專利名稱：：多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及了一種定性和半定量檢測人血清中過敏原特異性抗體IgE含量的多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：過敏性疾病是現代社會中最常見的一種疾病，它是由廣泛存在的過敏原弓I發的，我國大約5-10%、美國和歐洲約有5-25%的人受過敏性疾病侵擾，其中幼兒和青少年的病癥尤為明顯，威脅較嚴重。過敏反應(allergicreaction)又稱變態反應；過敏原(allergen)又稱變應原。根據歐洲過敏和臨床免疫學學會(EuropeanAcademyofAllergyandClinicalImmunology,EAACI)發表的觀點，免疫介導的過敏反應有兩種類型IgE介導的過敏反應和非IgE介導的過敏反應(JohanssonSGO.etal，2001，Allergy,56:813-824)。IgE介導的過敏反應是過敏原刺激抗體的淋巴結、肝、脾等器官的單核吞噬系統，觸發漿細胞反應產生特異性IgE(slgE)抗體。IgE分子的Fc端附著在肥大細胞或嗜堿性粒細胞的IgE受體上，使機體處于致敏狀態。當機體再受同類型過敏原剌激時，過敏原使IgE分子交聯，引起肥大細胞或嗜堿性粒細胞脫顆粒化，釋放出組胺、白三烯及細胞因子等化學物質產生過敏反應、導致機體的毛細血管擴張、水腫、平滑肌痙攣、內分泌活動亢進，引發過敏性疾病的臨床癥狀，如花粉癥、過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性休克、蕁麻疹、濕疹、血管性水腫、關節炎、頭痛、腸胃功能失調及其它慢性癥狀(周光炎等譯，2002，免疫學，PP323-369,人民衛生出版社；SampsonHA，1999，Foodallergy,parti，JAllergyClinImmunol,103:717-728)。過敏原致敏傳遞方式分三類食物型，通過口腔攝入食物過敏原致敏；吸入型，通過鼻腔等吸入花粉、粉塵等環境過敏原致敏；接觸型，通過接觸皮膚，經毛孔傳遞引發過敏，如鎳、鉻制品，橡膠制品等。本試劑盒涉及的過敏原為食物型和吸入型的大分子過敏原蛋白或多肽。吸入型物質的過敏原是以Betvl為代表的樹花粉蛋白，以Phlp2為代表的草花粉蛋白，以Fddl為代表的動物皮屑蛋白，以Penc3為代表的霉菌類蛋白，以Derpl為代表的螨蟲蛋白和以Blagl為代表的蟑螂蛋白等(HillerRetal，2002，FASEBJ，16:414-418)。IgE介導的過敏反應的致敏過敏原檢測在臨床上可以通過皮膚試驗及各種體外檢測方法，如放射性過敏原吸附檢測(RAST)、免疫印跡(IS)及酶免疫分析(EIA)等，結合病史、病癥的問診來確定致敏的過敏原。體外檢測是測定血液樣本中的IgE，特別是過敏原特異性IgE(slgE)抗體濃度。酶免疫分析中有多種檢測結合酶的方法，即熒光法，化學發光法和免疫層析法等，且均有產品被美國FDA批準(ChapmanJAetal，2006，Foodallergy:apracticeparameter,AnnAllergyAsthmaImmunol,96:Sl-S68)。美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)專門制定了人IgE抗體免疫分析方法評價的綱要(I/LA20—A,NCCLS,1997，17(20))。使用多通道免疫層析法，僅用少量樣品就可以簡便、快速地同時檢測幾種至數十種過敏原，目測可定性判斷陽性或陰性結果，使用比色卡可半定量分級，試劑操作方便，既可用于醫院床邊快速診斷，也可用于社區診所或鄉村醫院甚至家庭。尤其適合我國當前的國情。多通道免疫層析法，采用高度特異性的抗原抗體反應及免疫層析分析技術來定性和半定量檢測血清中的特異性IgE抗體。當固化于硝酸纖維膜載體表面的致敏性抗原與病人血清在一起反應后，血清中特異性IgE就會特異地結合到抗原上，此特異結合的抗體被標記的抗人IgE抗體所識別，顏色的強度與血清中特異性IgE含量成比例;根據人血清中特異性IgE的濃度建立的分級比色卡，評判的過敏原的致敏程度。免疫層析法應用的多種技術，如過敏原蛋白的提取純化方法，人IgE抗體和抗人IgE抗體的制備、純化，膠體金標記抗人IgE抗體的制取純化等均己成熟，為多通道吸入型過敏原快速檢測試劑的商品化生產奠定了技術基礎。
