學檢測的組織切片的免疫組織化學染色。根據用于檢測血清型k的S.mutans菌株蛋白質水平時有用的其他抗體的方法，包含免疫分析[例如，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)及放射免疫分析(RIA)]。例如，血清型k的S.mutans菌株特異性單克隆抗體，可用于檢測及定量血清型k的S.mutans菌株蛋白質的、作為免疫吸附劑及酶標記探針的兩種功能。樣品中存在的血清型k的S.mutans菌株蛋白質的量，可使用線性回歸計算機算法，通過與標準制備物中存在的量的比較來計算。用于檢測抗原的此種ELISA，如lacobelli等，BreastCancerResearchandTreatment11:19-30(1988)中所述。在其{也的ELISA檢測中，2種不同的特異性單克隆抗體，可用于檢測體液中血清型k的S.mutans菌株蛋白質。在此檢測中，一方面抗體可作為免疫吸附劑使用，另一方面還可作為酶標記探針使用。適當的酶標記，例如，包含催化來源于與底物反應、生成過氧化氫的氧化酶的標記。葡萄糖氧化酶，因其具有良好的穩定性，且其底物(葡萄糖)易獲得，所以是特別優選的。氧化酶標記的活性，可通過測定由酶一標記抗體/底物反應形成的過氧化氫濃度進行檢測。不僅酶，作為其他適當的標記，還可例舉為放射性同位素[例如，碘(125i、1211)、碳("C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)、及锝(99mTc)]、以及熒光標記[例如，熒光素(Fluorescein)及羅丹明]以及生物素。除可檢測從個體中獲得的生物學樣品中的血清型k的S.mutans菌株水平外，血清型k的S.mutans菌株，還可通過圖像分析進行生物體內檢測。用于血清型k的S.mutans菌株生物體內圖像分析的抗體標記或標記物，可例舉為通過X射線攝影法、NMR、或ESR可檢測的抗體標記或標記物。X射線攝影法，其適當的標記，可以舉出發射可檢測的放射線，但對被檢體無明顯危害的鋇或銫的放射性同位素。用于NMR及ESR的適當的標記物，可以舉出通過相關的雜交瘤營養成分標記摻入抗體中，具有如重氫的可檢測的特征性旋轉的物質。通過放射性同位素(例如，3I、111In、99mTc)、放射性不透過體(radio-opaque)底物、或核磁共振可檢測的物質的適當的可檢測圖像分析部分進行標記的血清型k的S.mutans菌株特異性抗體或抗體片段，導入對于病癥進行檢測的哺乳動物中(例如，非經口的、皮下、或靜脈內)。通過被檢體的大小及使用的圖像分析系統，可確定形成診斷用圖像的必要的圖像分析部分的量，其已被該領域理解。為放射性同位素部分時，對于人體被檢體，注射的放射活性的量，通常約為520毫居里范圍的991c。之后，標記抗體或抗體片段，在包含血清型k的S.mutans菌株細胞的位置優先積累。生物體內的腫瘤圖像分析，如S.W.Burchiel等，《Immunoph謹acokineticsofRadiolabeledAntibodiesandTheirFragments》[TurnerImaging第13章TheRadiochemicalDetectionofCancer,Burchiel,S.W.及Rhodes,B..A.編，MassonPublishingInc.(1982)]中所述。對于本發明的血清型k的S.mutans菌株特異性抗體的進一步適當的標記提供如下。作為適當的酶標記例，可例舉為磷酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、酵母乙醇脫氫酶、a—甘油磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、P—半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖一6—磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶、及乙酰膽堿脂酶。作為適當的放射性同位素標記例，可例舉為3H、"1111、125I、13I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、9。Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、09Pd等。111In是在生物體內使用圖像分析時優選的同位素。這是由于，要回避由用125I或]31I標記的單克隆抗體的肝臟脫鹵化反應的問題。而且，此放射性核種為用于圖像分析，更優選具有Y釋放能[Perkins等，Eur.J.Nucl.Med.10:296-301(1985);Carasquillo等，J.Nucl.Med.28:281-287(1987)]。例如，使用1一(P—異硫氰酸芐酯(isothiocyanatebenzyl))—DPTA與單克隆抗體偶聯的l11In，基本上未顯示在非腫瘤性組織(特別是肝臟)中的摻入。因此，增強了腫瘤局部存在的特異性[Esteban等，J.Nucl.Med.28:861-870(1987)]。作為適當的非放射性同位體標記例，可例舉為"7Gd、55Mn、162Dy、52Tr、及"Fe。作為適當的熒光標記例，可例舉為'"Eu標記、熒光素標記、異硫氰酸酯標記、羅丹明標記、藻紅蛋白標記、藻藍蛋白標記、別藻藍蛋白標記、鄰一酞醛標記、及螢光胺標記。作為適當的毒素標記例，可例舉為白喉毒素、蓖麻子蛋白、及霍亂毒素。作為化學發光標記例，可例舉為魯米諾(Luminol)標記、異魯米諾(Isoluminol)標記、芳香族吖啶鎗酯(acridiniumester)標記、咪唑鐵鹽標記、吖啶鹽(acridinium)標記、草酸酯標記、底物熒光素(Luciferin)標記、熒光素酶(Luciferase)標記、及發光蛋白(Aequorin)標記。作為核磁共振對比劑例，可例舉為Gd、Mn、及Fe的重金屬原子核。用于將上述標記與抗體結合的代表性技術，可由Ke皿edy等[Clin.Chim.Acta70:1-31(1976)]及Schurs等[Clin.Chim.Acta81:1-40(1977)]提供。后者提及的偶聯技術，是戊二醛交聯法、過碘酸氧化法、雙馬來酰亞胺法、m一馬來酰亞胺芐基一N—羥基一琥珀酰亞胺酯法，這些方法均可作為本說明書中的參考來引用。(C)血清型k的S.mutans菌株的篩選本發明提供從生物學樣品中篩選血清型k的S.mutans菌株的方法。一方面，本發明使用含有序列號14中所示的堿基序列的、且由S.mutans的血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的血清型菌株特異性堿基序列或其互補序列組成的多核苷酸或其片段，篩選S.mutans的血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的血清型菌株的方法。優選的實施方式中，上述S.mutans的血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的血清型菌株，是血清型k的S.mutans菌株。更優選的實施方式中，本發明的篩選方法，進一步包含使用本發明的抗體鑒定S.mutans菌株血清型的歩驟。另一方面，本發明使用與S.mutans的血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的血清型菌株特異性結合的抗體，提供篩選S.mutans的血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的血清型菌株的方法。優選的實施方式中，上述S.mutans的血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的血清型菌株是血清型k的S.mutans菌株。更優選的實施方式中，本發明的篩選方法，進一步包含使用本發明的多核苷酸或其片段、鑒定S.mutans菌株的血清型的步驟。本發明進一步提供，使用上述篩選方法鑒定的、S.mutans的血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的血清型菌株。優選的實施方式中，上述S.mutans的血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈量降低了的血清型菌株，是血清型k的S.mutans菌株。更優選的實施方式中，上述血清型k的S.mutans菌株，可例舉為TW295、TW871、FT1FT51、SU1SU51、YK1YK50、FT1GD、YK1R、AT1及YT1，但不限于此。