專利名稱：：煙草中非蛋白質氮含量的測定方法
技術領域：
：本發明涉及煙草中成分組成的測試方法，尤其涉及煙草中非蛋白質氮含量的測定方法。
背景技術：
：煙草中的各成分的含量決定了煙草的質量，例如混合型香煙的焦油和尼古丁比是ll:1,而烤煙型大多是1314:1,因此混合型香煙和烤煙型香煙相比最大的優點就是香氣量足而且焦油含量低。煙草中含有蛋白質，蛋白質在燃燒后會使煙氣苦味增加，產生辛辣味和刺激感，因此蛋白質對巻煙吸味有不良影響，但是蛋白質含量如果過低，那么煙氣就會顯得平淡，吃味和香氣也會變差。另外，蛋白質在調制過程中可水解為氨基酸，而氨基酸含量與煙氣的香味和豐滿度又有明顯的正相關關系。雖然蛋白質的總量在煙草的醇化過程中變化較小，但是煙草中的其他成分卻會隨著醇化過程而變化，從而也引起煙草中蛋白質含量的變化。相應地，對于煙草工業的研究開發以及生產，都需要在各個階段掌握煙草中蛋白質的含量，測定煙草中蛋白質的含量，對了解煙葉品質十分重要。目前，煙草行業對蛋白質的檢測方法可以參照中華人民共和國煙草行業標準YC/T166-2003進行，此方法的測試原理也是國內外通常采用的，其原理是，用乙酸等酸沉淀煙草樣品中的蛋白質氮，通過將非蛋白質氮含氮物與蛋白質分離、洗脫，而后將蛋白質連同其他沉淀物一起消煮，將蛋白質氮在濃硫酸及催化劑作用下轉化為硫酸銨，強堿蒸餾釋放出氨，用標準酸液接收，反滴定，最后通過計算得出煙草中蛋白質的含量。這個方法本質上是測定煙草中蛋白質氮的含量，從而通過計算得出蛋白質的含量。此方法測定過程中，在對沉淀物進行消煮以后，還需要重新收集由強堿蒸餾釋放出的氨，用標準酸液接收和反滴定，需要將多次將試樣轉移，試驗過程中人為因素造成的誤差較大。
發明內容本發明所要解決的技術問題在于提供一種煙草中非蛋白質氮含量的測定方法，測試方法步驟少，不用再進行收集氣體和滴定等操作，減少了人為的4喿作誤差，測定結果準確、誤差小。為了解決以上的技術問題，本發明提供以下的技術方案一種煙草中非蛋白質氮含量的測定方法，包括如下步驟a)稱取煙草；b)將稱取的煙草放入足量的一定濃度的酸中，加熱一段時間至蛋白質固化完全；c)蛋白質固化完全后，過濾并用步驟b)中所述的酸或者硫酸銅溶液沖洗濾出物；d)合并濾液并定容；e)取一定量的濾液進行消化處理，定容；f)將銨鹽標準溶液進行與步驟e)相同的消化處理，定容；出濾液中氮的含量；其中，步驟f)與步驟a)e)沒有先后順序。對于這個煙草中非蛋白質氮含量的測定方法，步驟a)和步驟b)完成的是固氮過程；步驟c)和步驟d)為過濾分離剔除蛋白質固化形成的沉淀；步驟e)為對濾液的消化過程；步驟f)是與步驟e)對應的對比操作，所以此步驟與步驟a)e)沒有先后順序；步驟g)則通過比色對比得出濾液中氮的含量，從而可以計算出煙草中非蛋白質氮的含量。在此測定方法中，步驟e)~g)與中華人民共和國煙草行業標準YC/T161-2002中敘述的原理是一致的。對于整個測定方法而言，簡而言之，首先通過固氮處理將煙草中的蛋白質以沉淀的形式剔除，然后利用測定總氮的方法測定濾液中的氮含量即得到煙草中非蛋白質氮的含量。通過測定煙草中非蛋白質氮含量，并且再通過測定煙草中總氮的含量，可以很容易計算出，煙草中蛋白質的含量，測定方法步驟少，不用再進行濾渣轉移、收集氣體和滴定等操作，而現有的直接測定蛋白質氮的方法中，需要進行抽濾處理并將濾渣轉移到消化容器中，在將蛋白質氮轉化為硫酸銨以后，還需要利用強堿蒸餾釋放出氨，用標準酸液接收，反滴定，這些操作實驗都比較復雜而且因實驗人員的不同而存在較大差異。