專利名稱：一種量子點標記的間接競爭熒光免疫檢測地塞米松的方法
技術領域：
一種量子點標記的間接競爭熒光免疫檢測地塞米松的方法，屬于免疫檢測 方法技術領域。
背景技術：
地賽米松(Dexamethasone)屬人工合成類糖皮質激素，化學名稱為16a—甲 基一11P， 17a， 21 —三羥基一9a—氟孕甾一l， 4一二烯一3， 20二酮。具有抗過 敏、抗炎和影響糖代謝的作用，常被用于治療家畜的炎癥反應、免疫性疾病、 牛的酮病和羊妊娠毒血癥等。地賽米松還常被用作生長促進劑，增加家畜的飼 料攝入量從而使其達到增重的目的。然而，經毒理學試驗證明，該藥物具有致 突變性、蓄積毒性，ADI值為0.000015mg/kgbw/day。若隨意在詞料中添加該藥 物，蓄積的藥物通過食物鏈進入人體，將造成巨大的危害。為此許多國家將此類 藥物列入禁用藥物名單。當今國際上常用的地塞米松殘留的檢測方法有薄層 色譜(TLC)、液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、氣-質聯用法(GC-MS)、液-質聯 用法(LC-MS)等，但這些儀器分析方法不僅需要昂貴的儀器設備，對檢材的要 求也比較高，需要經過復雜的樣品前處理才能進行。國外早已經開展了對糖皮 質激素分析方法的研究，常用的方法為酶聯免疫分析法(ELISA)或稱為免疫酶 定量分析法(IEMA)。這類方法是將包被原包被酶標板，加入藥物及抗藥物抗 體，再加入酶標二抗，即檢測抗體，最后加入底物顯色， 一定時間后，用酶標 儀檢測某一特定波長的吸光度值，根據已知標準品含量計算樣品中待測藥物的 濃度，此操作繁瑣，費時。
發明內容
本發明的目的是提供量子點標記的間接競爭熒光免疫檢測地塞米松的方 法，該方法具有高靈敏度、高特異性、高準確度、操作簡單的量子點標記的熒 光免疫檢測法，用于地塞米松殘留的快速檢測。
本發明的技術方案 一種量子點標記的間接競爭熒光免疫檢測地塞米松的 方法，將包被原直接包被在酶標板的微孔中，加入地塞米松標準溶液或待測樣 品形成抗原-抗體發光免疫復合體，用熒光酶標儀激發并檢測所形成的抗原-抗體 發光免疫復合物的熒光強度，與標準溶液對比求出待測樣品中地塞米松的濃度； (一)用變性牛血清蛋白dBSA包裹發綠光的QD545標記抗地塞米松多克 隆抗體
(1) BSA變性將16.5mgBSA溶于10mL雙蒸水中，攪拌下加入0.42mg NaBH4，室溫下反 應lh，60-8(TC下加熱20min分解過量的NaBH4， BSA變性，二硫鍵打開成-SH， 控制最終的dBSA水溶液的濃度為5X 1(T5M;
(2) 變性BSA包裹量子點dBSA-QDs: 將dBSA和量子點鏑化鉻CdTe按摩爾比1 : 1 1 : 6混合，60-80。C水浴加
熱15min，室溫下保持兩天，使包裹完全；
(3) 變性BSA包裹量子點偶聯抗體
將0.056M的5]liL l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺EDC與0.1M的 5jxL硫代N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS混合10s后，加入至25pL dBSA-QDs 2 X 1(T5M中，變性BSA包裹的量子點活化15min，加入9.6pL地塞米松抗體Ab 5X1(T5M，反應物摩爾比控制為dBSA-QDs: Ab:EDC:sulfo-NHS=l:l:560:1000， 室溫下反應4h，得到量子點標記的地塞米松抗體，反應液中抗體的濃度為 1.15mg/mL，用0.1°/。明膠的含吐溫的pH 7.4， 0.01M磷酸鹽緩沖液作抗體稀釋液 稀釋1000倍待用；
