專利名稱：：Hplc法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法
技術領域：
：本發明涉及中藥質量檢測領域，特別是一種HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸v咖啡酸含量的方法。二、
背景技術：
蒲公英為常用中藥，對其質量控制還沒有統一的標準。中國藥典對蒲公英的質量控制僅局限于咖啡酸單種成分的薄層鑒別及含量測定，仍釆用了對西藥質量控制的模式，不能全面地反映蒲公英的內在質量。現雖有人對不同地區蒲公英中咖啡酸的含量進行測定時，采用乙腈一0.2%磷酸為流動相、常溫梯度洗脫，建立了快速、穩定的HPLC定量分析蒲公英中咖啡酸含量的方法。但是蒲公英藥材品種比較混亂，質量不易控制，且常以浸膏作為制劑(蒲公英片劑、浸膏統稱制劑，)入藥，療效好，價格便宜，而蒲公英浸膏作為蒲公英制劑的中間產品，是影響成品質量的關鍵因素之一。目前對蒲公英制劑的質量控制還沒有統一的標準。咖啡酸、綠原酸為蒲公英中清熱解毒主要成分，因蒲公英所含成分比較復雜，難以把咖啡酸、綠原酸與其它成分很好的分離，達到液相定量測定的要求，中國藥典(2005年版)中蒲公英的含量測定項下，僅用HPLC法(高效液相色譜法)測定其中一個咖啡酸的含量。而綠原酸也為蒲公英中主要的抗菌成分，僅測出咖啡酸含量，并不能全面反映出蒲公英制劑的質量情況，故建立一種能同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法具有重要的意義。三、
發明內容針對上述情況，為克服現有蒲公英制劑的質量控制缺陷，本發明的目的在于提供一種HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法，可有效解決以綠原酸和咖啡酸作為指標性成分，同時進行含量測定，對蒲公英制劑的質量標準奠定基礎解決的問題，實現本發明的具體技術方案是分別制備供試品溶液和對照品溶液，用RP-HPLC法(反相高效液相色譜法)測定綠原酸、咖啡酸含量，其特征是對照品為綠原酸、咖啡酸；色譜條件為色譜柱為AichromBond-AQ柱(250咖X4.6mm，5ura)，流動相為甲醇一0.015%磷酸水，其中流動相A為甲醇，流動相B為體積濃度0.015%的磷酸水，采用梯度洗脫，0.01—20min時，流動相A:流動相B的體積比為20%:80%(即O.Olmin時，流動相A與流動相B的體積比為20%:80%,保持到20min)，在20—40min，流動相A:流動相B的體積比為30%:70%(即在20—40min時，流動相A與B的體積比由初始時的2096:80%逐漸改變到30%:70%)，梯度洗脫程序見表l，流速為1.Oml/min，檢測波長為323nm，柱溫30。C4(TC。柱溫最優為35i:。表1梯度洗脫程序時間(min)甲醇(A)(%)0.015%磷酸水溶液(B)(%)0,012080202080403070在測定綠原酸、咖啡酸含量前，利用流動相先對色譜柱進行平衡，流動相A與流動相B初始體積比為309&:7(m，在0—2min，流動相A與流動相B的體積比改變為2(m:8(m，保持到22min，流速為1.Oml/min，平衡色譜柱程序見表2。表2平衡色譜柱程序時間(min)流動相A(%)流動相B(%)0307022080222080本發明測定方法中，供試品溶液和對照品溶液的制備方法為:取蒲公英浸膏粉末O.16g左右(相當于1克藥材)，加入體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液(5%甲酸的甲酸甲醇溶液或稱為5%甲酸的甲醇溶液，是指以體積計甲酸5%、甲醇95%構成的溶液，以下同)20ml，稱定重量，超聲提取30min，取出，放至18—25'C，加體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液補足減失重量，過濾，取續濾液，再過濾，即得蒲公英浸膏供試品溶液；取蒲公英片劑粉末0.27g左右，加入體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液10ml，稱定重量，超聲提取30min，取出，放至18—25。