可以看出，本發明提供的測定方法減少了人為的操作誤差，是一種簡便高效的測定煙草中非蛋白質氮含量的方法。下面對各個步驟中進行詳細的論述和介紹，并提供一些優選或者可以替代的技術方案。步驟a)稱取煙草前已述及，這個步驟是固氮過程的一個步驟。在本發明中，固氮過程指的是煙草中的蛋白質與酸反應生成沉淀的過程。固氮過程也稱為氮固化的過程等。確切的說，本步驟是一個稱量步驟，為了簡單起見，所以把這個稱量步驟定義成固氮過程的一個步驟。稱量步驟在分析測試過程中是基本的操作之一。由于煙葉的比重比較小，所以稱量使用的天平等稱量設備選用精確度高的電子天平或者光電天平比較好，精確度一般需用能夠精確到0.OOlg(克)或者精確度更高的測試儀器。在進行此操作步驟之前，通常還需要測定煙草中的水分含量，一般采用的是烘箱法。也可以將煙草樣品烘干并置于干燥的環境中待用。步驟b)將稱取的煙草放入足量的一定濃度的酸或者硫酸銅溶液中，加熱一段時間至蛋白質固化完全這個步驟是固氮反應發生的步驟，在此步驟中，煙草中的蛋白質與酸或者硫酸銅反應，生成沉淀。所述酸需要有一定的濃度，其本質是有一定的氫離子濃度。對于不同種類的酸，對酸的質量百分比濃度的要求也是不一樣的，可以根據實際測試中需要的酸來進行選定。參與反應的酸一般選用酸性較強的有機酸，最常用的是乙酸。也可以是乙酸、丙酸、丙二酸、三氯乙酸等，或者它們的組合。其中乙酸是最常用的，當選用乙酸時，乙酸的濃度優選使用0.4%~0.6%;三氯乙酸也4交為常用，當選用三氯乙酸時，三氯乙酸的濃度優選使用0.8%~2.0%。本發明不限于只使用有機酸，也可以使用其它溶劑如硫酸銅等，只要能夠與煙草中的蛋白質發生變性，凝結沉聚，從而可以通過過濾與非蛋白質氮分離即可。當釆用乙酸進行蛋白質的固氮反應時，乙酸的濃度可以選用0.4%~0.6°/。，反應的溫度選擇為所選用乙酸溶液的沸騰溫度，對于選用0.4%~0.6%的乙酸，需要保持乙酸沸騰15分鐘以上，以使得固氮反應的完全發生。步驟c)蛋白質固化完全后，過濾并用步驟b)中所述的酸或者辟u酸銅溶液沖洗濾出物步驟c)為過濾分離剔除蛋白質固化形成的沉淀的主要步驟。此步驟的操作簡單，采用常用的過濾操作即可，既可以選用普通過濾，也可以選用抽濾的過濾形式。這也是本發明的優勢之一，現有技術中在直接測定蛋白質氮的過程中也有一個過濾過程，卻最好采用抽濾的形式，本發明中則無此項要求，因為本發明的測定的目標物是濾液，所以，采用抽濾或者普通過濾的形式都可以，況且采用抽濾時存在濾液轉移困難的問題，因此本步驟中的過濾優選使用普通過濾形式，也就是常壓過濾。過濾并用步驟b)中所述的酸或者硫酸銅溶液沖洗濾出物，可以使得濾紙或者沉淀中的殘留的非蛋白質氮進入濾液，有利于提高測試的準確度。需要指出的是，此步驟中用到的酸或者硫酸銅溶液只是和步驟b)中所述的物質一致，并不表示一定是與步驟b)中用到的酸或者硫酸銅溶液的濃度也一樣。例如，如果步驟b)中用到的是濃度為0.5%的乙酸，那么步驟c)中可以使用濃度為0.7%的乙酸。需要指出的是，優選的方式是，步驟c)中使用的酸或者硫酸銅溶液的濃度與步驟b)中使用的酸或者硫酸銅溶液的濃度相差不大，盡量使用濃度一致的酸或者硫酸銅溶液。步驟d)合并濾液并定容如前所述，這個步驟為過濾分離剔除蛋白質固化形成的沉淀的步驟之一，也可以認為是為下一步的操作做準備的一個步驟。