專利名稱：：醬油等調味品中菌落總數快速檢測方法
技術領域：
：本發明涉及凋味品
技術領域：
，具體地說，本發明涉及一種醬油等調味品中菌落總數快速檢測方法。
背景技術：
：醬油等調味品中菌落總數是食品衛生的一項重要指標。目前檢測方法主要是利用平板計數方法，該方法檢測需要48小時，往往存在滯后現象。在此基礎上改進方法仍需要培養12小時以上，不能達到快速檢測的目的。目前文獻報道ATP生物方法快速檢測菌落總數，該方法是利用菌體本身的ATP為檢測對象，然而醬油等調味品經過巴氏殺菌，大部分不耐熱菌被殺死，部分為亞致死狀態，有些菌轉變為芽孢狀態，因此菌體生長狀態不一致，同時醬油等調味品成分復雜，存在干擾ATP生物發光體系的物質，因此在利用該方法檢測時往往與實際菌落總數存在很大差異。
發明內容本發明克服了現有技術中的缺點和不足之處，提出了一種醬油等調味品中菌落總數快速檢測方法。發明人認為針對復雜的醬油等調味品樣品，應當解決樣品中菌體分離富集和解決菌體生理狀態問題，去除干擾物質；對菌體進行修復復壯，保證菌體生理狀態一致性，從而保證ATP生物發光檢測結果與菌落計數方法結果的一致性，保證ATP發光檢測方法適用于醬油產品菌落總數的快速檢測。故而，本發明提出了以下技術方案一種調味品中菌落總數快速檢測方法，包含以下步驟A.利用膜分離技術分離富集菌體，去除影響菌體生長和發光體系的物質；B.利用培養基修復亞致死細菌，轉化芽孢為營養體細胞，使細菌處于同歩生長狀態；C.菌懸液弓ATP發光試劑發應，根據發光值檢測得出菌落總數;所述的培養基由以下組分組成每1000ml蒸餾水中含有牛肉浸出粉2--5g，酪蛋白水解物15—20g，可溶性淀粉0.5—3g，無水葡萄糖3--7g，L-丙氨酸0.5—lg，肌苷0.25—0.5g，L-天門冬素0.5—2g。所述的調味品是醬油。所述的分離富集菌體采用以下步驟吸取一定量的待測樣品，利用無菌生理鹽水稀釋5—40倍，再進行真空過濾，濾過0.2-0.45um濾膜，最后以無菌生理鹽水洗滌3—5次，去除干擾雜質。所述的修復亞致死細菌采用以下步驟將分離的菌體懸浮于修復培養基中在35---37°C的氣浴恒溫搖床上修復2_3小時。所述的發光值檢測，將修復的菌體懸液50_100|il與50_lOOialBacl'itcr-GoTM檢測試劑反應，利用發光光度計于530—590nm處檢測發光值。本發明還涉及一種用于調味品中菌落總數快速檢測的培養基，該培養基由以下組分組成每1000ml蒸餾水中含有牛肉浸出粉2—5g，酪蛋白水解物15--20g，可溶性淀粉0.5—3g，無水葡萄糖3—7g，L-丙氨酸0.5—lg，肌苷0.25—0.5g，L-天門冬素0.5—2g。培養基提供細菌生長必需的-營養元素，同時添加促進芽孢萌發的化學物質和促進受傷細菌修復的修復因子，即L-天門冬素、L-丙氨酸和肌苷。本發明的優點在于本發明針對醬油等調味品成分復雜特點，利用菌體分離富集技術，富集菌體，去除干擾菌體生理狀態、影響ATP生物發光的物質；篩選優化培養基，修復復壯菌體，促進芽孢轉化為營養細胞，促使菌體處于正常一致的生理狀態，將菌體與ATP發光檢測試劑反應，利用發光檢測儀檢測發光值,建立發光值與菌落數間數學模型，根據已建模型推算出待測樣品菌落總數。本發明檢測方法快速，在4小時內就能夠準確檢出菌落總數，遠快于國家標準方法(48小時)(GB/T4789.2-2003食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定)，檢測成本低廉。圖1是菌落總數與相對發光值的關系圖。圖1表明在研究的菌落總數范圍內菌落總數與相對發光值具有良好的相關性(R二0.9975)，方程為y=2.14x-857。具體實施例方式為了更好地理解發明的實質，下面用實施例來詳細說明發明的技術內容，但本發明的內容并不局限于此。實施例11.樣品過濾用移液管移取10ml液體食品到90ml無菌生理鹽水中，振蕩搖勻，取10ml該稀釋樣品過0.2um—0.45um膜，收集菌體，對截留在膜上的菌體利用無菌生理鹽水反復沖洗三次，去除醬油等調味品中影響細菌修復和干擾發光的物質。