(3)血清型k的S.mutans菌株的檢測試劑盒及診斷試劑盒本發明涉及的S.mutans的血清型鑒定試劑盒，是鑒定作為鑒定對象的S.mutans菌株是否是上述k型的試劑盒。本發明提供的試劑盒，其是用于檢測具備由序列號14中所示的堿基序列的至少l2個連續堿基序列或其互補序列組成的寡核苷酸的，血清型k的S.mutans菌株。為本發明的試劑盒，優選進一步具備與c型、e型或f型的S.mutans菌株特異性結合的寡核苷酸。更優選為上述寡核苷酸已被標記。根據本發明，可簡便地鑒定患者是否攜帶血清型k的S.mutans菌株。特別是，還可檢測出檢測極限以下的病例中血清型k的S.mutans菌株。一方面，本發明的試劑盒是，上述寡核苷酸為PCR引物。在優選的實施方式中，本發明的試劑盒，進一步包含用于PCR反應的試劑。另一方面，本發明的試劑盒是，上述寡核苷酸為雜交探針。更優選的實施方式中，本發明的試劑盒，進一步包含用于雜交反應的試劑。在一實施方式中，本發明的試劑盒的特征在于，具備由序列號9中所示的堿基序列組成的寡核苷酸。本實施方式涉及的試劑盒，優選進一步具備序列號8中所示的堿基序列組成的寡核苷酸，更優選進一步具備由序列號l0中所示的堿基序列組成的寡核苷酸。本發明還提供用于檢測，具備與血清型k的S.mutans菌株多糖抗原特異性結合的抗體的血清型k的S.mutans菌株的試劑盒。優選上述寡核苷酸被標記。根據本發明，可簡便地鑒定出患者是否攜帶血清型k的S.mutans菌株。特別是，還可檢測出至今為止、為檢測極限以下的病例中血清型k的S.mutans菌株。(4)血清型k的S.mutans菌株的檢測器具及診斷器具本發明涉及的細菌檢測器具，是用于檢測鑒定樣品中的細菌的器具，基于對象細菌所屬的種或屬中的特異性堿基序列的寡核苷酸固定于載體表面，通過該寡核苷酸與來源于樣品的核酸進行雜交，檢測鑒定樣品中的細菌。用于血清型k的S.mutans菌株的檢測時，上述寡核苷酸，包含把參與血清型k的S.mutans菌株特異性多糖抗原生物合成酶加以編碼的多核苷酸的堿基序列中至少l2個連續堿基序列或其互補序列。另外，在全面檢查其他種的細菌時，包含其他種的細菌(也可為多種)特異性堿基序列的寡核苷酸，也于載體上固定是優選的。因此，通過使含有多種細菌的樣品用于檢測時，也可知血清型k的S.mutans菌株具有與何種細菌種共存的傾向。(A)載體用于本發明涉及的細菌檢測器具的載體的材質，只要可穩定地固定寡核苷酸均可。例如，可為聚碳酸酯、塑料等的合成樹脂、玻璃等，但不限于此。載體的形態也無特別限定，例如，可優選使用板狀、膜狀等的載體。〔被固定于載體表面的寡核苷酸)被固定于本發明涉及的細菌檢測器具的載體表面的寡核苷酸，只要是基于被檢體細菌屬于的種或屬中特異性堿基序列的寡核苷酸均可。通過該寡核苷酸與來源于樣品的核酸間的雜交成立，即可檢測出樣品中含有的、屬于目的種或屬的細菌。還有，根據上述被檢體細菌所屬的種或屬的特異性堿基序列的寡核苷酸，以下均稱為"CaptureOligo"。上述特異性堿基序列，只要能從被檢體細菌的基因組的堿基序列中找到屬或種的特異性堿基序列即可，但從對應于被檢體細菌的核糖體RNA基因的堿基序列中發現是優選的。其中，已知細菌的l6S核糖體RNA基因大量含有屬或種的特異性堿基序列，所以，從對應于l6S核糖體RNA基因的DNA序列中，發現屬或種的特異性堿基序列是特別優選的。核糖體RNA基因的堿基序列，可從GenBank、EMBL、DDBJ等數據庫等中獲得。CaptureOligo，根據上述屬或種的特異性堿基序列設計即可。因此，可以是上述屬或種的特異性堿基序列本身，只要與由被檢體細菌制備的核酸的特異性雜交成立，也可含有突變。突變的位置未特別限定。CaptureOligo的長度(堿基數)未特別限定，但過短時，雜交檢測較困難，過長時，會允許非特異性雜交。發明者等對CaptureOligo的最佳長度進行了探討，將標準的長度定為1250堿基長。優選為1240堿基長，更優選為l230堿基長，最優選為l322堿基長，但不限于此。堿基長主要依賴于序列特性(特定的堿基含有率，同一堿基的重復)，結合性好的，即使是短鏈，也可進行特異性雜交，其已被發明者等鑒定。CaptureOligo具有妨礙與來源于樣品的核酸雜交的發夾結構、莖環結構、或其他的立體結構時，可通過將組成CaptureOligo的1個或大于1個的核苷酸取代為不聯合肌苷或任一個核苷酸的核酸，以解除其立體結構。CaptureOligo的合成法未特別限定，由公知的方法[例如，Maniatis，T.etal.,MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中所述的方法等]合成即可。一般地，可使用市場銷售的DNA合成機進行化學合成。本發明涉及的細菌檢測器具，不只是基于上述被檢體細菌所屬的種或屬的特異性堿基序列的寡核苷酸，而且，優選將所謂的對照CaptureOligo固定于載體表面。對照CaptureOligo中，包含陽性對照CaptureOligo及陰性對照CaptureOligo。陽性對照CaptureOligo,是在后述的探針制備步驟中，鑒定擴增反應是否順利進行時使用的物質。陰性對照CaptureOligo，是鑒定不產生非特異性雜交，即，不產生假陽性雜交信號時使用的物質。這些陽性對照CaptureOligo及陰性對照CaptureOligo被固定于載體表面的細菌檢測器具，也包含于本發明。陽性對照CaptureOligo，只要是根據由檢測對象細菌制備的探針中含有的堿基序列設計的物質即可。另外，將多個檢測對象細菌同時使用同一細菌檢測器具進行檢測時，可設計針對各檢測對象細菌的陽性對照CaptureOligo，但也可以根據多個檢測對象細菌中制備的探針的共有堿基序列設計。沒有與所有的檢測對象細菌中制備的探針共有的堿基序列時，可分成各個小組，分別設計陽性對照CaptureOligo。或者也可設計引物序列部分相同，對象細菌的序列不同的人工序列，將此序列的一部分作為陽性對照CaptureOligo。以上述人工序列為模板制備探針(本說明書中，將此種探針稱為對照探針)，通過添加于從樣品制備的探針中，可檢驗雜交的特異性。還有，上述探針如后所述。陰性對照CaptureOligo，在陽性對照CaptureOligo的堿基序列中，為1堿基或大于l堿基，且優選設計為，使在該序列所具有的堿基數低于20%的范圍內，包含人為的堿基置換的堿基序列。進行堿基置換的堿基數，由與雜交條件的關系來決定，選擇來源于檢測對象細菌的探針不產生雜交的堿基數。對檢測對象細菌未作特別限定，從目的樣品中，適當選擇欲檢測的細菌即可。例如，可例舉為混入食品中的具有污染該食品可能性的細菌。食品中混入有害細菌，在公共衛生上是非常嚴重的問題。通過上述食品污染細菌的存在及/或與其量的比較，可測定本發明的血清型k的S.mutans菌株的存在及/或其量。污染食品的細菌，可例舉為屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediocuccus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、巨球形菌屬(Megasphaera)及Pectinatus的細菌。另外，屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)的細菌種，可例舉為失豆乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、Lactobacilluscoryniformis、彎曲孚L桿菌(Lactobacilluscurvatus)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)、發酵孚L桿菌(Lactobacillusfermentum)、Lactobacilluslindneri、Lactobacillusmalefermentans、干酪乳木干菌(Lactobacilluscasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)，屬于明串珠球菌屬(Leuconostoc)及發酵單胞菌屬(Zymomonas)的細菌，以及耐久腸球菌(Enterococcusdurans)及乳酸菌(Lactococcuslactis)。fS檢觀!j對象細菌不限于此。作為用于檢測鑒定上述例舉的細菌的CaptureOligo，可以例舉為對應于上述列舉的細菌l6S核糖體RNA基因的堿基序列中，基于各屬的特異性序列的寡核苷酸，但不限于這些。在本發明涉及的細菌檢測器具載體表面固定的CaptureOligo,只要是與從對象細菌制備的探針的雜交成立即可，而未作特別限定。固定于1個載體上的CaptureOligo，至少應為1種或大于1種，而無特別的上限。一般地，檢測混入試樣中的細菌時，可將樣品中可檢測出的細菌用1個載體全面地檢測的方式，從操作的簡便性及檢查的迅速性的觀點看可謂優選。