(二)抗原的包被
用地塞米松與卵血清白蛋白偶連體作為包被原，用pH9.6， 0.05M碳酸鹽緩 沖液作為包被緩沖液，用包被緩沖液將地塞米松包被原稀釋至l-20(ig/mL作為 包被液，在酶標板的每孔中加100(iL包被液，4'C冰箱過夜，用含NaC18.5g/L、 pH 7.2-7.4、 1Ommol/L磷酸鹽緩沖液洗三次，按200jiL/孔加0.1%明膠進行封閉；
(三)抗原-抗體二元發光免疫復合體的形成
在封閉后的酶標板孔中加入地塞米松標準溶液或待測樣品50(iL，稀釋的量 子點標記的地塞米松抗體50^iL，37"C孵育lh，抗原與地塞米松藥物競爭抗體， 部分抗體與抗原形成抗原-抗體二元免疫復合物，用含NaC18.5g/L、 pH 7.2-7.4、 1Ommol/L磷酸鹽緩沖液洗三次，去掉非特異性吸附； (四)定量熒光檢測
用熒光酶標儀激發并檢測所形成的抗原-抗體發光免疫復合物的熒光強度， 激發波長430nm;發射波長545nm，通過與標準溶液對比求出待測樣品中地 塞米松的濃度。
所說的抗體是指用變性BSA包裹量子點標記的抗地塞米松的多克隆抗體； 量子點是指能夠發射熒光的納米粒子，其核心部分為CdTe。
所說的包被是利用常規的方法將地塞米松的包被原(地塞米松-OVA偶聯物) 直接固定在酶標板微孔中。
所說的抗原-抗體復合體的形成是加入地塞米松抗體后，抗原與藥物競爭 抗體，通過抗原與抗體的特異性結合形成抗原-抗體二元免疫復合物。
所說的熒光強度的檢測是用熒光酶標儀激發并檢測所形成的抗原-檢測抗體二層夾心發光免疫復合物的熒光強度，通常樣品中藥物濃度越大，被抗體捕獲 的藥物量越多，與包被原結合的抗體越少，則測得的熒光強度值越小。
上述的待測藥物為地塞米松(DEX)，相應的抗體應為特異性抗地塞米松的 多克隆抗體。
本發明的有益效果
(1) 本法操作簡單，不需加顯色物質就能檢測待測樣品中地塞米松的含量, 即通過抗原-抗體免疫復合物的熒光強度，間接檢測待測樣品中地塞米松的濃度 值，無論操作還是反應均只需一步就可完成。
(2) 本法用于標記抗體的量子點與傳統熒光相比，發射的熒光強度更強，
且熒光穩定時間長。
圖l用量子點標記的間接競爭熒光免疫法檢測地塞米松的標準曲線。
具體實施例方式
實施例1
(一) 用變性牛血清蛋白(dBSA)包裹發綠光的QD545標記抗地塞米松多
克隆抗體
(1) BSA變性
將16.5mg BSA溶于lOmL雙蒸水中，攪拌下加入0.42mg NaBH4,室溫下 反應lh, 60-8(TC下加熱20min，分解過量的NaBH4， BSA變性，二硫鍵打開成 -SH，最終的dBSA水溶液的濃度為5 X 10—5M。
(2) 變性BSA包裹量子點(dBSA-QDs): 將dBSA和量子點鏑化鉻(CdTe)按一定的摩爾比(l:l， 1:2， 1:4， 1:6)
混合，60-80°C水浴加熱15min，室溫下保持兩天，使包裹完全。
(3) 變性BSA包裹量子點偶聯抗體
將5pL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺EDC(0.056M)與5pL硫代 N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS(0.1M)混合10s后，加入至25pL dBSA-QDs (2X l(y5M)中，變性BSA包裹的量子點活化15min，加入9.6pL地塞米松抗體(Ab,5 X1(T5M)。反應物摩爾比為dBSA-QDs: Ab:EDC: sulfo-NHS=l:l:560:1000。室 溫下反應4h，得到量子點標記的地塞米松抗體。反應液中抗體的濃度為 1.15mg/mL，用抗體稀釋液(0.1%明膠的含吐溫的磷酸鹽緩沖液pH 7.4， 0.01M) 稀釋1000倍待用。
