專利名稱：一種丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢測的方法
技術領域：
本發明涉及病毒檢測技術領域，具體涉及丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢 測的方法。
背景技術：
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(H印atitis C virus, HCV)感染而引起的一 種全球性傳染病。據估計目前全世界有1.7億丙肝病毒感染者，我國的丙肝 感染率大約為3. 0%，目前至少有4000 6000萬丙肝患者。其中有80 85%的 感染者將發展為慢性丙型肝炎，其中又有20%可發展為肝纖維化，最終有4 5%的肝纖維化患者發生肝細胞性肝癌，危害十分嚴重。
目前，尚無針對丙型肝炎病毒的特效治療藥物，丙型肝炎疫苗的研制也 因HCV快速變異而困難重重，短期內難有突破進展。因此，HCV的早期診斷對 于篩查HCV傳染源、指導臨床治療和預后判斷有重大意義。
現有HCV常用檢測方式主要有(l)間接檢測用來檢測體內抗HCV抗體， 由于HCV感染后到抗HCV抗體的出現有一個約40 70天的"窗口期"，所以 抗HCV不能作為HCV感染的早期診斷指標；(2)直接檢測:通過定性或定量檢 測HCV病毒粒子的組成成分以確定病毒的存在。由于HCV感染后6 15天感 染者血液中即有HCV-RNA的出現，并在血清陽轉之前達到一個較高的水平， 因此采用該檢測技術對獻血員進行常規篩選可以大大降低"窗口期"感染的 危險，雖然定性或定量檢測HCV病毒粒子的方法具有早期、敏感和特異等特 點，但由于該技術需要昂貴精密的儀器、較高的實驗技巧、昂貴的試劑，且 容易導致交叉污染導致假陽性偏高,導致其很難推廣到單個獻血員，在發展中 國家的應用也受到很大程度的限制。
鑒于以上HCV病毒檢測方法的局限性，盡快研制出快速、準確、低廉并 在各大醫院可普及的HCV檢測方法成為必要。目前尚未有對HCV抗體和HCV核心抗原的聯合檢測，從而使HCV感染的"窗口期"大大縮短的相關報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種對HCV核心抗原和HCV抗體聯合檢測的方法， 使HCV感染的"窗口期"縮短至2周，從而達到準確、快速、便捷的檢測目的。 為實現上述目的，本發明的方法包括如下步驟
1) 通過計算機分析丙型肝炎病毒不同亞型的核心抗原序列，確定2個高 度保守、抗原性強的氨基酸序列QDVKFPGGGQIVGGVY、 PRGSRPSWGPTDPRRR， 再通過基因工程技術克隆表達HCV的全序列抗原，純化重組HCV-cAg并進行 活性鑒定；
2) 利用單克隆抗體技術制備2株高效分泌特異性抗HCV核心抗原的鼠源 雜交瘤細胞株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號分別為CCTCC N0:C200823、 CCTCC N0:C200824，進行抗體純化得到高比活的抗HCV核心抗 體；
3) 酶結合物制備:將凍干的辣根過氧化物酶純化后，與制備的單抗混合
使其形成酶結合物，再對酶結合物進行雙重純化并濃縮，-2(rc保存備用；
4) 重構HCV核心抗原和其它非結構蛋白的嵌合抗原所述的嵌合抗原通 過以下方式制備根據HCV全基因序列設計合成8條引物，用PCR分片段克 隆NS-3， NS-4、 NS-5和Core核心的相應基因片段，構建重組載體并轉化大腸 桿菌誘導表達蛋白，表達產物用親和層析進行純化再采用Western blot法鑒
定活性。
所述8條引物分別為
① HCV-core-F: TTG CTC GAG AGG CGA CAA CCT ATC C;
② HCV-core-R: GGC GGA GAC GGG CAG TCG GGG TGA CAG GAG;