C，加體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液補足減失重量，過濾，取續濾液，再過濾，即得蒲公英片劑供試品溶液；取咖啡酸對照品，加甲醇配成咖啡酸質量濃度為0.066mg/ml的咖啡酸溶液，過濾，即得咖啡酸對照品溶液。取綠原酸對照品，加甲醇配成綠原酸質量濃度為0.0784mg/ml的綠原酸溶液，過濾，即得綠原酸對照品溶液。稱取蒲公英制劑，分別加入O.0784mg/ml綠原酸對照品溶液lml，0.066mg/ml咖啡酸對照品溶液2.5ml，即加入綠原酸對照品0.0784mg，咖啡酸對照品0.165mg，得混合對照品溶液。上述制備的供試品溶液和對照品溶液用0.45um微孔濾膜過濾，進樣量為5y1，記錄時間40min。本發明中所稱的蒲公英制劑是指蒲公英浸膏和蒲公英片劑。本發明采用RP-HPLC法(反相高效液相色譜法)，梯度洗脫，測得蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量。結果咖啡酸在0.0264iig0.528ug范圍內有良好的線性關系，平均回收率為99.09%，RSD為1.52%;綠原酸在0.03136ug0.6272ug范圍內有良好的線性關系，平均回收率為98.52%，RSD為1.64%。本發明方法簡便、可靠、迅速，靈敏度高，重現性好,回收率高，以綠原酸和咖啡酸作為指標性成分，為蒲公英及其制劑質量標準的制定奠定了基礎，提供了更科學的依據。四圖1為咖啡酸對照品色譜圖。圖2為綠原酸對照品色譜圖。圖3為蒲公英浸膏供試品色譜圖。圖4為蒲公英片劑供試品色譜圖。五具體實施方式以下結合具體情況對本發明的具體實施方式作詳細說明。實施例1:1.儀器與試藥LC-10AD(日本島津)高效液相色譜儀，紫外檢測器，HW-2000色譜工作站；METTLERAE240型十萬分之一分析天平，HANGPINGJA2003型電子天平，KQ-500DV型數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；色譜甲醇(天津四友精細化學6品有限公司)，水(娃哈哈純凈水)，其它試劑均為分析純。咖啡酸、綠原酸對照品為中國藥品生物制品檢定所生產，咖啡酸批號110885-200102，綠原酸批號110753-200413。蒲公英藥材購自鄭州市東升醫藥商店(河南產蒲公英)。蒲公英浸膏及蒲公英片為自制。2.方法與結果2.1色譜條件與系統適用性試驗色譜條件為色譜柱為AichromBond-AQ柱(250ramX4.6mm，5wm)，流動相為甲醇一0.015%磷酸水，其中流動相A為甲醇，流動相B為體積濃度0.015%的磷酸水，梯度洗脫，梯度洗脫程序及平衡色譜柱程序見表1、2,流速為1.0ml/rriin，檢測波長為323nm，柱溫35'C，進樣量為1。在上述色譜條件下，對照品和供試品的色譜圖見圖1-4:表1梯度洗脫程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2平衡色譜柱程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.2對照品溶液的制備取咖啡酸對照品，加甲醇配成咖啡酸質量濃度為0.066mg/ml的咖啡酸溶液，過0.45um微孔濾膜，即得咖啡酸對照品溶液。取綠原酸對照品，加甲醇配成綠原酸質量濃度為0.0784mg/ml的綠原酸溶液，過0.45"m微孔濾膜，即得綠原酸對照品溶液。浸膏制備方法取蒲公英，加水煎煮1.5小時，濾過，70—80'C,濾液濃縮至相對比重為1.11.4，75。C時，溶縮至比重1.24，加2.5倍量的乙醇，靜置使其沉淀，濾取上清液，濃縮，在8(TC以下干燥成干浸膏。稱取蒲公英浸膏0.08g，分別加入0.0784mg/ml綠原酸對照品溶液lml，0.066mg/ml咖啡酸對照品溶液2.5ml，即加入綠原酸對照品0.0784mg，咖啡酸對照品O.165mg，得混合對照品溶液。