發明內容本發明的目的在于提供一種多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒及其制備方法，每一個通道可快速檢測10—20種過敏原，多個通道可同時檢測60—IOO種不同的過敏原，多通道吸入型過敏原快速檢測試劑準確性高、特異性強、重現性好，使用方便、快速，既可定性也可半定量檢測人血清過敏原特異性抗體IgE的含量，用以篩査和確診兩級試劑檢測患者致敏的過敏原并確定患者致敏反應的程度。本發明的多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒，其組成包括已固化的吸入型螨蟲類、動物皮屑類、鳥羽絨類、花粉類、蟑螂類、霉菌類過敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條，膠體金標記的抗體，緩沖液，分級比色卡；其中已固化的吸入型螨蟲類過敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括塵螨、粉螨、屋塵；已固化的吸入型動物皮屑類過敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括貓、狗、馬、牛、羊；己固化的吸入型鳥羽絨類過敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括雞、鴨、鵝、鴿；已固化的吸入型花粉類過敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括樺樹、楓樹、榿樹、構樹、棕櫚、葵樹、榛樹、柏樹、松樹、杉木、栗樹、櫟樹、梧桐、楊樹、柳樹、桑樹、榆樹、艾蒿、豚草、藜草、車前草、白茅草、牛毛草、狗牙草、梯牧草、蘆葦、萚草、蒼耳、香蒲、莎車、芨芨草、向日葵；已固化的吸入型蟑螂類過敏原蛋白的硝酸纖維膜玻片包括德國小蠊、美、已固化的吸入型霉菌類過敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括點青霉菌、多主枝孢霉菌、煙曲霉菌、交鏈孢霉菌、黑根霉菌、釀酒酵母菌、小麥黑粉菌、毛霉菌、黑孢霉菌；膠體金標記抗體膠體金標記的抗人IgE抗體；多通道加樣槽由聚苯乙烯或聚氯乙烯材料制造的多通道加樣槽；緩沖液0.05mol/LpH8.0的Tris—HCl中含2。/。胎牛血清，0.15mol/LNacl，0.5%Tween-20和20mg/L慶大霉素；分級比色卡根據國際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級標準的關系，制作的分級比色卡(顏色的強度與血清中特異性IgE含量成比例，隨特異性IgE濃度的升高，顏色逐漸變深)。上述的固化的吸入型過敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條置于多通道加樣槽中。本發明的多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒的制備方法，包括如下步1)過敏原蛋白的制備將含過敏原蛋白的材料經粉碎、脫脂、提取、SDS-PAGE電泳確證、洗脫、干燥；2)膠體金標記抗體的制備用膠體金標記的抗人IgE抗體；3)用過敏原蛋白固化硝酸纖維膜條，并封閉；4)將過敏原蛋白固化硝酸纖維膜條放入多通道加樣槽中；5)配制緩沖液0.05mol/LpH8.0的Tris—HC1中含2%胎牛血清，0.15mol/LNacl，0.5%Tween-20和20mg/L慶大霉素；6)根據國際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級標準的關系，制作分級比色卡。(顏色的強度與血清中特異性IgE含量成比例，隨特異性IgE濃度的升高，顏色逐漸變深)。