從步驟c)來的濾液并沒有一個準確的容積數值，在后續的計算過程中也無法給出確切的計算公式，所以需要定容。定容是化學實驗中的一個常用操作方式，即將不確定容積的液體，加入一定量的液體，使得其具有確定的容積。如果需要定容的液體是溶液，則通常加入的是溶劑。由于從步驟C)來的濾液具有較高的溫度，那么最好待濾液冷卻后再定容，以免影響定容的準確性。步驟e)取一定量的濾液進行消化處理，定容步驟e)為對濾液的消化過程。消化過程指的是，有機含氮物質在濃硫酸等氧化劑的作用下，經過強熱消化分解，其中的氮轉化為氨的過程。氧化劑一般選用強氧化劑。所述強氧化劑可以選自濃硫酸、濃鹽酸、濃硫酸/雙氧水混合物或濃鹽酸/雙氧水混合物等。由于鹽酸的揮發性很強，所以如果使用鹽酸作為氧化劑，那么必須密封加壓進行反應，防止揮發，否則消化的溫度受到很大限制，進而影響消化的效果。強氧化劑不選用硝酸，這是由于硝酸中含有氮元素，發生反應之后會對測試結果有影響。在此過程中，還可以加入催化劑，加快消化反應的進行。催化劑可以選擇汞及其化合物、硒及其化合物、銅及其化合物，或者它們的組合，具體的如汞、氧化汞、硒、氧化銅、硫酸銅等，優選使用氧化汞。除了氧化劑和催化劑之外，在消化反應中還可以加入助熔劑。以濃硫酸為例，助熔劑的作用是可以使得濃硫酸的沸點升高，所以可以把消化溫度升高，從而可以提高消化的效果，減少消化時間。助熔劑有碌^酸鉀、水楊酸等。硫酸鉀的效果更好，可以使得濃硫酸的沸點升高到350。C甚至更高，而水楊酸的效果則稍微差一些，水楊酸可以使得濃硫酸的沸點升高到34(TC以上。不含水的硫酸的沸點是338。C。由于所使用的硫酸中一般含有少量的水，所以消化過程的加熱一般分為兩個階段，第一階段是加熱至IO(TC~150°C,使得硫酸中的水分充分蒸發出來，避免降低硫酸的沸點。如果硫酸的沸點降低，那么部分硫酸就會在消化過程中蒸發出來，進而導致氨的損失。助熔劑可以選擇硫酸鉀、硫酸鈉、水楊酸或者它們的組合。優選其中的一種使用，并且更優選-克酸鉀。當硫酸和助熔劑在一起使用，經常也需要加入催化劑，此時，可以加熱至硫酸接近沸騰，并且保持O.5小時以上，即可完成消化處理；在這樣的反應條件下，也可以保持l小時以上，但是時間不宜太長。本發明人指出，在此反應條件下的消化反應時間以0.5~2.5小時為宜。由于消化反應的溫度很高，通常會在300。C以上，因此在消化完成后，需要稍等一下，待濾液稍微冷卻后再進行下一步操作，也可以加入少量水防止冷卻后硫酸銨結成晶體不易溶解。步驟f)將銨鹽標準溶液進行與步驟e)相同的消化處理，定容步驟f)是與步驟e)對應的對比操作，所以此步驟與a)~e)沒有先后順序。銨鹽標準溶液指的是自己配制或者用其他方式獲得的銨鹽的已知濃度的溶液。步驟f)中的銨鹽標準溶液可以是一個也可以不止一個，只要求通過一定的銨鹽標準溶液移取量(一般不超過10mL)，保證移取到消化管中的氮元素含量(質量)分別為0.3-3mg(通常移取46個，以便繪制標準曲線)。一般在實驗室中都是實驗人員配置的銨鹽溶液，具有較高的準確性和可靠性。銨鹽標準溶液也可以稱為銨鹽標準貯備液。銨鹽標準溶液可以采用硫S吏銨等銨鹽溶液。硫酸銨是比較常見的一種鹽，也可以采用氯化銨等。此步驟所使用的消化劑需要和步驟e)完全相同。由于步驟f)和步驟e)主要是起對比的作用，那么并沒有必要區分先后順序。然而，為了提高對比效果，最好的選擇是步驟e)和步驟f)作為平行步驟同步進行。