表1中列出數據闡述醬油中存在千擾發光的物質。表1去除干擾物前后對發光體系的影響<replacetable>complexreplacetableseeoriginaldocumentpage7</replacetable>*菌懸液制備方法吸取10ml醬油加入到90ml無菌水中，混勻，取10ml過0.45um醋酸纖維素膜抽濾，再用lml無菌水洗滌過濾膜，收集菌體，制備菌懸液。表1試驗結果表明醬油成分嚴重干擾ATP發光，因此必需對樣品過濾，分離富集菌體，排除干擾成分。2.修復培養基組成與制備培養基配方牛肉浸出粉3.5g，酪蛋白水解物17.5g，可溶性淀粉1.8g，無水葡萄糖5g，L-丙氨酸0.75g，肌苷0.35g，L—天門冬素1.25g，加蒸餾水1000ml。121"C滅菌15分鐘，室溫保存供使用。培養基分裝在180mmX18mm試管中，每管10ml，121。C滅菌15分鐘，供使用。3.細菌修復將截留細菌的膜用無菌鑷子夾取，放入裝有10ml修復細菌培養基的試管中，于35—37。C孵育2—3小時。表2中菌體修復前后對發光值的影響。表2菌體修復前后發光值的變化<table>Complextableseetheoriginaldocumentpagex</column></row><table>表2結果表明分離富集的菌體菌體在修復前無論菌落數高低其發光值均較低，且發光值與菌落總數沒有明顯的線性相關性，經過修復后的菌體發光值明顯增加，且菌落數與發光值間存在良好的線性相關性，該培養基背景值較低。因此在菌落總數快速檢測過程中為保證檢測的準確性必需對菌體進行修復處理。4.檢測過程取孵育完畢的菌懸液100ul，置于96孔板中相應檢測孔中，加入50ul檢測試劑(包括ATP浸提液、緩沖液、熒光素底物、熒光素酶和相應金屬離子)，在振蕩器上搖勻振蕩1分鐘后，進行發光檢測，發光檢測的波長為560nm，檢測積分時間為1分鐘。測定樣品的發光值。5.利用已知菌落數的樣品測定發光值，建立菌落總數與發光值間的數學模型。菌落總數利用國家標準方法一平板計數方法測定，其相應發光值利用ATP發光方法測定。圖1表明在研究的菌落總數范圍內菌落總數與相對發光值具有良好的相關性(11=0.9975)，方程為y=2.14x-857。該檢測試劑中有生物酶，生物酶在放置過程中酶活性會下降，因此建立的數學模型一發光值與菌落總數之間的關系方程系數會有波動，在實際檢測過程中應設置一個陽性樣本(已知菌落總數的樣品)，測定其發光值，利用單點法校正方程系數，確保檢測結果準確性。6.待測樣品利用菌體分離富集技術富集菌體，修復，測定發光值，根據已經建立的數學模型計算出菌落總數。相對發光值均值為20934，菌落總數約為10183。實施例21.分離菌體用利用天平無菌稱取10g固體或膏狀食品到90ml無菌生理鹽水中，振蕩搖勻，靜置15min，取上清20ml該稀釋樣品4。C離心600g1000g/7min去除食物殘渣，取上清液10ml過0.2"m一0.45"m混合纖維素酯微孔濾膜，收集菌體，對截留在膜上的菌體利用無菌生理鹽水反復沖洗三次，去除食品中影響細菌修復和干擾發光的物質。2.修復培養基組成與制備培養基配方牛肉浸出粉2g，酪蛋白水解物20g，可溶性淀粉0.5g，無水葡萄糖7g，L-丙氨酸0.5g，肌苷0.5g，L-天門冬素0.5g，加蒸餾水1000ml。12rC滅菌15分鐘，室溫保存供使用。培養基分裝在180mmX18mm試管中，每管10ml，12rC滅菌15分鐘，供使用。3.細菌修復將截留細菌的膜用無菌鑷子夾取，放入裝有10ml修復細菌培養基的試管中，于35_37°C孵育2—3小時。4.檢測過程取孵育完畢的菌懸液100ul，置于96孔板中相應檢測孔中，加入50ul檢測試劑(包括ATP浸提液、緩沖液、熒光素底物、熒光素酶和相應金屬離子)，在振蕩器上搖勻振蕩1分鐘后，進行發光檢測，發光檢測的波長為560nm，檢測積分時間為1分鐘。根據發光值確定菌落總數。實施例31.分離菌體用利用天平無菌稱取10g固體或膏狀食品到90ml無菌生理鹽水中，振蕩搖勻，靜置15min，取上清20ml該稀釋樣品4。