(二) 抗原的包被
用地塞米松與卵血清白蛋白偶連體作為包被原，用碳酸鹽緩沖液(pH9.6， 0.05M)作為包被緩沖液，用包被緩沖液將地塞米松包被原稀釋至l-20pg/mL作 為包被液，在酶標板的每孔中加100^L包被液,4。C冰箱過夜，用磷酸鹽緩沖液(PBS， 10mmol/L， pH 7.2-7.4，含NaC18.5g/L)洗三次，按200pL/孔加0.1%
明膠進行封閉。
(三) 抗原-抗體二元發光免疫復合體的形成 在封閉后的酶標板孔中加入地塞米松標準溶液或待測樣品50pL，稀釋的量
子點標記的地塞米松抗體50)iL，37'C孵育lh，抗原與地塞米松藥物競爭抗體， 部分抗體與抗原形成抗原-抗體二元免疫復合物，用磷酸鹽緩沖液(PBS， 1Ommol/L， pH7.2-7.4，含NaC18.5g/L)洗三次，去掉非特異性吸附。
(四) 定量熒光檢測 量子點標記的間接競爭熒光免疫檢測法的測定原理是通過檢測結合到酶標
板微孔上的抗原-抗體二元免疫復合物的熒光強度來實現對地塞米松的檢測。可 與標準曲線對比求出樣品中地塞米松的濃度。結合到酶標板微孔上的量子點標 記的檢測抗體數量不同，產生的熒光強度不同，通常樣品中藥物濃度越大，被 抗體捕獲的藥物量越多，與包被原結合的抗體越少，則測得的熒光強度值越小。 標準曲線的繪制，將已知地塞米松含量的標準溶液配置成由低到高8種不同濃 度(0.1ng/mL， 0.5ng/mL， 1 ng/mL， 5 ng/mL， 10ng/mL， 25 ng/mL， 50ng/mL， 100ng/mL)，用與待測樣本相同的方法，重復(二)(三)步驟的操作，須啶某 種濃度的標準溶液對應的熒光強度，以地塞米松濃度為橫坐標，熒光強度為縱 坐標，繪制標準曲線，見圖1。 實施例2添加回收實驗
(1) 樣品的提取凈化在2g雞肉靡樣本中加入10mL乙腈/水(7:3)的混 合溶液，渦旋混合lmin，超聲波超聲30min， 2000xg離心10min，吸取2.5mL 上層液于干凈的玻璃管中，加入4mL正己烷和lmL 二氯甲垸脫脂，渦旋混合 lmin使三相分離，吸取lmL中間相(對應于0.2g樣品)于干凈的試管中；5CTC， 緩慢的N2流吹干，用0.2mL標準品稀釋液(含10%甲醇的含吐溫-20的磷酸鹽 緩沖液PBST)溶解殘留物，作為試樣供分析。
(2) 在2g空白的雞肉樣本中添加地塞米松標準品液，使其濃度為lng/g、 5ng/g、 10ng/g、 20 ng/g，各濃度分別制備樣品五份，按上述的前處理方法進行 提取后分析。結果見表1。可以看出，雞肉樣品中的回收率在69.2%~79.6%之間。 該分析方法重復性良好，相對標準偏差低于6.07 %。
表l添加回收率的測定
添加濃度(ng/mL)
實測濃度(ng/mL)
回收率(％)
0.650.74 0.67 0.71
0.69 69.2±6.07
.603.583.723.35 70.4±5.11
7.33 6.91
7.587.627.17 72.8±4.39
16.07 15.75 15.56 15.81 16.57 79.6±3.7權利要求