平行步驟也就是化學分析領域通常提及的平行實驗，平行實驗的反應條件完全一致，因此被廣泛的采用，取得了非常好的對比效果。此步驟的消化原理和所使用的消化劑，和步驟e)中所述的一致。g)將步驟e)得到的濾液和步驟f)定容后的溶液進行比色對比即可得出濾液中氮的含量步驟g)是通過比色對比得出濾液中氮的含量，從而可以計算出煙草中非蛋白質氮的含量。比色對比常用的儀器是連續流動分析儀。通過對比所顯示的顏色，來確定濾液中的氮的濃度，從而可以計算出煙草中非蛋白質氮的含量。以上對本發明的各個步驟中的細節進行了說明，其中也敘述了一些改進和優選的方案。本發明除了提供一種煙草中非蛋白質氮含量的測定方法，還提供一種煙草中蛋白質氮含量的測定方法，其包括如下步驟A)利用上述的本發明提供的煙草中非蛋白質氮含量的測定方法測定煙草中的非蛋白質氮含量；B)測定煙草中總氮含量；其中，步驟A)和步驟B)沒有先后順序。對比步驟B)中測定總氮含量的方法可以為連續流動法、蒸餾滴定法、氨氣敏電極法或者離子色譜法。連續流動法、蒸餾滴定法、氨氣敏電極法和離子色譜法都是現有的測定煙草中總氮的方法，所以在此不再贅述。測定出煙草中蛋白質氮的含量之后，就可以計算出蛋白質的含量。發明人通過設計這個測定方法的實現路線，可以大大減輕工作中的工作量。因為煙草中總氮含量的測定為各煙草企業的日常監測項目，所以在此方法中，只需要測定煙草中非蛋白質氮的含量即可，并不會增加工作量。通過試驗證實，本發明提供的煙草中蛋白質氮含量的測定方法，也可以稱之為煙草中蛋白質含量的測定方法，測定結構穩定，與原有的經典法獲得的測定值也具有高度的一致性，滿足實驗準確性的要求。上面對本發明的技術方案做了詳盡的說明，對于本發明所提供的煙草中非蛋白質氮含量的測定方法，首先通過固氮處理將煙草中的蛋白質以沉淀的形式剔除，然后利用測定總氮的方法測定濾液中的氮含量即得到煙草中非蛋白質氮的含量，該測定方法步驟少，不用再進行收集氣體和滴定等操作，而現有的直接測定蛋白質氮的方法中，在將蛋白質氮轉化為硫酸銨以后，還需要利用強堿蒸餾釋放出氨，用標準酸液接收，反滴定，這些操作實驗都比較復雜而且因實驗人員的不同而存在較大差異。可以看出，本發明提供的測定方法減少了人為的操作誤差，是一種筒便高效的測定煙草中非蛋白質氮含量的方法。具體實施例方式為能進一步理解本發明，下面結合具體的實施方式對上述的技術方案做進一步的闡述和說明。為了與煙草行業的標準保持較好的一致性，實施例中一些步驟的具體實現方式盡量采用中華人民共和國煙草行業標準中通行的做法。以下實施例中用到的試劑的具體情況見表1,對試劑有特殊說明的除外。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表l中，AR代表分析純。具體測定方法為l)按照中華人民共和國標準GB/T19616-2004抽耳又煙葉樣品，按照中華人民共和國煙草行業標準YC/T31-1996將煙葉樣品制備煙末試樣，測定煙末中水分含量；2)稱取約2g煙末，稱取精度精確至0.OOOlg，置于100mL(毫升)濃度為O.5%的乙酸溶液中，加熱保持沸騰15分鐘，迅速用無氮定性濾紙過濾，并用濃度為0.5°/。乙酸溶液沖洗沉淀物。合并濾液，待冷卻到室溫后定容到200mL。所述乙酸溶液的濃度指的是質量濃度，即質量百分數。3)用移液管準確移取10mL濾液到75mL消化管中，并加入0.lg氧化汞、1.Og硫酸鉀、5mL硫酸。