③ HCV-NS3-F: CTC CTG TCA CCC CGA CTG CCC GTC TCC GCC; HCV-NS3-R: GCT ATC AGC CGG TTC ATG TCT ACA TTG GTG TAC; ⑤HCV-NS4-F: GTA CAC CAA TGT AGA CAT GAA CCG GCT GAT AGC;
4⑥ HCV-NS4-R: GGA GTA CGA CTC AAC CTG GGT AAC ACG CGC;
⑦ HCV-NS5-F: GCG CGT GTT ACC CAG GTT GAG TCG TAC TCC;
⑧ HCV-NS5-R: CAC TCG GGC ACA GGG AAG TTT GGC CTT GAC。
5)包被酶聯板并檢測將以上制備的抗HCV cAg的單克隆抗體和嵌合抗 原同時包被酶聯板，加入待測樣品進行檢測。
所述鼠源雜交瘤細胞株140-1己于2008年8月14保藏于中國典型培養 物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為中國武漢珞珈山武漢大學)，保藏編號 為CCTCC N0:C200823;鼠源雜交瘤細胞株140-2己于2008年8月14保藏于 中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為中國武漢珞珈山武漢大學)， 保藏編號為CCTCC N0:C200824。
本發明的技術方案能產生以下技術效果
1、 將抗HCV核心抗原的單克隆抗體與嵌合抗原同時包被酶聯板進行檢測， 在大大縮短HCV "窗口期"的同時能有效降低病毒漏檢率；
2、 對全長核心抗原進行改構，嵌合非結構區并實現嵌合抗原的表達，能 盡可能檢出血清中的HCV抗體并與包被的單抗相容，避免了嵌合抗原與單抗 相互結合，其陽性檢出率和PCR陽性檢出率接近；
3、 抗原抗體聯合檢測操作簡單、與目前酶聯免疫設備相容、價格低廉易 于推廣。
圖1: HCV核心片段的PCR擴增結果
M、分子量標準。1陰性血清；2、陽性血清樣品
圖2:純化后的IgG的SDS-PAGE電泳圖
1、單克隆抗體株N0:C200823; 2、單克隆抗體株N0:C200824 圖3:融合蛋白的純化結果
M、蛋白分子量標準；1、包涵體；2、嵌合蛋白
具體實施例方式
以下實施例旨在說明本發明而不是對本發明的進一步限定，本發明可以
按發明內容所述的任一方式實施。此外，本領域普通技術人員應能理解，HCV 抗原、抗體的檢測是可以分開或同時進行的。
實施例一丙肝抗原抗體聯合檢測
一、HCV核心重組抗原的制備
1、 選擇HCV核心抗原決定簇表位
對不同亞型HCV核心抗原氨基酸序列進行分析，以及對HCV-cAg的抗原性、 親水性、抗原表位的Macvector程序分析，選擇序列保守、抗原性強的抗原部 位，確定了 2個不同抗原決定簇氨基酸(AA)序列，如表1所示
表1四個不同HCV亞型抗原決定簇序列
編號 AA位置
C20-35 20-35 C100-115_100-115
2、 HCV核心重組抗原的克隆表達
選擇2-160位氨基酸序列進行重組克隆表達，用pBVILl表達的基因來源
如表2所示
表2 pBVILl質粒表達基因來源 多肽名稱 基因模板 來源 起止aa位置
HCV-core 質粒 pBRTM/HCV 2-160aa
在用于擴增基因的引物中均含有酶切位點(正向引物中為Xhol，反向引物 中為Xbal)，擴增產物經雙酶切后插入以同樣雙酶切的載體pBVILl。上述構 建的HCV-c抗原基因片段表達質粒，轉化用常規氯化鈣法致敏的E.coli菌 HBIOI，經含有氨芐抗菌素的平板培養，選取菌落擴增培養后，以堿變性法抽 提質粒，以PCR法篩選陽性克隆，擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖l)。
3、 重組HCV-cAg的純化和活性鑒定
HCV-C抗原經S-S印harose柱階段梯度洗脫，收集0. 15M NaCl洗脫峰，