因此，本發明涉及的細菌檢測器具，在1個載體上，固定多個對應于目的細菌種或屬的CaptureOligo，即所謂的微陣列型器具是最優選的。(B)寡核苷酸(CaptureOligo)的固定化向寡核苷酸的載體表面固定化的方法，未作特別限定，可適當選擇公知的方法使用。例如，可利用物理吸附、電結合或分子共價結合等一般的雜交法中使用的手法。本發明涉及的細菌檢測器具中，優選使用表面具有碳化二亞胺基或異氰酸酯基的基材(美國專利US5，908，746、日本特開平8—23975號)進行固定。將寡核苷酸點樣時，當寡核苷酸的點量過少時，不能充分確保寡核苷酸與探針之間的反應性，給鑒定帶來困難。而高密度的點樣，帶來技術上的問題，同時，還有成本問題，而且，使用了探針的熒光標記及化學顯色等的雜交信號的檢測，需要更精密、高昂的檢測裝置(例如，掃描儀)。因此，寡核苷酸在載體表面以直徑101，000ym范圍固定是優選的。向寡核苷酸的載體上點樣的方法，無特別限定。例如，可使用點樣儀，在載體上將寡核苷酸溶液進行點樣。所以，寡核苷酸溶液通常近似圓形地點樣。(5)本發明的用途通過使用本發明，可簡便地鑒定患者是否攜帶感染性心內膜炎病原菌之一的S.mutans中具有高病原性的菌株。特別是，可檢測出至今為止為檢測極限以下的病例中的病原菌。而且，可限制個體攜帶感染性心內膜炎發病危險性高的菌株，由此可抑制為預防感染性心內膜炎而使用大量的抗生素，還可抑制由于抗生素的亂用引起的抗藥性菌的出現。另外，可知病原菌S.mutans菌株與癥狀間的相關關系，同時，還可提供與其他病原菌間關系的更多的信息。實施例以下根據實施例對本發明進行更加詳細地說明，但本發明并不限于這些實施例。實施例1(A)S.mutans臨床口腔分離株的收集及S.mutans血清型的鑒定從本發明者的實驗室儲存庫中選取1982年到1990年間從571名幼兒體內分離的1326個S.mutans菌株(分離株的MT4000系列或MT10000系列)。此外，還隨機選取了從2002年8月在大阪大學齒學部醫院小兒齒科(日本國大阪府吹田市)看病的100人的被檢體(317歲，平均8、9歲)上得到的菌株(NN2000系列)。這些被檢體包括88名健康的幼兒，5名患唇裂、上鄂裂的患者，3名患心室中隔膜缺損的患者，2名患牙釉質發育不全的患者，1名患脊柱裂的患者以及1名患自閉癥的患者。按照有關人體被檢體研究的大阪大學倫理委員會的規定，收集臨床標本。將菌斑樣品懸浮于滅菌的PBS中，稀釋，然后平鋪在含有桿菌肽(O.2單位/ml:SigmaChemicalCo.，St.Louis,Mo.)和15%(w/v)蔗糖的MS瓊脂培養基(Difco)上。根據菌落的形態，從每個被檢體上各選擇1個菌落以供試驗使用。根據Masuda，N.etal.，1985.TransmissionofStreptococcusmutansinsomeselectedfamilies.Microbios.44:223-232所述的方法，取得S.mutans菌株的c型、e型及f型的抗血清，通過使用抗血清的免疫擴散法，決定上述臨床標本的血清型。MT系列的1326株全部分類為血清學c、e或f，沒有發現血清型不確定的分離株。另一方面，NN2000系列的100株中，78株分類為血清型c、17株分類為血清型e、3株分類為血清型f，剩下的2株(FT1(NN2011)及SU1(NN2029))，沒有與c型、e型及f型的特異性抗血清發生反應(表1)。此外，分別從具有血清學不定株(FT1株或SU1株)的被檢體內分離了50個菌落。<table>complextableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>02(B)S.mutans菌株使用上述S.mutans菌株的c型、e型及f型的抗血清，鑒定S.mutans血液分離株TW295、TW87KTW964及TW1378分別為血清型不確定菌株、血清型不確定菌株、f型株和e型株。這些S.mutans菌株和上述口腔分離株MT8148(c型株)、MT4245株(e型株)、及MT4251(f型株)的特征如表2所示。<table>complextableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>NN200269歲健康少年的口腔分離株NN2003f7歲健康少年的口腔分離株MT8148GDkMT8148的缺失葡萄糖側鏈的突變株FT1(麗20U)k3歲健康少女的口腔分離株SU1(NN2029)kio歲健康少女的口腔分離株YK1k6歲唐氏綜合癥少女的口腔分離株(C)S.mutans的抗血清的制備取得S.mutans血清型不確定菌株的抗血清。因為新型血清型的S.mutans的抗血清的抗原性顯著降低，所以采用原來的方法得不到抗血清，本發明者通過對免疫方法進行研究，成功得到其抗血清。具體為將S.mutans的TW295株和TW871株的全菌體懸浮于磷酸緩沖生理鹽水(PBS)中，使每種菌體以每天5mg干燥重量的量向兔子耳緣靜脈內注射，連續注射5天。間隔l周時間后，后2周內每周反復注射5天，從兔子耳靜脈內來血，得到S.mutans的TW295株和TW871株的抗血清。(D)葡萄糖側鏈缺失突變株的構建及其細菌學特征、血清學特征在gluA基因上插入抗生素抗性基因并使其失活，從而構建MT8148的葡萄糖側鏈缺失(GD)突變株。從S.mutans菌株Xc(GenBankaccessionno.AB001562)及Oklahoma大學公開的S,mutans基因組數據庫(GenBankaccessionno.AE014133)取得gluA序列，以此序列為基礎設計引物，使用該弓l物禾口AmpliTaqGold聚合酶(AppliedBiosystems,FosterCity，Calif)進行聚合酶鏈式反應(PCR)，通過該反應擴增gluA基因及其鄰接區。接著將該擴增的片斷克隆到pSTBlue-l載體(Promega，Madison,Wis)上，制備質粒pRN101。將pRNlOl的gluA的開放閱讀框架的中間部用Stul消化，接著插入由pVA838得到的830bp的紅霉素抗性基因(erm)片斷，構建質粒pRN102。用限制酶NotI消化線狀化，通過Tobian及Macrina方法將該質粒導入S.mutansMT8148株內。該轉化體在含有紅霉素(10ug/ml)的Mitis-salivarius(MS)瓊脂培養基(DifcoLaboratories,Detroit,Mich.)的平板上篩選。通過gluA基因的PCR擴增和免疫擴散法，確認突變株MT8148GD的適當的插入失活。MT8148GD具有S.mutans的典型的生物學特性。作為該特征可以是在MS瓊脂培養基上粗糙菌落、糖發酵陽性、PA及GTF表達、高水平蔗糖依賴性粘附、高水平菌體疏水性。(E)各種S.mutans菌株的抗血清的反應性為了實施使用上述抗體的免疫擴散法(凝膠沉淀反應)，將TW295株、TW871株及c型、e型、f型的S.mutans菌株培養一夜，在121。C加熱15分鐘，然后離心分離，取得的上清液為抗原(Rantz-Randall(RR)抗原)。S.mutans的TW295株及TW871株的抗血清，不與用S.mutansc型株、e型株及f型株制備的抗原發生反應，而與用S.mutansTW295株和TW871株制備的抗原發生反應(圖1AE)。將這些S.mutans的TW295株和TW871株的血清型命名為k型。圖1A中央的樣品槽含有TW295株的RR提取物(樣品槽1)，外側的樣品槽含有TW295株的抗血清(樣品槽2)、TW871株的抗血清(樣品槽3)、血清型c的特異性抗血清(樣品槽4)、血清型e的特異性抗血清(樣品槽5)、血清型f的特異性抗血清(樣品槽6)。此外，圖1B中央的樣品槽含有TW871株的抗血清(樣品槽7)，其外側的樣品槽含有TW295株的RR提取物(樣品槽8)、TW871株的RR提取物(樣品槽9)、MT4251株(f)的RR提取物(樣品槽IO)、MT4245株(e)的RR提取物(樣品槽11)以及MT8148株(c)的RR提取物(樣品槽12)。此外，圖1C中央的樣品槽含有FT1株的RR提取物(樣品槽13)，其外側的樣品槽含有TW871株的特異性抗血清(樣品槽14)、血清型c的特異性抗血清(樣品槽15)、血清型e的特異性抗血清(樣品槽16)、血清型f的特異性抗血清(樣品槽17)。圖1D中央的樣品槽含有血清型c的特異性抗血清(樣品槽18)，其外側的樣品槽含有MT8148株的RR提取物(樣品槽19)、MT8148GD株(c)的RR提取物(樣品槽20)。圖1E中央的樣品槽含有TW871株的抗血清(樣品槽21)，圖1E外側的樣品槽含有TW295株的RR提取物(樣品槽22)、TW871株的RR提取物(樣品槽23)、FT1株的RR提取物(樣品槽24)、SU1株的RR提取物(樣品槽25)、YK1株的RR提取物(樣品槽26)以及MT8148GD株的RR提取物(樣品槽27)。