1.一種量子點標記的間接競爭熒光免疫檢測地塞米松的方法，其特征在于將包被原直接包被在酶標板的微孔中，加入地塞米松標準溶液或待測樣品形成抗原-抗體發光免疫復合體，用熒光酶標儀激發并檢測所形成的抗原-抗體發光免疫復合物的熒光強度，通過與標準溶液對比求出待測樣品中地塞米松的濃度；(一)用變性牛血清蛋白dBSA包裹發綠光的QD545標記抗地塞米松多克隆抗體(1)BSA變性將16.5mgBSA溶于10mL雙蒸水中，攪拌下加入0.42mgNaBH4，室溫下反應1h，60-80℃下加熱20min分解過量的NaBH4，BSA變性，二硫鍵打開成-SH，控制最終的dBSA水溶液的濃度為5×10-5M；(2)變性BSA包裹量子點dBSA-QDs將dBSA和量子點鏑化鉻Cd Te按摩爾比1∶1～1∶6混合，60-80℃水浴加熱15min，室溫下保持兩天，使包裹完全；(3)變性BSA包裹量子點偶聯抗體將0.056M的5μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺EDC與0.1M的5μL硫代N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS混合10s后，加入至25μL dBSA-QDs 2×10-5M中，變性BSA包裹的量子點活化15min，加入9.6μL地塞米松抗體Ab5×10-5M，反應物摩爾比控制為dBSA-QDs∶Ab∶EDC∶sulfo-NHS＝1∶1∶560∶1000，室溫下反應4h，得到量子點標記的地塞米松抗體，反應液中抗體的濃度為1.15mg/mL，用0.1％明膠的含吐溫的pH 7.4，0.01M磷酸鹽緩沖液作抗體稀釋液稀釋1000倍待用；(二)抗原的包被用地塞米松與卵血清白蛋白偶連體作為包被原，用pH 9.6，0.05M碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液，用包被緩沖液將地塞米松包被原稀釋至1-20μg/mL作為包被液，在酶標板的每孔中加100μL包被液，4℃冰箱過夜，用含NaCl 8.5g/L、pH 7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽緩沖液洗三次，按200μL/孔加0.1％明膠進行封閉；(三)抗原-抗體二元發光免疫復合體的形成在封閉后的酶標板孔中加入地塞米松標準溶液或待測樣品50μL，稀釋的量子點標記的地塞米松抗體50μL，37℃孵育1h，抗原與地塞米松藥物競爭抗體，部分抗體與抗原形成抗原-抗體二元免疫復合物，用含NaCl 8.5g/L、pH 7.2-7.4、10mmol/L磷酸鹽緩沖液洗三次，去掉非特異性吸附；(四)定量熒光檢測用熒光酶標儀激發并檢測所形成的抗原-抗體發光免疫復合物的熒光強度，激發波長430nm；發射波長545nm，通過與標準溶液對比求出待測樣品中地塞米松的濃度。
全文摘要
一種量子點標記的間接競爭熒光免疫檢測地塞米松的方法，屬于免疫檢測方法技術領域。本發明用于標記抗體的量子點為QD545，將包被原直接包被在酶標板的微孔中，加入地塞米松標準溶液或待測樣品形成抗原-抗體發光免疫復合體，用熒光酶標儀激發并檢測所形成的抗原-抗體發光免疫復合物的熒光強度，通過與標準溶液對比求出待測樣品中地塞米松的濃度。本發明不需加顯色物質就能檢測待測樣品中地塞米松的含量，即通過抗原-抗體免疫復合物的熒光強度，間接檢測待測樣品中地塞米松的濃度值，無論操作還是反應均只需一步就可完成；本方法用于標記抗體的量子點與傳統熒光相比，發射的熒光強度更強，且熒光穩定時間長。
文檔編號G01N33/543GK101308145SQ20081012352
公開日2008年11月19日 申請日期2008年6月17日 優先權日2008年6月17日
發明者尹麗梅, 彭池方, 李秋生, 胥傳來, 媛 袁, 偉 陳 申請人:江南大學