M系列
QDVKFPGGGQIVGGVY PRGSRPSWGPTDPRRR
6再經S印hadex G50柱脫鹽，收集第一個洗脫峰。用SDS-PAGE方法鑒定抗原 純度，蛋白質上樣量為10Pg的條件下僅存一條帶，掃描純度>95%。用已純 化HCV-c抗原對室內質控血清進行ELISA試驗以測定活性。純化后的抗原于 -2(TC低溫保存。已純化HCV-c抗原對室內質控血清(IO份HCV抗體陽性血清， 10份HCV抗體陰性血清)進行ELISA試驗以測定活性。
二、抗丙型肝炎病毒核心抗原的單克隆抗體制備
1、 不同表位抗丙型肝炎病毒核心抗原的單克隆抗體制備
以重組HCV-cAg免疫Balb/c小鼠(鼠齡6-8周)，取脾細胞與骨髓瘤細 胞(SP2/0細胞)按9:1比例混合，PEG促融合，于HAT培養液(20%胎牛血 清/DMEMlXHAT)上融合成雜交瘤細胞。
當雜交瘤克隆生長達總面積15%-20%時即可開始對其上清檢測，利用培養 基與包埋目標抗原的多孔培養板結合，用ELISA方法檢測雜交瘤細胞是否產 生抗體，從而篩選出目標克隆系。
將雜交瘤細胞由皮下植入小鼠體內制備腹水。取腹水用ELISA方法篩選 出抗體高分泌性細胞，轉移至常規1640培養基克隆化培養，收集至10-20L 細胞株培養液。用1640常規培養基稀釋后轉移到的培養罐中，克隆化培養出 抗體特異性單克隆細胞系。培養罐中細胞培養遵守物料平衡，上清收集率為 99%，殘余細胞收集率為1%。
2、 單抗純化及鑒定
釆用辛酸-硫酸銨沉淀法沉淀單抗腹水或收集液，透析分離純化單抗成 分，將透析液上清S印hadexG-50層析柱進行離子交換層析，用pH 7. 2/0. 01M PBS洗脫，收集第一洗脫峰，再用PEG2000濃縮收集。將最后得到濃縮液稀釋 10倍，測280nmOD值，計算純化抗體的濃度。本工藝制得抗體濃度標準為不 低于3ug/ml。
用SDS-PAGE方法鑒定純度上樣量10ug，純化后的抗-IgG在SDS-PAGE 上呈二條區帶(見圖2)。檢定合格后分裝，凍干，-2(TC保存備用。
用合成不同丙型肝炎病毒核心抗原的多肽氨基酸位置20-35aa， 35-50aa，100-115aa， 115-130aa分別包被酶聯板進行單克隆抗體的篩選，篩選陽性克隆進行亞克隆，挑選出不同表位的單克隆。從而對不同表位的抗丙 型肝炎病毒的單克隆抗體篩選與鑒定。
三、 酶結合物制備
取5mg的HRP溶于1. 0ml NaHC(V溶液中，加入適量0. 06M的Nal04室溫 避光攪拌30分鐘，移入透析袋，用0.01M pH9.6碳酸鹽緩沖液透析過夜。取 純化酶標單抗5mg，用0. 01MNaHC03溶液充分溶解后與酶液混合，裝入透析袋， 用0. 01M pH9. 6碳酸鹽緩沖液4'C避光透析20小時，中間換液3次。取透析 后結合液加入0. 4%NaBH4 0,2ml，攪拌30分鐘后，4。C放置4小時。
將酶結合物裝入透析袋，用pH 7. 2 0.01M PBS透析48小時。S印hadex G-200凝膠過濾將透析液上S印hadex G-200層析柱，用pH 7.2、 O.OIM的 PBS洗脫，收集第一個的洗脫峰，再用PEG2000濃縮，一2(TC保存備用。抗人 IgG酶標記物采用方陣滴定，以間接ELISA法測定效價。為l: 5000倍。
四、 重構HCV核心抗原和其它非結構蛋白的嵌合抗原
參照H印atitis C virus subtype lb (AY460204)的基因序列，設計8 條重疊延伸PCR引物，引物由上海生工合成
1) HCV-core-F: TTG CTC GAG AGG CGA CAA CCT ATC C;
2) HCV-core-R: GGC GGA GAC GGG CAG TCG GGG TGA CAG GAG;
3) HCV-NS3-F: CTC CTG TCA CCC CGA CTG CCC GTC TCC GCC;