匿8148GD株的RR提取物與TW871的抗血清形成沉淀帶(但與血清型c的特異性抗血清不形成沉淀帶)，該沉淀帶與TW295、TW871、FT1、SU1、YK1的沉淀帶融合。使用該抗血清，調查從100人的被檢體內分離的100株(NN2000系列)的S.mutans中k型株存在的頻度。2株RR抗原不與c型、e型或f型的S.mutans菌株的抗血清發生反應，而與k型S.mutans菌株的抗血清發生反應。剩余的98株的RR抗原與c型株、e型株或f型株的特異性抗血清中的任何一個都反應。因此，鑒定NN2000系列的S.mutans臨床口腔分離株中的血清型不確定菌株(FT1株、SU1株)為k型株。(F)血清型不確定菌株S.mutans的特征根據Hamada等(1981)、及Rosenberg等(1980)所述方法，評價血清型不確定臨床分離株的蔗糖依賴性粘附性及菌體疏水性。細胞結合型(cell-associated)葡萄糖基轉移酶(CA-GTF)或細胞游離型(cell-free)葡萄糖基轉移酶(CF-GTF)以及表層蛋白質抗原(PA)的表達，利用使用GTF特異性抗體和PA特異性抗體的免疫印跡法進行鑒定(圖2AC)。從試驗菌體中提取基因組DNA，決定16Sr腦A序歹lj，然后與對照株NCTC10449(GenBankaccessionno.X58303、S70358)的序列進t亍比較。在圖2A及B中，用7%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離全細胞，并且與S.mutans的PA(圖2A)或CA_GTF(圖2B)的兔抗體發生反應。另一方面，在圖2C中，用硫酸銨沉淀濃縮的細胞上清(C)轉錄到PVDF膜上的蛋白質用7Q/。的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，使其與CF-GTF(C)的兔抗體發生反應。對各泳道進行解釋，那么第1泳道是MT8148株、第2泳道是FT1株、第3泳道是SU1株、第4泳道是YK1株。FT1株和SU1株表達了PA及3種類型的GTF。FT1株及SU1株具有高水平蔗糖依賴性粘附和菌體疏水性(沒有用數據表示)。這些16SrRNA基因序列，與NCTC10449株(GenBankaccessionno.X58303及S70538)的16SrRNA基因序列相同。并且，FT1株的RR提取物與TW871株及TW295株的抗血清形成沉淀帶，該沉淀帶又與TW871的RR提取物和TW871株的抗血清的沉淀帶相融合，并且，從具有FT1株及SU1株的各被檢體得到的50株，不與c型、e型、f型的特異性抗血清發生反應。此外，這兩株都具有S.mutans的特征，即MS瓊脂培養基上的粗糙菌落、桿菌肽抗性、血液瓊脂上的Y-溶血性、甘露醇、山梨醇、蜜三糖及蜜二糖的糖發酵陽性以及葡聚糖凝集陰性。(G)臨床分離株的鑒定從2003年年初在大阪大學齒學部醫院小兒齒科看病的其它組的50人被檢體(319歲，平均7、8歲)中得到S.mutans的臨床分離株2500個。這些被檢體包括45名健康幼兒、5名患有一般健康問題或口腔健康問題(如唐氏綜合癥、先天性心臟障礙、唇裂及上鄂裂、牙釉質形成不全癥及部分無齒癥)的患者。表3表示2500個(其中2450個分類為c型、e型或f型)上述S.mutans分離株的血清型分布。(50人被檢體的2500個S.mutans的血清型分布)<table>complextableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>另一方面，由單一被檢體(唐氏綜合癥)得到的另外50株(YK1YK50)的RR提取物，與TW871的抗血清形成沉淀帶，該沉淀帶又與TW295、TW871、FT1及SU1的RR提取物的沉淀帶融合。表4表示各被檢體的血清型分布模式，發現這些被檢體幾乎都只具有S.niutans血清型c，其次只具有血清型e，50人中有5人具有多種血清型。<table>complextableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>(H)吞噬作用的測定將生物在BrainHeartInfusionbroth(Difco)中37。C培養18小時。將該菌體洗凈后，用PBS把細胞濃度調整為1.0X108CFU/ml。從健康的志愿者身體上收集人體末梢血(500ul)，然后與500ul的細菌(5.0X107CFU)一起37。C培養10分鐘。使用吉姆薩染色劑(WakoPureChemicalIndustries,Osaka,Japan)染色，使用光學顯微鏡(倍數、X100;OlympusIndustries,Tokyo,Japan),求出呈現吞噬作用的多型核白血球(P麗)的比例。用每100個P麗中進行吞噬的P麗的平均值(試驗了500個PMN)表示比例。分別在15分鐘后、30分鐘后、60分鐘后、90分鐘后及120分鐘后觀察MT8148株、MT8148GD株、FT1株、TW295株的經時性吞噬作用比例的變化。各種因子在組之間的差異，根據因素模型的統計學方差分析(AN0VA)進行評價(圖3)。圖3A、3B表示S.mutans的口腔分離株及血液分離株的吞噬率。此外，圖3A、3B的結果表示5次實驗的平均士標準偏差。在圖3A中，12株的吞噬率在培養10分鐘后試驗。在圖3B中，表示培養15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘及120分鐘時的MT8148(參)、MT8148GD(〇)、FT1(▲)、TW295(□)的吞噬率的變化。MT8148GD株的吞噬率是22.0±2.4%，比親本MT8148的吞噬率(68.4±4.1。/。)顯著降低(P〈0.001)。并且，NN2001(c)、NN2002(e)及NN2003(f)的口腔分離株，具有與MT8148同等的吞噬率，但其吞噬率比血清型k的口腔分離株FT1、SU1及YK1或MT8148的顯著降低(P〈0.001)。4個血液分離株的吞噬率都比口腔分離株的吞噬率顯著降低(P〈0.001)，此外，MT8148GD、FT1及TW295的吞噬率，失活60分鐘也比MT8148的顯著降低，TW295的吞噬率，失活90分鐘后也比MT8148的顯著降低(P<0,001)。已知感染性心內膜炎是因病原性細菌侵入血流內而開始的，但仍然沒有査明其侵入機制及在血液中S.mutans的生存機制。在本實施例中，本發明者等發現血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈缺失的同系突變株的吞噬率比親株(建議改為親本)的吞噬率低。用FisherPLSD分析決定時，MT8148(血清型c)和其他株之間存在統計學顯著差異(*P〈0.001)。血清型k的口腔分離株及血液分離株在P麗的作用下吞噬率降低，總之，這些發現都表示血清型k株(認為其血清型特異多糖抗原葡萄糖側鏈缺失)很可能就是菌血癥的病原性菌株。另一方面，血液分離株TW964(e)和TW1378(f)，與口腔分離株麗2002(e)和麗2003(f)相比，對吞噬作用沒有感受性。但是，本發明者等發現TW964缺失葡聚糖結合性蛋白質A,而TW1378卻沒有任何這樣的突變。因此，除了對吞噬功能具有效果的血清型特異多糖抗原外，可能還存在菌體表面結構的突變。(1)考察2株血清分離株(TW295和TW871)、152株口腔分離株(FT1FT51、SU1SU51、YK1YK50)以及gluA失活株(MT8148GD)的RR提取物，與TW295或TW871的抗血清形成沉淀帶。另一方面，這些分離株都表示具有S.mutans的典型生物學特征(高水平蔗糖依賴性粘附、高水平疏水性、葡萄糖基轉移酶)。本研究中的S.mutans血清型c、e及f被分離頻度，與丹麥的研究報告內容非常相似。在該報告中，從人的牙垢樣品得到的76個mutansstr印tococci中的1個和從人的齲齒性病變得到的70個mutansstreptococci中的7個不能按照血清學分類為血清型ag。生物化學分析顯示這些血清型不確定菌株屬于S.mutans，但其沒有血清型特異多糖的結構。在別的研究中，從人的牙垢樣品、齲齒性象牙質樣品、或糞樣品中采集的1047個S.mutans分離株或S.sorbinus的分離株全部分類為血清型c、e、f、d或g。并且，在日本其他地區進行的最新的研究中，從牙垢中得到的144個S.mutans或S.sorbinus全部分類為血清型c、e、d或g，并且沒有檢出f型菌株或血清型不確定菌株。另一方面，有報告指出最近在日本，103人的被檢體中9人具有血清學不定的S.mutans，但沒有正確記載有關血清型特異多糖的特征。