2.3供試品溶液的制備稱定蒲公英浸膏粉末0.16g左右(相當于1克藥材)，加入體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液20ml，稱定重量，超聲提取(功率250W，頻率40kHz)30min，取出放至18—25"C，加體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液補足減失重量，過濾，取續濾液，用0.45um微孔濾膜過濾，即得蒲公英浸膏供試品溶液。稱定蒲公英片劑粉末0.27g左右，加入體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液10ml，稱定重量，超聲提取(功率250W，頻率40kHz)30min，取出放至18—25°C，加體積濃度為5%甲酸的甲酸甲醇溶液補足減失重量，過濾，取續濾液，用0.45ym微孔濾膜過濾，即得蒲公英片劑供試品溶液。2.4樣品含量的測定取待測10批浸膏，按照2.3項下供試品制備方法進行處理，制備浸膏溶液，注入液相色譜儀，每個樣品進樣兩針，進樣后根據峰面積用標準曲線法計算樣品含量，取其平均值為平均百分含量，結果見表3。結果表明蒲公英浸膏中咖啡酸、綠原酸含量較穩定。表3十批浸膏含量<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>取待測10批片劑，按照2.3項下供試品制備方法進行處理，制備片劑溶液，注入液相色譜儀，每個樣品進樣兩針，進樣后根據峰面積用標準曲線法計算樣品含量，.取其平均值為平均百分含量，結果見表4。結果表明蒲公英浸膏中咖啡酸、綠原酸含量較穩定。表4十批片劑含量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例2方法學考察1.線性關系考察稱取咖啡酸對照品適量，加甲醇配成0.066mg/ml的對照品溶液，分別進樣0.4、0.8、2、3、8ul，按照實施例1中色譜條件進樣測定峰面積，以質量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為Y二l.444e+006X，r=0.9999，在0.0264yg0.528ug范圍內有良好的線性關系。稱取綠原酸對照品適量，加甲醇配成0.0784mg/ml的對照品溶液，分別進樣0.4、1、2、3、8ul，按照實施例1中色譜條件進樣測定峰面積，以質量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為Y二l.003e+006X，r=0.9999，在0.03136ug0.6272ug范圍內有良好的線性關系。2.穩定性試驗稱定蒲公英浸膏J10號樣品0.16g，按照實施例1中2.3項下蒲公英浸膏供試品制備方法進行處理，制備浸膏溶液，分別在0h、lh、2h、4h、8h、12h、24h進樣，共進樣7次，記錄綠原酸、咖啡酸的峰面積，綠原酸峰面積變異系數為1.54%，咖啡酸峰面積變異系數為1.22%，表明蒲公英浸膏供試品溶液在24h內穩定。3.色譜系統的精密度試驗稱定蒲公英浸膏J10號樣品0.16g，按照實施例1中2.3項下蒲公英浸膏供試品制備方法進行處理，制備浸膏溶液，連續進樣5次，記錄綠原酸、咖啡酸的峰面積，綠原酸峰面積變異系數為2.13%、咖啡酸峰面積變異系數為1.02%，表明色譜系統精密度良好。4.方法重復性試驗稱定蒲公英浸膏J10號樣品0.16g，共取5份，按照實施例1中2.3項下蒲公英浸膏供試品制備方法進行處理，制備浸膏溶液，進樣后記錄咖啡酸、綠原酸的峰面積，5份樣品中綠原酸含量變異系數為1.87%，咖啡酸峰含量變異系數為1.43%，表明方法重復性良好。5.回收率試驗稱取蒲公英浸膏J10號樣品0.08g，共5份，分別加入0.0784mg/ml綠原酸標準溶液lml,0.066mg/ml咖啡酸標準溶液2.5ml，即加入綠原酸對照品0.0784mg，咖啡酸對照品0.165mg，得混合對照品溶液，按照實施例1中2.3項下蒲公英浸膏供試品制備方法進行處理，制備浸膏溶液，進樣后根據峰面積用標準曲線法計算含量，求出回收率，綠原酸平均回收率為98.52%，RSD為1.64%，咖啡酸平均回收率為99.09%，RSD為1.52呢，結果見表5。