4) HCV-NS3-R: GCT ATC AGC CGG TTC ATG TCT ACA TTG GTG TAC;
5) HCV-NS4-F: GTA CAC CAA TGT AGA CAT GAA CCG GCT GAT AGC;
6) HCV-NS4-R: GGA GTA CGA CTC AAC CTG GGT AAC ACG CGC;
7) HCV-NS5-F: GCG CGT GTT ACC CAG GTT GAG TCG TAC TCC;
8) HCV-NS5-R: CAC TCG GGC ACA GGG AAG TTT GGC CTT GAC。
用PCR分片段克隆NS-3、 NS-4、 NS-5和Core核心的相應基因片段，然 后用重疊延伸PCR將這四個片段連接成嵌合基因，再將其插入表達載體 pBV-IL2構建成重組載體，以其轉化大腸桿菌(JM109)誘導表達蛋白，表達產 物用Q型離子交換層析法和分子篩進行純化(圖3)。純化產物采用Western blot法鑒定活性首先進行SDS-PAGE (凝膠濃度 為100 g/L)，再轉移到硝酸纖維膜上，依次加100 g/L脫脂奶粉、1 : 1 000稀 釋的人HCV抗體陽性血清及1 : 20 000服P2鼠抗人IgG，最后以二氨基聯苯 胺(DAB)顯色。
五、HCV抗原抗體聯合檢測
1、 材料
1) HCV抗原抗體的血液陽性標本
來自湖南景達生物工程有限公司岳陽君山單采血漿站和屈原單采血漿站
收集的HCV抗原或抗體或抗原抗體同時陽性標本，這些HCV抗體或抗原陽性 的確認使用的檢測試劑來自羅氏公司試劑盒(COBAS AMPLICOR HCV MONITOR KIT;HCV ELISA TEST KIT (SP-NANBASE C-96 3. 0))和深圳匹基公司HCV核 酸定量檢測試劑盒.
2) 單克隆抗體
單克隆抗體c20-35由鼠源雜交瘤細胞株CCTCC N0:C200823分泌，針對 HCV核心蛋白的N-末端部分(氨基酸20-35);單克隆抗體c100-115由鼠源雜 交瘤細胞株CCTCC N0:C200824分泌，針對HCV核心蛋白的C-末端部分(氨基 酸100-115)。 cl00-115抗體與辣根過氧化物酶(服P)用標準方法偶聯。
3) 嵌合抗原
嵌合抗原含有399個氨基酸殘基，其中融合了核心(氨基酸60-100)、 NS3 (1000-1105)、 NS4 (1917-1947)和NS5 (2383-2453)的片段，并與白介素 (IL2，含150個氨基酸基)融合多肽在大腸桿菌中表達純化得到。
2、 方法
將2mg/ml純化的抗HCV cAg的單克隆抗體C20-35和1XPBS(pH7. 4)， pH7. 5并充分混合。在同一緩沖液中加入2mg/ml重組嵌合蛋白(包含核心片段 C-NS3-NS4-NS5)，混合溶液20分鐘，包被酶標板100 u L/每孔，放置平板于 4。C冰箱16-24小時。然后用1 xPBS洗滌平板三次.然后在抗原抗體包被的微 孔板中每孔加入300uL封閉緩沖液(1。/。的BSA， 1XPBS(pH7.4)，甘露醇，聚 乙二醇，明膠)一小時，吹洗平板并在4'C凍千器上干燥24小時，平板在有干
9燥劑的條件下保存。
在平板中加入lOOmLPBS溶液以稀釋lOOmL待測樣品，用微量管把稀釋過 的樣品移入HCV抗原/抗體包被的微孔中，然后在37'C培養60分鐘，然后用 含有0. 5%Tween20的PBS溶液洗滌5次。往微孔中加入200 u L辣根過氧化物 酶(HRP)標記的鼠源抗人IgG和HRP標記的抗HCV核心單克隆抗體(Anti C100-U5)，培養30分鐘后用含有Tween20的PBS溶液洗滌5次。再往微孔 中加入鄰苯二胺和過氧化氫，避光顯色10分鐘，最后加入2mol/L硫酸50 u L 終止反應。用BI0-RAD酶標儀測在A450nm的光下檢測微孔板，計算待測樣品 孔A450nm與陰性對照孔平均A450nm的比值(P/N)， P/N》2. 1判定為陽性。 任何一個微孔中顯現橙色光就表明被測試樣品被HCV感染。