將消化管置于消化器上消化，消化器工作參數為100。C保持lh(小時)，370。C保持lh。消化后稍冷，加入少量水，冷卻到室溫，用水定容至75mL刻度線，搖勻。需要說明的是，消化工作參數為370°C并不代表濾液的溫度也為37(TC。設定儀器參數為37(TC主要是為了保持消化管中的濾液沸騰。此溫度的測定也可以為其它溫度，只要能保證消化反應的進行就可以。4)準確稱取O.3536g硫酸銨，用蒸餾水溶解并定容至250mL,搖勻，制得標準貝i備液。準確量取1.OmL、2.OmL、4.OmL、6.OmL、8.OmL、10.OmL標準貯備液至消化管中，與步驟3)所述過程一樣，進行消化、定容。標準溶液對煙草中非蛋白質氮含量的有效覆蓋范圍為質量百分比0.3%~3.0%，此范圍可以改變。5)將約2mL消化后的試樣和標準溶液倒入連續流動分析儀樣品管內，利用流動分析儀測出非蛋白質氮的含量。6)按照中華人民共和國煙草行業標準YC/T161-2002所述方法測定煙草的總氮含量。7)計算煙草中蛋白質的含量。計算公式為6.25x(t-c)，其中，t代表步驟6)所測得的總氮含量，c代表步驟5)中測定的非蛋白質氮的含量。對16個煙葉樣品，每個煙葉樣品進行3次試驗，所得的煙葉樣品的非蛋白質氮含量的結果見表2，蛋白質含量的結果見表3。表2非蛋白質氮含量(質量百分比)檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3蛋白質含量(質量百分比)檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在每次試驗中，以兩個平行樣檢測結果的平均值作為填報數據，并且本發明人發現，每次試驗的標準曲線相關系數皆大于0.999。從表2數據可以看到，除一個樣品外其它數據的變異系數皆小于5%。而從表3的數據更顯示，該方法重復性較好，變異系數小于3°/,絕大部分都小于2.4,通常都小于2。因此，符合分析檢測的要求。對比實施方式按照中華人民共和國煙草行業標準YC/T166-2003煙草和煙草制品總蛋白質含量的測定方法，對上述16個煙葉樣品進行總蛋白質含量的測定。得到的結果見表4。表4為本發明所測得的蛋白質含量和利用行業標準測定方法得出的蛋白質含量的比較表。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</table從表4可以看出，各個樣品的利用本發明方法和利用行業標準所測得的數據對比，每對數據的相對偏差均小于6%。把利用本發明方法所測得的16個數據作為一組，把利用行業標準所測得的16個數據作為一組，采用數理統計方法中的t檢驗對這兩組數據進行分析，得到t值為1.082，小于查表值t(0.1，15)，t(O.l,15)=1.753。可以看出在90%的置信區間內，兩組數據沒有明顯的差異，因此得出結論可以采用本發明所提供的測定方法代替原來的經典^r測法。以上對本發明所提供的技術方案進行了詳細介紹。本說明書中應用了具體實施例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，對于本領域的一般技術人員，依據本發明的思想在具體實施方式及應用范圍上可能在實施過程中會有改變之處。因此，本說明書記載的內容不應理解為對本發明的限制。