上述內容表明本發明者等發現了最近日本出現的血清型k型。在本研究中，從3個幼兒的菌斑樣品中發現了具有這種新型血清型的S.mutans，其中152株全部分類為血清型k。雖然還沒有鑒定這些臨床分離株的起源，但血清型k株占從這3人被檢體的牙垢樣品中發現的S.mutans菌株中的大部分。并且這些株全部具有高水平菌體疏水性、高水平蔗糖依賴性粘附及高水平抗吞噬作用。由此可以確定S.mutans的血清型k株，由于GTF及PA的表達及其高水平疏水性和高水平蔗糖依賴性粘附，從而使其能夠存在于口腔內，并且由于其吞噬作用低而能夠存在于血液中。因此，具有心臟障礙的幼兒必須特別注意。特別是，對于口腔內具有S.mutans血清型k株的唐氏綜合癥患者，可能合并發生心室中隔缺損和多型核白蛋白(P麗)功能障礙，所以更加危險。在這些患者中檢出新的血清型k表明危險性又增加了，因此，在齒科處理之前有必要進行抗生素處方的臨床研究，并且應該注意這種情況。實施例2:S.mutans的k型株的特異性基因序列的檢索從S.mutans的k型株(TW295株、TW871株、FT1株、YK1株)提取基因組DNA，對于各株，把參與血清型特異多糖抗原生物合成的酶加以編碼的基因序列進行確定，并與血清型c的MT8148株對應的序列相比較。并且將S.mutans的k型株的DNA序列與數據庫上的菌株(Xc株GenBankaccessionno.細10970、UA159株GenBankaccessionno.AE014133)的DNA序列相比較，特定k型株特異性基因序列。發現在k型株中rgp基因組中有各種突變，但確認全部k型株共同在rgpF基因的前半部發生突變(圖4圖13)。實施例3:S.rautans的k型株的簡易鑒定法的確立與S.mutans的c型株相比較，對于S.mutans的k型株，rgpF基因前半部分的三分之一存在特異性基因序列。利用該區域，在rgpF基因的起始密碼子上游，以各血清型(c型、e型、f型及k型)的株之間的共有序列為基礎，設計正向引物(ATTCCCGCCGTTGGACCATTCC(序列號8):CEFK-F);以k型的特異性序列為基礎設計反向引物(CCAATGTGATTCATCCCATCAC(序列號9):K-R)、以及以c型、e型、f型的特異性序列為基礎設計反向引物(CCGACAAAGACCATTCCATCTC(序列號10)CEF-R)(表5及圖14)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>與Xc(c)株(GenBankaccessionno.AB010970)的位置相對應的位置用上述引物對確立僅對k型株特異性PCR擴增的系統。具體來說，從S.mutans的k型株(TW295株、TW871株、FT1株、YK1株)及唾液樣品中提取基因組DNA，使用CEFK-F和CEF-R引物對及CEFK-K和K-R引物對，根據圖15所示，使PCR反應溶液在94°C5分鐘循環1次，94°C30秒、60°C30秒、72°C30秒各循環30次，72°C7分鐘循環1次的條件下進行PCR反應。將得到的反應溶液進行1.5%瓊脂凝膠電泳。其結果如圖16所示。實施例4:S.mutans的血清型k以外的菌株或血清型k株的PCR檢測的靈敏度使用S.mutans菌體的滴定培養，分析使用CEFK-F和CEF-R引物對及CEFK-F和K-R的PCR引物對反應的靈敏度。具體來說，對于每毫升相當于108個的MT8148株(c型)、TW295株(k型)及FT1株(k型)，使用CEFK-K和K-R引物對進行PCR反應。作為模板使用從上述菌體中提取的基因組DNA。使用在滅菌水中稀釋的已知數量(5X104個、5X103個、5X102個、5X101個及5個)的菌體，決定PCR的檢出限(圖16)。此外，在圖16中，使用每毫升相當于108個的MT8148株(c型)、TW295株(k型)及FT1株(k型)的細胞的滴定培養，分析PCR反應的靈敏度。添加下述數量的細胞5X1()4個(第l泳道)、5Xl(f個(第2泳道)、5X102個(第3泳道)、5X10'個(第4泳道)及5個(第5泳道)。M表示分子大小的標識(100bpDNALadder)。對于S.mutans的k型株(TW295株和FT1株)，使用k型特異性引物可進行PCR擴增，對于c型(MT8148株)，使用k型特異性引物不進行PCR擴增。檢出限，使用血清型c/e/f株特異性引物對時為50500細胞；使用血清型k株特異性引物對時為550細胞，證明有良好的靈敏度。實施例5:用于檢出S.mutans血清型k株的PCR檢測將從各種血清型的S.mutans菌株及S.mutans以外的鏈球菌提取的DNA作為模板使用，確定使用CEFK-F和CEF-R引物對及CEFK-F和K-R引物對的PCR的準確性(圖17A、17B)。在圖17A中，使用血清型c/e/f株的特異性引物對(CEFK-F和CEF-R)，將從血清型c/e/f株細菌中提取的基因組DNA(第14泳道)、從血清型k株細菌中提取的基因組DNA(第58泳道)、從唾液樣品中提取的基因組DNA(第914泳道)作為模板，進行PCR反應。此外，在圖17B中，使用血清型k株的特異性引物對(CEFK-F和K-R)(B)，將從血清型c/e/f株細菌中提取的基因組DNA(第14泳道)、從血清型k株細菌中提取的基因組DNA(第58泳道)、從唾液樣品中提取的基因組DNA(第914泳道)作為模板，進行PCR反應。對各泳道進行說明，那么第1泳道是MT8148(c型)、第2泳道是NN2001(c型)、第3泳道是NN2002(e型)、第4泳道是NN2003(f型)、第5泳道是TW295(k型)、第6泳道是TW871(k型)、第7泳道是FT1(k型)、第8泳道是YT1(k型)、第9泳道是St印tococcussanguinisATCC10556、第10泳道是StreptococcusoralisATCQ0557、第11泳道是StreptococcusgordoniiATCC10558、第12泳道是Str印tococcusmitisATCC903、第13泳道是StreptococcusmilleriNCTC10703、第14泳道是StreptococcussalivaxiusHHT。CEFK-F和CEF-R引物對能夠特異地檢出血清型c/e/f株，CEFK-F和K-R引物對能夠特異地檢出血清型k株。但不論那個引物對都沒有檢出S.mutans以外的鏈球菌。由此可見，使用CEFK-F和CEFK-R引物對和CEFK-F和K-R引物對，不僅能夠特異檢出血清型c/e/f株和血清型k株，而且只能夠檢出S.mutans。實施例6:根據使用唾液樣品的PCR反應，鑒定具有S.mutans血清型k株的被檢體2004年1月2月，從在大阪大學齒學部小兒齒科看病的200名小兒或青春期的患者(218歲、平均7.9±3.6歲)收集吐出的全部唾液(約lml)。將這些唾液樣品用于對Hoshino等(2004)報告的方法進行了一定的改變的PCR檢測中。簡單來說，將無刺激的全部唾液收集到滅菌試管內，并放置在冰上。在16，000Xg、5分鐘的條件下，從500ul的唾液中把菌體回收到微量離心管內，在電子烤箱內用500W處理5分鐘，然后，在N-乙酰胞壁酰五肽移位酶SG(SeikagakuCorp.,Tokyo,Japan)中于50。C消化1小時。接著，添加80y1的核溶解(nucleilysis)液(Promega)，于80。C培養5分鐘，然后，添加60ul的蛋白質沉淀液(Promega)，在16，000Xg、3分鐘的條件下離心分離、除去蛋白質。通過苯酚-三氯甲烷提取和乙醇沉淀，生成DNA。將提取的DNA溶解在50u1的TE緩沖液(10mMTris-HC1、lmMEDTA(pH8.0))中。該DNA的提取方法也可在從牙垢提取菌體基因組時使用。通過將上述得到的DNA作為模板使用的PCR，使用CEFK-F和CEF-R引物對可檢出血清型c/e/f株(A)，使用CEFK-F和K-R引物對可檢出血清型k株(B)(圖18A、18B)。其結果是，從被檢體200人上得到的臨床標本中，有190個對血清型k株的非特異性(對血清型c/e/f株特異)引物對(A)顯示陽性，對血清型k株的特異性引物對(B)為陰性。此外，剩下的10個標本，對血清型k株的特異性引物對(B)和對血清型k株的非特異性引物對(A)(對血清型c/e/f株特異)顯示陽性。圖18A表示上述190個標本中的代表性的5例，該5例使用CEFK-F和CEF-R引物對，對血清型k株的非特異性(對血清型c/e/f株特異)引物對(A)顯示陽性、對血清型k株的特異性引物對(B)顯示陰性。此外，在圖18B中，為了檢出血清型k株，使用CEFK-F和K-R引物對。對各泳道進行說明，第15泳道表示對血清型k株的特異性引物對顯示陰性的上述190株標本中的有代表性的5例，第68泳道表示對血清型k株的特異性引物對顯示陽性的菌株。