3、結果
試驗的結果如表3所示，對感染HCV的血液樣品進行檢測。抗體/抗原聯 合檢測可以同時檢測出血液中的HCV病毒粒子和抗體。提高HCV感染的檢出 率。
表3: HCV陽性樣品ELISA檢測結果
樣品 抗原抗體聯合(OD值) 陰性樣品平均值 0.065
HCV抗體陽性標本平均值(n=105) 1.842 HCV抗原陽性標本平均值(n=30) 1.643 HCV抗原抗體雙陽性標本平均值(n=ll) 2.45權利要求
1、一種丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢測的方法，其特征在于通過以下步驟實現1)通過計算機軟件分析丙型肝炎病毒不同亞型的核心抗原序列，確定2個高度保守、抗原性強的氨基酸序列QDVKFPGGGQIVGGVY、PRGSRPSWGPTDPRRR；2)利用單克隆抗體技術制備2株高效分泌特異性抗HCV核心抗原的鼠源雜交瘤細胞株，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號分別為CCTCCNOC200823、CCTCC NOC200824，進行抗體純化得到高比活的抗HCV核心抗體；3)將凍干的辣根過氧化物酶純化后，與制備的單抗混合形成酶結合物；4)重構HCV核心抗原和其它非結構蛋白的嵌合抗原；5)將以上制備的抗HCV cAg的單克隆抗體和嵌合抗原同時包被酶聯板，加入待測樣品進行檢測。
2、 根據權利要求1所述的一種丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢測的方法， 其特征在于，所述的嵌合抗原通過以下方式制備根據HCV全基因序列設計 合成8條引物，用PCR分片段克隆NS-3， NS-4、 NS-5和Core核心的相應基 因片段，構建重組載體并轉化大腸桿菌誘導表達蛋白，表達產物用親和層析進 行純化再采用Western blot法鑒定活性。
3、 根據權利要求2所述的一種丙型肝炎病毒抗原抗體聯合檢測的方法， 其特征在于，所述8條引物分別為1) HCV-core-F: TTG CTC GAG AGG CGA CAA CCT ATC C;2) HCV-core-R: GGC GGA GAC GGG CAG TCG GGG TGA CAG GAG;3) HCV-NS3-F: CTC CTG TCA CCC CGA CTG CCC GTC TCC GCC;4) HCV-NS3-R: GCT ATC AGC CGG TTC ATG TCT ACA TTG GTG TAC;5) HCV-NS4-F: GTA CAC CAA TGT AGA CAT GM CCG GCT GAT AGC;6) HCV-NS4-R: GGA GTA CGA CTC AAC CTG GGT AAC ACG CGC;7) HCV-NS5-F: GCG CGT GTT ACC CAG GTT GAG TCG TAC TCC;8) HCV-NS5-R: CAC TCG GGC ACA GGG AAG TTT GGC CTT GAC。
全文摘要
本發明公開了一種丙型肝炎病毒(HCV)抗原抗體聯合檢測的方法，將抗HCV核心抗原的單克隆抗體與嵌合抗原同時包被酶聯板進行檢測，能大大縮短HCV病毒檢出的“窗口期”。此外，通過對HCV全長核心抗原進行改構、嵌合非結構區并實現嵌合抗原的表達，能盡可能檢出血清中的HCV抗體并與包被的單抗相容，避免了嵌合抗原與單抗相互結合，其陽性檢出率和PCR陽性檢出率接近。本發明的HCV檢測方法還具有操作簡單、價格低廉的優點，適于推廣使用。
文檔編號G01N33/576GK101477126SQ20081014327
公開日2009年7月8日 申請日期2008年9月24日 優先權日2008年9月24日
發明者馮驚濤, 周松華, 周見遠, 張賀秋, 聶東宋, 胡道奇, 輝 趙 申請人:湖南景達生物工程有限公司