表5加樣回收試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>綜上，本發明方法是在一個條件下同時對兩個有效成分進行含量測定，方法簡單、快速、準確，是蒲公英及其制劑有效成分含量測定的理想方法。發明人曾嘗試用等度洗脫測定綠原酸、咖啡酸含量，但發現雖然出峰時間較快，但峰形及分離度都不佳，后采用梯度洗脫，30分鐘內綠原酸和咖啡酸都出峰，且分離良好，峰形較佳，重復性較好。流動相采用甲醇一磷酸水，且PH值適宜，同時測定綠原酸和咖啡酸兩個有效成分，優于藥典法。權利要求1、HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法，是分別制備供試品溶液和對照品溶液，用RP-HPLC法測定綠原酸、咖啡酸含量，其特征是對照品為綠原酸、咖啡酸；色譜條件為色譜柱為AichromBond-AQ柱，250mm×4.6mm，5μm，流動相為甲醇-0.015％磷酸水，其中流動相A為甲醇，流動相B為體積濃度0.015％的磷酸水，采用梯度洗脫，0.01-20min時，流動相A∶流動相B的體積比為20％∶80％即0.01min時，流動相A與流動相B的體積比為20％∶80％，保持到20min，在20-40min，流動相A∶流動相B的體積比為30％∶70％，即在20-40min時，流動相A與B的體積比由初始時的20％∶80％逐漸改變到30％∶70％，流速為1.0ml/min，檢測波長為323nm，柱溫30℃～40℃；在測定綠原酸、咖啡酸含量前，利用流動相先對色譜柱進行平衡，流動相A與流動相B初始體積比為30％∶70％，在0-2min，流動相A與流動相B的體積比改變為20％∶80％，保持到22min，流速為1.0ml/min；供試品溶液和對照品溶液的制備方法為取蒲公英浸膏粉末0.16g左右，加入體積濃度為5％甲酸的甲酸甲醇溶液20ml，稱定重量，超聲提取30min，取出，放至18-25℃，加體積濃度為5％甲酸的甲酸甲醇溶液補足減失重量，過濾，取續濾液，再過濾，即得蒲公英浸膏供試品溶液；取蒲公英片劑粉末0.27g左右，加入體積濃度為5％甲酸的甲酸甲醇溶液10ml，稱定重量，超聲提取30min，取出，放至18-25℃，加體積濃度為5％甲酸的甲酸甲醇溶液補足減失重量，過濾，取續濾液，再過濾，即得蒲公英片劑供試品溶液；取咖啡酸對照品，加甲醇配成咖啡酸質量濃度為0.066mg/ml的咖啡酸溶液，過濾，即得咖啡酸對照品溶液；取綠原酸對照品，加甲醇配成綠原酸質量濃度為0.0784mg/ml的綠原酸溶液，過濾，即得綠原酸對照品溶液；稱取蒲公英制劑，分別加入0.0784mg/ml綠原酸對照品溶液1ml，0.066mg/ml咖啡酸對照品溶液2.5ml，即加入綠原酸對照品0.0784mg，咖啡酸對照品0.165mg，得混合對照品溶液。2、根據權利要求1所述的HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法，其特征在于，所說的柱溫為35'C。3、根據權利要求1所述的HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法，其特征在于，所說的制備的供試品溶液和對照品溶液用0.45ym微孔濾膜過濾，進樣量為5ul，記錄時間40min。4、根據權利要求1所述的HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法，其特征在于，所說的蒲公英制劑是指蒲公英浸膏和蒲公英片劑。全文摘要本發明涉及一種HPLC法同時測定蒲公英制劑中綠原酸、咖啡酸含量的方法，可有效解決以綠原酸和咖啡酸作為指標性成分，同時進行含量測定，對蒲公英制劑的質量標準奠定基礎解決的問題，實現本發明的具體技術方案是分別制備供試品溶液和對照品溶液，用RP-HPLC法，梯度洗脫，流動相采用甲醇—磷酸水，測定綠原酸、咖啡酸含量，本發明方法簡便、可靠、迅速，靈敏度高，重現性好，回收率高，以綠原酸和咖啡酸作為指標性成分，為蒲公英及其制劑質量標準的制定奠定了基礎，提供了更科學的依據。文檔編號G01N30/06GK101324546SQ200810140829公開日2008年12月17日申請日期2008年7月28日優先權日2008年7月28日發明者璐孟,師繪敏,朱艷琴,李喜鳳,董誠明,閩許,陳隨清申請人:河南中醫學院