權利要求1、一種煙草中非蛋白質氮含量的測定方法，包括如下步驟a)稱取煙草；b)將稱取的煙草放入足量的一定濃度的酸或者硫酸銅溶液中，加熱一段時間至蛋白質固化完全；c)蛋白質固化完全后，過濾并用步驟b)中所述的酸或者硫酸銅溶液沖洗濾出物；d)合并濾液并定容；e)取一定量的濾液進行消化處理，定容；f)將銨鹽標準溶液進行與步驟e)相同的消化處理，定容；g)將步驟e)得到的濾液和步驟f)定容后的溶液進行比色對比即可得出濾液中氮的含量；其中，步驟f)與步驟a)～e)沒有先后順序。2、根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，步驟b)中所述的酸為有機酸。3、根據權利要求2所述的測定方法，其特征在于，步驟b)中所述有機酸為乙酸，濃度為0.4%~0.6%。4、根據權利要求3所述的測定方法，其特征在于，步驟b)中所述加熱一段時間至蛋白質固化完全為，加熱至乙酸沸騰并保持15分鐘以上。5、根據權利要求2所述的測定方法，其特征在于，步驟b)中所述有機酸為三氯乙酸，濃度為0.8%~2.0%6、根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，步驟d)為合并濾液，待濾液冷卻后再定容。7、根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，步驟e)消化過程中消化劑包括催化劑和氧化性物質。8、根據權利要求7所述的測定方法，其特征在于，所述催化劑選自汞及其化合物、硒及其化合物、銅及其化合物，或者它們的組合。9、根據權利要求8所述的測定方法，其特征在于，所述催化劑選自氧化汞。10、根據權利要求7所述的測定方法，其特征在于，所述氧化性物質選自石危酸或鹽酸。11、根據權利要求7所述的測定方法，其特征在于，所述氧化性物質為硫酸，所述消化劑還包括助熔劑，所述消化處理為加熱至沸騰，并保持O.5小時以上。12、根據權利要求11所述的測定方法，其特征在于，所述保持O.5小時以上為，保持1小時以上。13、根據權利要求11所述的測定方法，其特征在于，所述保持O.5小時以上為，保持O.5~2.5小時。14、根據權利要求7所述的測定方法，其特征在于，步驟e)消化過程中的消化劑還包括助熔劑。15、根據權利要求11或者14所述的測定方法，其特征在于，所述助熔劑選自水楊酸、硫酸鉀、或者它們的組合。16、根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于，步驟f)中所述銨鹽為辟u酸銨鹽。全文摘要本發明公開一種煙草中非蛋白質氮含量的測定方法，包括如下步驟a)稱取煙草；b)將稱取的煙草放入足量的一定濃度的酸或者硫酸銅溶液中，加熱一段時間至蛋白質固化完全；c)蛋白質固化完全后，過濾并用步驟b)中所述的酸或者硫酸銅溶液沖洗濾出物；d)合并濾液并定容；e)取一定量的濾液進行消化處理，定容；f)將銨鹽標準溶液進行與步驟e)相同的消化處理，定容；g)將步驟e)得到的濾液和步驟f)定容后的溶液進行比色對比即可得出濾液中氮的含量；其中，步驟f)與步驟a)～e)沒有先后順序。利用本發明所述的測定方法，該測定方法步驟少，減少了人為的操作誤差，是一種簡便高效的測定方法。文檔編號G01N21/25GK101349637SQ20081013440公開日2009年1月21日申請日期2008年7月22日優先權日2008年7月22日發明者孔浩輝,菲黃申請人:廣東中煙工業有限責任公司