C離心600g—100()g/7min去除食物殘渣，取上清液10ml樣品4。C離心6000g-1()()()0g/7min，去除上清液，收集菌體，對菌體利用無菌生理鹽水反復沖洗三次，去除食品中影響細菌修復和干擾發光的物質。2.修復培養基組成與制備培養基配方牛肉浸出粉5g，酪蛋白水解物15g，可溶性淀粉3g，無水葡萄糖3g，L-丙氨酸lg，肌苷0.25g，L-天門冬素2g，加蒸餾水1000ml。12rC滅菌15分鐘，室溫保存供使用。培養基分裝在180mmX18mm試管中，每管10ml，121。C滅菌15分鐘，供使用。3.細菌修復將細菌利用培養基懸浮，于35—37'C孵育2—3小時。4.檢測過程取孵育完畢的菌懸液100ul，置于96孔板中相應檢測孔中，加入50tU檢測試劑(包括ATP浸提液、緩沖液、熒光素底物、熒光素酶和相應金屬離子)，在振蕩器上搖勻振蕩1分鐘后，進行發光檢測，發光檢測的波長為560nm，檢測積分時間為1分鐘。根據發光值確定菌落總數。以上對本發明所提供的醬油等調味品中菌落總數快速檢測方法進行了詳細介紹，本文中應用了具體個例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核型心思想；同時，對于本領域的一般技術人員，依據本發明的思想，在具體實施方式及應用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發明的限制。權利要求1.一種調味品中菌落總數快速檢測方法，其特征在于，包含以下步驟A.利用膜分離技術分離富集菌體，去除影響菌體生長和發光體系的物質；B.利用培養基修復亞致死細菌，轉化芽孢為營養體細胞，使細菌處于同步生長狀態；C.菌懸液與ATP發光試劑發應，根據發光值檢測得出菌落總數；所述的培養基由以下組分組成每1000ml蒸餾水中含有牛肉浸出粉2-5g，酪蛋白水解物15-20g，可溶性淀粉0.5-3g，無水葡萄糖3-7g，L-丙氨酸0.5-1g，肌苷0.25-0.5g，L-天門冬素0.5-2g。2.根據權利要求1所述的調味品中菌落總數快速檢測方法，其特征在于所述的調味品是醬油。3.根據權利要求1所述的調味品中菌落總數快速檢測方法，其特征在于，所述的分離富集菌體采用以下步驟吸取一定量的待測樣品，利用無菌生理鹽水稀釋5—40倍，再進行真空過濾，濾過0.2-0.45um濾膜，最后以無菌生理鹽水洗滌3—5次，去除干擾雜質。4.根據權利要求1所述的調味品中菌落總數快速檢測方法，其特征在于所述的修復亞致死細菌采用以下步驟將分離的菌體懸浮于修復培養基中在35—37℃的氣浴恒溫搖床上修復2—3小時。5.根據權利要求1所述的調味品中菌落總數快速檢測方法，其特征在于所述的發光值檢測，將修復的菌體懸液50—100ul與50-lOOulBacTitcr-GloTM檢測試劑反應，利用發光光度計于530—590nm處檢測發光值。6.—種用于調味品中菌落總數快速檢測的培養基，其特征在于，由以下組分組成每1000ml蒸餾水中含有牛肉浸出粉2—5g，酪蛋白水解物152()g，可溶性淀粉0.5—3g，無水葡萄糖3—7g,L-丙氨酸0.5—lg，肌苷0.25—0.5g，L-天門冬素0.5—2g.全文摘要本發明公開了一種醬油等調味品中菌落總數快速檢測方法。該方法包含以下步驟A.利用膜分離技術分離富集菌體，去除影響菌體生長和發光體系的物質；B.利用培養基修復亞致死細菌，轉化芽孢為營養體細胞，使細菌處于同步生長狀態；C.菌懸液與ATP發光試劑發應，根據發光值檢測得出菌落總數。本發明還公開了一種用于調味品中菌落總數快速檢測的培養基。本發明檢測方法快速，在4小時內就能夠準確檢出菌落總數，具有快速準確的優點。文檔編號G01N21/76GK101343657SQ20081013556公開日2009年1月14日申請日期2008年9月3日優先權日2008年9月3日發明者嚴守雷,潘思軼,繆素娜,鄒敏娟,黃文彪申請人:佛山市海天調味食品有限公司;佛山市海天(高明)調味食品有限公司