如上所述，對于S.mutans的k型株(TW295株、TW871株、FT1株、SU1株、YK1株、YT1株及ATI株)和S.mutans的臨床分離株(NN2000系列c型78株、e型17銖、f型3株)，使用k型的特異性引物可進行PCR擴增，使用c型、e型、f型的特異性引物不進行擴增。此外，對于98個c型、e型或f型的S.mutans菌株，使用c型、e型或f型的特異性引物可進行PCR擴增，使用k'型的特異性引物不進行PCR擴增。實施例7根據S.mutans的細胞表面多糖的化學組成，可把其分為c型、e型及f型的血清型(Linzer等，1987)。已知S.mutans的血清型特異多糖由鼠李糖骨架及具有a-糖苷殘基或e-糖苷殘基的側鏈的鼠李糖-葡萄糖聚合物構成。在本發明者等以前的研究中發現，從菌血癥患者血液中得到的血清型不確定菌株(TW295)及從感染性心內膜炎的患者血液中得到的血清型不確定菌株(TW871)的血清型特異多糖的葡萄糖側鏈的量降低(Fujiwara等，2001)。如實施例1所示，具有k型血清型的MT8148GD顯示了高水平蔗糖依賴性粘附，但其粘附率比親株(建議改為親本)MT8148(c型)的粘附率顯著降低。最近證明，血清型特異多糖在鏈球菌向人體單核球及纖維芽細胞上附著的過程中擔負著重要的作用，并且預測其為最有效的細胞因子刺激成分(Engels-Deutsch等，2003)。但是，血清型特異多糖與齲齒之間的關系仍有待闡明。因此，本發明者對重新闡明的S.mutans血清型k株的齲齒原的血清型特異多糖的葡萄糖側鏈的作用進行了分析。(A)S.mutans菌株本實施例使用的S.mutans菌株如表6所示。從本發明者的實驗室的培養物收集庫中選擇MT8148(c)的口腔分離株。從日本幼兒的口腔內分離出FT1株(k)、SU1株(k)及YK1株(k)。并且，從6歲健康少年的口腔內分離出YTl株，并且根據實施例1所述方法確定為S.mutans血清型k。將MT8148R株及YK1R株在濃度不斷增加的鏈霉素(每1ml瓊脂培養基最終濃度為1500ug)中反復繼代培養，使其對鏈霉素產生抗性(Ooshima等，2000)。與實施例1一樣，構建MT8148GD株(MT8148的gluA失活同系突變株)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>(B)齲齒病原特性的體外試驗(invitro)分析S.mutans對玻璃試管的蔗糖依賴性粘附性和對唾液包埋的羥磷灰石(SHA)的非蔗糖依賴性粘附性，根據以前所述方法(Ooshima等，2001;Nakano等，2002)進行分析；菌體疏水性及葡聚糖結合活性，根據以前所述方法(Fujiwara等，2001;Nakano等，2002)進行分析。根據因素模型的統計學方差分析(ANOVA)評價各種因子在組之間的差異(表7)。表7表示用體外試驗(invitro)分析得到的齲齒病原的生物學特性。MT8148GD對玻璃表面的蔗糖依賴性粘附性、對SHA的非蔗糖依賴性粘附率、葡聚糖結合能、CA-CTF活性及CF-CTF活性的數值顯著降低(P〈0.001)。但是，這些特性在FTI和FTIGD之問并沒有顯著差異。(血清型k株的生物學特性)<table>complextableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>根據Fisher的PLSD分析，MT8148與其他株之間存在顯著差異(aP<0.001)(C)GTF的表達為了評價表達的蛋白質的量，使用本發明者在以前研究中制備的抗菌體結合型(CA)GTF抗血清及抗菌體游離型(CF)GTF抗血清，進行了GTF的免疫印跡分析。于37。C，使試驗生物在BrainHeartInfusion(BHI)肉湯(DifcoLaboratories,Detroit,MI，USA)中增殖，增殖到550nm處的吸光度為1.0。將該菌體及上清液(用硫酸銨沉淀濃縮)溶解到SDS凝膠電泳緩沖液中。利用7。/。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離出等量的各蛋白質，接著轉錄到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenedifluoride)薄膜(Immobilon;Millipore,Bedford:MA,USA)上，使該轉錄的蛋白質帶和CA-GTF或CF-GTF的兔抗體反應，接著，使用堿性磷酸酶復合物的抗兔免疫球蛋白G血清抗體(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA，USA)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽-藍四唑基質(MossInc.，Pasadena,MD，USA))使其可視化。并且，各株的GTFB表達強度/GTFC表達強度之比，通過使用NIHimage軟件(NationalTechnicalInformationService,Springfield,VA，USA)的反應帶相對密度分析方法進行評價。發現GTFB、GTFC、及GTFD在全部試驗株中表達。但是，GTFB的強度在MT8148株中比在其他任何株中明顯增強，GTFB表達強度/GTFC表達強度之比為1.80±0.15。該值比MT8148GD的值(0.80±0.11)及血清型k株的其他血液分離株及口腔分離株的值(0.170.81的范圍)明顯增高(P〈0,001)。作為對照，在試驗的全部株中GTFD的表達強度沒有顯著差異。(D)CA-GTF及CF-CTF活性的測定使用以前所述方法(Matsumoto等，2003)，用["C]蔗糖合成["C]葡聚糖，評價CA-GTF及CF-CTF的活性。規定1單位的GTF活性為1umol的葡萄糖殘基在1分鐘內從蔗糖整合葡聚糖時所必要的酶量。血清型k的血液分離株TW295及TW871、及3個口腔分離株SU1、YK1及YT1分別與MT8148相比，都顯示明顯低的蔗糖依賴性粘附率、葡聚糖結合能、CA-CTF活性、CF-CTF活性(P〈0.001)。與對SHA的非蔗糖依賴性粘附率相同，試驗的血清型k株(除SU1株及YK1株之外)的值，比MT8148的數值顯著降低(P<0.001)。并且，在MT8148和試驗的其他株之間，菌體疏水性沒有顯著差異。(E)對大白鼠的齲齒誘發實驗根據以前所述方法(Nakano等，2002)，在36只無特異性病原體的(SPF)Sprague-Dawley大白鼠(CharlesRiverInc.，Osaka,Japan)(每組12只)上，試驗齲齒誘發活性。使試驗的3株(MT8148R、MT8148RGD及YK1R)分別以每天lX10tFU、連續5天給藥，經口感染1822天的大白鼠，到第72天評價每只大白鼠的菌斑及齲齒的得分。根據因素模型的統計學方差分析(ANOVA)評價各種因子在各組之間的差升°對于大白鼠，血清型k明顯誘發其齲齒。但是，MT8148R株和其突變株MT8148RGD以及口腔分離株YK1R之間，齲齒得分或菌斑指數沒有顯著差異(表8)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>(F)考察在本發明中，將通過gluA基因(編碼催化生成葡萄糖側鏈供給體的前體UDP-D-葡萄糖的酶)的插入失活構建的MT8148GD的生物學特性與親株(建議改為親本)MT8148的生物學特性進行比較。有報告指出，UDP-D-葡萄糖對低pH環境下的S.mutans的生存度很重要，因此，本發明者預測gluA基因自身能夠引起齲齒病原相關特性的變化。所以，本發明者構建了插入gluA基因失活的血清型k株FTl的突變菌株(FTlGD)。本發明者的結果表示FTl和FTlGD之間沒有顯著的生物學特性差異(表7)。這表明gluA基因自身的失活與該體外試驗(invitro)測定的特性之間沒有關系。因此，本發明者得出的結論是:血清型特異多糖的葡萄糖側鏈的存在對產生更高水平蔗糖依賴性粘附、非蔗糖依賴性附著、葡聚糖結合能力、進而對CA-CTF及CF-CTF活性都很重要。CA-CTF及CF-CTF的活性降低在血清型k的臨床分離株中表現突出(表7)。并且，血清型k的臨床分離株的CA-CTF活性及CF-CTF活性，與30個S.mutans分離株(16株血清型c、8株血清型e、6株血清型f)的CA-CTF活性及CF-CTF活性相比顯著降低。在本發明者以前的研究中已決定了體外試驗(Invitro)的粘附能所需要的最合適GTFB/GTFC/GTFD比率(Ooshima等，2001)。偏離該比率會對菌體的附著能、菌斑生物膜的結構產生影響(Idone等，2003)。