專利名稱：無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒及無機磷(磷酸根)濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測 定無機磷(磷酸根)濃度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
人體內磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持動態平衡， 血中鈣、磷濃度之間有一定關系，正常人血鈣升高則血磷降低，反之亦然。血漿 中[鈣]、[磷]濃度的乘積保持在一定范圍；大約每100毫升血漿鈣磷濃度的乘積 為35——40。當二者乘積大于40時，鈣和磷以骨鹽形式沉積在骨組織，〉70時， 可發生轉移性鈣化。當乘積<35時，則將妨礙骨組織的鈣化，甚至使骨鹽再溶 解，影響成骨作用，引起佝僂病或軟骨病。血漿[Ca]、 [Pi]的恒定，主要受維生 素D，甲狀旁腺激素及降鈣素的調節。
由于人體的磷目前還不能直接測定，所以無機磷的檢測實際上是分析磷酸鹽 陰離子(H2P04"， HPO420。常用的方法有磷鉬酸還原法，非還原法，染料結合 法，酶法，同位素稀釋質譜法、原子吸收分光光度法和流動注射分析法等。決定 性方法是同位素稀釋質譜法，WHO推薦的中等實驗室測定無機磷的常規方法是 比色法。
磷鉬酸還原法又有無蛋白學濾液法和不去蛋白法，后者需在試劑中加入非離 子型表面活性劑以避免混濁。所用還原劑和表面活性劑種類很多，性能比較穩定 的還原劑有硫酸亞鐵，硫酸亞鐵銨，硫酸肼，米吐爾等。表面活性劑則以聚乙二 醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。
磷鉬酸非還原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接測定磷鉬酸雜聚化合物，
4方法簡便，便于自動化。但黃疸，溶血，脂濁血清在340nm有光吸收，必須做 標本空白，否則結果偏高。
酶法測定無機磷是發展趨勢，其優點是無機磷酸鹽化合物在酶作用下的中性 范圍內是穩定的，可用于常規樣品的自動化分析。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監測還原型煙酰胺輔酶(還 原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定無機磷(磷酸根)濃度的 方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的無機磷(磷酸根)診斷/測定試
劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全6動生化分析儀上進 行無機磷(磷酸根)濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實 的推廣應用。
本發明無機磷(磷酸根)濃度測定方法原理如下
磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶—氧化碳+
磷酸烯醇式丙酮酸+水 二氧化碳+過氧化氫+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+
輔酶A十氧
丙酮酸+ 二氧化碳+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)蘋果酸+
輔酶
這種方法應用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase; EC4丄1.31)酶(偶)聯丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、蘋果酸脫氫 酶(malate dehydrogenase (decarboxylating); EC 1.1.1.38 EC 1.1.1.38; EC 1.1.1.39; EC1丄1.40; EC1丄1.83)酶促反應比色法。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶解無機 磷(磷酸根)反應產生二氧化碳，再通過(偶)聯合丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫 酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶〔在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，通過 測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算無機磷(磷酸根)的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論 是單劑、雙劑還是二劑，如下成分關系的本發明無機磷(磷酸根)診斷/測定試 劑盒較為理想
緩沖液 穩定劑 還原型輔酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
丙酮酸氧化酶
蘋果酸脫氫酶
草酰乙酸
乙酰輔酶A
過氧化氫
100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000U/L 12 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L
本發明的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、 蘋果酸脫氫酶、草酰乙酸、乙酰輔酶A、過氧化氫。
試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、乙酰輔酶A、過氧化氫。 試劑2
緩沖液、穩定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸 脫氫酶。還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、草 酰乙酸、乙酰輔酶A、過氧化氫在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒口丄 以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、乙酰輔酶A、過氧化氫。 試劑2
緩沖液、穩定劑、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩定劑、磷酸烯醇式內酮酸羧化酶。 還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、草 酰乙酸、乙酰輔酶A、過氧化氫在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。 試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直 接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定無機磷(磷酸根)濃度的方法，其 還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具休實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
丙酮酸氧化酶 8000 U/L蘋果酸脫氧酶 草酰乙酸 乙酰輔酶A 過氧化氫
10000 U/L 12 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8 ±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷(磷酸根)樣品與 試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘 左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大 小。
實施例二
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑 還原型輔酶 草酰乙酸 乙酰輔酶A 過氧化氫 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500mmol/L
100 mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
丙酮酸氧化酶 8000 U/L
蘋果酸脫氫酶 10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8 ±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測無機磷(磷酸根)樣品與 試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間 大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入杼品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大 小。
實施例三
本實施例的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑 還原型輔酶 草酰乙酸 乙酰輔酶A 過氧化氫 試劑2
二 (羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑
丙酮酸氧化酶 蘋果酸脫氫酶
腦mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 12 mmol/L 12 mmol/L 8 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L 10000U/L試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定無機磷(磷酸根)濃度時，在全自動牛化分析儀上設定溫度37。C，反 應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測無機磷(磷酸根)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反 應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到本 發明的目的，鑒于測定歩驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得
出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0012;吸光度時間 反應曲線應呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達15 mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過土5%;試劑測試的精密度(重 復性)的變異系數(CV)《2%;試劑的靈敏度可達0.006 ± 0.003 AA/mmol/L; 試劑在2—8r下保存，活性可以穩定一年；——木發明靈敏度高、精確度好， 線形范圍寬廣，穩定期長，足以便于推廣應用。
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權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的無機磷(磷酸根)濃度測定方法，其方法原理如下磷酸根+草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶二氧化碳+ 磷酸烯醇式丙酮酸+水二氧化碳+過氧化氫+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+ 輔酶A+氧丙酮酸+二氧化碳+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)蘋果酸+ 輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小測定結果。
2. —種無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 穩定劑 還原型輔酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶丙酮酸氧化酶蘋果酸脫氫酶草酰乙酸乙酰輔酶A過氧化氫 試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范圍 外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是千粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、 蘋果酸脫氫酶、草酰乙酸、乙酰輔酶A、過氧化氫組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、 蘋果酸脫氫酶、草酰乙酸、乙酰輔酶A、過氧化氫組成雙劑試劑；試劑1， 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、乙酰輔酶A、過氧化氫組成； 試劑2，由緩沖液、穩定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋 果酸脫氫酶組成。還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、草酰乙酸、乙酰輔酶A、過氧化氫在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、草酰乙酸、乙酰輔酶A、過氧化氫組成多劑試劑；試劑1， 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、乙酰輔酶A、過氧化氫組成； 試劑2，由緩沖液、穩定劑、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶組成；試劑3，由 緩沖液、穩定劑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶組成。還原型輔酶、磷酸烯醇式 丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、草酰乙酸、乙酰輔酶A、過 氧化氫在試劑1、試劑2或試劑3巾的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩定劑1一4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨 (Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇 (Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的無機磷(磷酸根)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定無機磷(磷酸根)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、草酰乙酸、乙酰輔酶A、過氧化氫、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出無機磷(磷酸根)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101620162SQ20081012423
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優先權日2008年6月30日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司