本研究的免疫印跡法分析顯示，GTFB的表達，與MY8148相比，其在血清型k株中的表達有更低的傾向(圖19A、B)。此外，在圖19A中，利用7。/。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離全菌體(A)，使轉錄到PVDF膜上的蛋白質與S.mutans的CA-GTF的兔抗體反應。在圖19B中，用硫酸銨沉淀濃縮的培養上清液，該上清液用7。/。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，使轉錄到PVDF膜上的蛋白質條帶與CF-GTF的兔抗體反應。對各泳道進行說明，那么第1泳道是MT8148株，第2泳道是MT8148GD株，第3泳道是TW295株，第4泳道是TW871株，第5泳道是FT1株，第6泳道是FT1GD株，第7泳道是SU1株，第8泳道是YK1株，第9泳道是YT1株。有人認為GTFB承擔大部分不溶性葡聚糖的合成，并且其為變形鏈球菌向齒面附著及在牙垢內積蓄時重要的毒性因子(Mattos-Graner等，2000)。因此，血清型k株的低CA-CTF活性可能起因于GTFB的低表達。另一方面，其在菌體表層的表達可能與血清型特異多糖的葡萄糖側鏈的存在有關。總之，可以得出下述結論這些結果比S.mutans的其他主要表面結構(如GTF、PA及Gbp)更低，但S.mutans的血清型特異多糖的葡萄糖側鏈的缺失與S.mutans的齲齒病原相關。此外，在用于實施本發明的優選方式項中的具體實施方式或實施例，只不過是使本發明的技術內容更明確的部分，而不應該狹義地理解為僅限于這些具體例，只要是在本發明的精神和所述的權利要求書的范圍內，可以實施各種變更。到目前為止，對于與呈現感染性心內膜炎癥狀相關的S.mutans株，不容易將其與其他的S.mutans株辨別。但是，本發明可以容易地將參與感染性心內膜炎感染可能性高的S.mutans株判明為新型的血清型k型。因此，本發明不僅可應用于齒科醫療領域等醫療現場，而且可廣泛應用于醫藥品行業、檢査行業。從預防可能致人死亡的感染性心內膜炎發病的觀點來看，認為S.mutans血清型不確定菌株是重要的，本發明能夠提供有^C判明S.mutans血清型不確定菌株是否在被檢體中存在的方法。序列表〈SEQUENCELISTING><110>三得利株式會社(SUNTORYLIMITED)<120>新型血清型變形鏈球菌及其利用(AnovelserotypeofStreptococcusmutansandusethereof.)<130>SU0401<150>US60/533，076<151〉2003-12-30<150>JP,2004-106825<151>2004-03-31<160〉10<170>PatentlnVer.2.1<210>1<211>1752<212>DNA<213>變形鏈球菌(Streptococcusmutans)<400>1atgaaaagactacttttgtatgtgcattttaataaatataatcgtgtgagttctcatgtt60tactaccaactaacacaaatgcgccccttattttcaagagtagttttcatcacaaatagt120cacctatctcaggagaaccaagataagctgcgcagtcaaaagttgatggatgattttcta180c卿gggaaatttgacaatcttgtggg3tgggattgsctaacctttaaaaaatcatgcagttggatgctgatgcttcatgttt3tC33ggtatcctgatttt333g犯tCtttttaacggtttgtcacagtctacctatggctggccaatttagcgcaattttcgctataacattatggcgtcatgagttttaaatctg3gctattgagctcagcaccaatatatctttaatatcggtttttgattcttattaaggagcaataatcgtgcaagctgttatatattcaacggttttC33t3cagacttctcttaaagcgatattcgacctattagttatttaa犯agctgcgc組3ttggattttgttggcttggcgggaatggcactttcag3tgatgagtttgctgatttgatctgac3tacctttatttggtccagctgattttgcatg3tattgtcttacctgtccgactaagc3gtcaatcggagtgtcattgattgatgtcgttttactataattgacaataattcctattgat3ttgggtcacggttcatctcatttcatttttg鄉3g3ttacgtgatgtttcattttcatCCCC3333ttggatgcttggcatgaccaaatgtttggttttgtgcctgagct3C3ttgCtgcctttcatatgattttaactagggctgtcgcttggcgtgactgttatgat3tg犯aagctttaaggaacgcctttcatagattacgaaatttgatacgaccaacagct3caacatattactaatcgtttcatgtgtttttcttatgattctatctgcaacttcctatgtaccaaaaagtgacatgttggggtttggtgaaagattgatt333t3tg3tggaacctttactggaatgagccatatgggsg333tatatCCatgggatg犯acgatacttgaggacgag3tatattcaaagatttttgggactcaggtg3cccaaagaagattttgaatcacgccctatctcgcac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Str印tococcusmutans)〈400〉5atgaagcgcctgcttttatatgttcattttaataaatacaatcgggtaaggtttatcagttgactcaaatgagatccttgC33gtggc3gatgcggatgtcaa38tgct3caacggcagaattctggatttgactttgcatttgatgaacttgtgacatatgactcggtactttgggaaatgtattcaatttatcaagaaggattgactaataatcgtgcgactaagcagtcctttaaaaaagctgttattcaatcggagaatcatgcagatattcaacgtgtcattgatttagatgctggttttcaatatgatgtcgttatgcttcatgcagacttctcttactataattttatcaaggttaaagcgattgacaatastattcaaaagaattcgacctatcctattgattatcctgattttagttatttattgggtcacttaaagaatcaaaaagttgcggttcatctctttttaacggcatttaagcaatttcattttgatgataagaaagctgaaattgaagagattttttcaaaagttatctttatag3g犯aagc3tctcattgagcttggcgagatggaatggtacaaccatg3atgacacttgtttg333cca3g3cg3caigtttt33gg犯c3tattca3aggcctttcataatttttgggagatt3cg3aactcaggtcactttgat3cgaccaaggaagaccaacagctattttgaatcac犯catattacgccctatctttaattgtttcgcacatgtc33at3tgtcasgaaaagagacatgtgttttatgtggattttcttatgatttatttataacctatctgcaaacagtcaagattcccatgtc60ttcaaatagc120tgacttcatt180ctttgtcggt240ttttgg獄t300tgatttttgg360ctactttatt420gaacatccaa480gacaactctc540tgcttcgcat600tagggtgccc660ttt咖tgat7203g333tC33t780犯gagttgat8403ctgga3gaa900gac3gat3gt960agctcaggtt1020tttgtcacaggcaatattggacgtg3tgttcttcctatgttaaaattaaaaaattattta1080tctacctatgattttgttggtcattttcataccaaaaagtcaaaggaggctgatttttgg1140gctggccaatcttggcgggaagaattaattgacatgttggttaaaccagcagacaatatt1200ttagcgcaattacagcaaaacccaaaaattggtttggtgattgctgatatgccaactttc1260tttcgctataataaaattgttgatgcttggaatgaacattacattatggcaaaagatgggcatgaccaaaaagattgattgtcatgagttatggcacttttgtttggtttaaatatgatgtt犯atctgacagatgatgatgtgcctgaggaacctttacgctattgagcgtttgctgatctacattgcttggaatgagcaaaaatccagttgatctgacgcctttcatag3t3ataaattcagcaccaaatacctttgttgattttaactatatgggagt3tattttceittggtccagctagggctgtcaa3tat3tcctgattgcacctgagatgaat1320tcaatgcttttcatactttt1380ccttaaaaccgctctttgat1440cgcaaaattctattttacat1500attacgattttagaatttct1560tattaastgaacgtggcsac1620gaatsaaggg3gctttt3331680ttaaacgttctctgcaaaaa17401752〈210〉6<211>1752〈212〉DNA〈213〉變形鏈球菌(Streptococcusmutans)〈400〉6atgaagcgcctgcttttatatgttcattttaataaatacagtttatcagttgactcaaatgagatccttgttttcaaaagcaagtggcagatgcggatgtcaaaatgctaagagaaaagccaacggcagaattctggatttgactttgcagcttggcgagtttgatgaacttgtgacatatgactcggtaacaaccatgactttgggaaatgtattcaatttatcaagaatttgaaaccaggattgaccaacaaccgtgcaaccaagtcatttcgtgagcatcgggtaagttcccatgtcGOttatctttatttcaaatagc120atctcattgatgacttcatt180atggaatggtctttgtcggt.240atgacacttgttttggacct300agacg3cagttg3tttttgg360atattcaaagttactttatt420Lcat"aaagcatctgttttaagaagcaccgctttcagagacttttgggaaaatataaaa480gagtatcaggatgttcaaaaggtgattgatcagtatgaaacaaaggtcacgacaactctc540ttagatgctggttttcaatatgatgtcgtttttgatacgaccaaggaagaLgcttcgcat600atgcttcatgcagacttctcttactataatccaacagctattttgaatcatagggtgccc660tttatcaaggttaaagcgattgacaataatcaacatattacgccctatcttttaaatgat720attcaaaagaattcgacctatcctattgatttaattgtttcgcacatgtcagaaatcaat780tstcctgsttttagttatttattgggtcacaastatgtca3gaaaagaga犯gagttgat840ttasagaatcaaaaagctgcggttcatctccatgtgttttatgtggatttgctggaagaa900tttttaacggcatttaagcaatttcatttttcttatgatttatttatsacgacagatagt960gatgataagaaagctgaaattgaagagattctatctgcaaacagtcaagaggctcaggtt1020tttgtcacaggcaatattggacgtgatgttcttcctatgttaaaattaaaaaattattta1080tctacctatgattttgttggtcattttcataccaaaaagtcaaaggaggctgatttttgg1140gctggccaatcttggcgggaagaattaattgacatgttggttaaaccagcagacsatatt1200ttagcgcaattacagcaaaaccccaaaattggtttggtgsttgctgstatgccaactttc1260tttcgctataataaaattgttgatgcttggaatgaacatttgattgcacctgagatgaat1320acattatggcaaaagatgggcatgaccaaaaagattgatttcaatgcttttcacactttt1380gtcatgagttatggcacttttgtttggtttaaatatgatgccttaaaaccgctctttgat1440ttaaatctgacagatgatgatgtgcctgaggaacctttgccgca犯attctattttacat1500gctattgagcg"tattgatctacattgcttggaatgagcattacgattttagaatttct1560aaaaatccagttgatctgacgcctttcatagataataaattattaaatgaacgtggcaac1620tcagcaccaaatacctttgttgattttaactatatgggaggaataaagggagcttttaaa1680tatattttcattggtccagctagggctgtcaaatatatcctgaagcgttctctgcaaaaa1740at3aagtc3t1752<210〉7<211〉1742〈212〉腿〈213〉變形鏈球菌(Streptococcusmutans)〈400〉7atgaag.cgccgtttatcagtcaagtggcagC33CggC3g3tttgatgaacctttgggaaaggattgaccatc3tttaa3gttagatgctgatgcttcatgtttatcaaggattcaaaagatatcctgattttaaagaatctttttaacgggatgataagatttgtcacagtctgcctatggctggccaattacagcaaaaataaaattgt3333g3tgggtgcttttatatgactcaaatatgcggatgtattctggattttgtgacatatgtattcaatacaaccgtgccatctgttttatgttcaaaagttttcaatacagacttctctt333gcgatattcgacctattagttatttcatttaagcagc組attggattttgttggCttggCggg3cccaaaaatttgatgcttggcatgaccaaatgttcattttgagatccttgtgactttgcatgactcggtattatcaagaagaccaagtcaggtgattgactgatgtcgttttacteitaattgac犯ta3ttcctattgatattgggtcacggttcatctcatttcatttttgaagagattacgtgatgtttcattttcatggtttggtga33g3ttg3ttttttcaaaaggcttggcgagacaaccatgatttgaaaccatttcgtgagcgctttcagagcagtatg犯atttgatacgaccaacagctacaacatattattaattgtttaaatatgtcacatgtgtttttcttatgattctatccgcaacttcctatgtaccaaaaagtgat3tgttggttgctgatattgattgcacctcaatgctttatcgggtaagttatctttstatctcattga3tggaatggtatgacacttgagacgacsgtacttttggg3ttttgaatcacgccctatctcgcatatgtcatgtggattttatttataac3cggtcaagacaaaggaggcttaaaccagcgccaactttctg柳tg犯ttcatacttttttcccatgtc60ttC333t3gC120tgacttcatt180ctttgtcggt240ttttggacct300tgatttttgg360ttactttatt420480g3C33Ctctc540tgcttcgcat600tagggtgccc660ttta組gat7203ga犯tc33t780aagagttgat8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