上述的多通道加樣槽由聚苯乙烯或聚氯乙烯材料制造。本發明的試劑盒的使用方法，包括如下操作步驟(1)加入樣品液到加樣孔中，樣品液中的過敏原特異性IgE抗體各自與相應的固相過敏原蛋白結合，過敏原特異性IgE抗體再與膠體金標記的抗人IgE抗體結合，膠體金標記的抗人IgE抗體同時也與質控區中人IgE相結合。(2)加入緩沖液加樣孔中，加快血清標本遷移速度，被結合區域顯色；(3)20—30分鐘后，用分級比色卡觀察結果；顏色的強度與血清中特異性IgE含量成比例。固化在硝酸纖維膜條表面上的抗原捕獲樣品血清中的特異性IgE抗體，波體金標記抗人IgE抗體識別特異性IgE并與之結合，形成抗原—特異性IgE一膠體金標記抗人IgE抗體的復合物，顏色的強度與血清中特異性IgE含量成比例，目測可定性判斷結果，使用比色卡可對檢測結果進行半定量分級。本發明的有益效果在于本發明建立了多通道免疫層析法測定樣品液中的過敏原特異性IgE抗體含量，定性和半定量篩查致敏過敏原，檢測靈敏度小于0.3IU/ml,使用比色卡可對檢測結果進行半定量分級，目測可定性判斷結果。臨床檢測中可以一次加樣，每一個通道可快速檢測10—20種過敏原，多個通道可同時檢測60—IOO種不同的過敏原，具有簡便、快速、靈敏、穩定的優點，為體外輔助診斷確定使患者致敏的過敏原及過敏反應程度提供了有效的手段。既可用于醫院床邊快速診斷，也可用于社區診所或鄉村醫院甚至家庭。圖1是一塊多通道吸入型過敏原快速檢測試劑板的俯視圖2是三種螨蟲主要過敏原蛋白Derpl、Derfl、Eurml的氨基酸序列比較(具有相同氨基酸殘基的底色為灰色)；'圖3是三種螨蟲主要過敏原蛋白Derp2、Derf2、Eurm2的氨基酸序列比較(具有相同氨基酸殘基的底色為灰色)；圖4是過敏原蛋白chea2、phlpll及Olee2Betv2的氨基酸序列比較(具有相同氨基酸殘基的底色為灰色)。具體實施方法以下結合實施例進一步說明本發明。實施例1本發明的多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒，其組成包括已固化的吸入型螨蟲類、動物皮屑類、鳥羽絨類、花粉類、蟑螂類、霉菌類過敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條，多通道加樣槽，膠體金標記抗人IgE抗體、緩沖液、分級比色卡。本發明的多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒的制備方法-l.過敏原蛋白的制備l.l過敏原蛋白的粗浸提液l丄l吸入型螨蟲類蛋白提取液取50g詞養的螨蟲，加入80ml丙酮或無水乙醇清洗滅活后用多層紗布過濾除去溶劑，風干、研細，再加入100ml乙醚，反復振搖l小時脫脂；揮凈乙醚的脫脂粉以l:100(w/v)的量加入0.125mol/lNH4HCO3緩沖液(H8.3)，內含0.1。/。NaN3溶液室溫提取3小時，期間經常攪拌；10000g離心20分鐘，上清液-2(TC下貯存。1.1.2吸入型動物皮屑和鳥羽絨類蛋白提取液采集的皮屑和剪碎的羽絨用2倍以上苯、丙酮等溶劑浸泡L5小時，不斷振搖脫脂，倒掉溶劑、揮凈殘余溶劑后用5%(W/V)的0.125mol/lNH4HCO3緩沖液(pH8.3)4t:下提取20小時，不斷振搖，然后13000g4。C離心15分鐘，上清液過三層紗布過濾，濾液-2(TC下貯存。1.1.3吸入型花粉類蛋白提取液采集的花粉過篩去除雜質，加入3倍乙醚浸泡振搖脫脂2小時，棄去溶劑，揮凈殘余乙醚。取脫脂后的花粉lg在40ml0.125mol/lNH4HC03緩沖液(pH8.3)4。C下攪拌過夜(20小時以上)，然后15000g離心15分鐘除去不溶物。該提取上清液每5(Hil加入400nl冷甲醇，4。C靜置過夜沉淀蛋白，離心，N2氣下干燥后的沉淀溶于含SDS的緩沖鹽溶液(pH7.0)中，待用。1.1.4吸入型蟑螂類蛋白提取液蟑螂放冰箱冷凍滅活，加入無水乙醇浸泡半小時、洗去蟲體表面微生物后風干，在粉碎機中以2400rpm打成粉末；加入3倍體積的乙醚+乙酸乙酯(1+1，V/V)浸泡振搖脫脂2小時，棄去帶脂溶劑，殘余乙醚揮干后，30g粉末加入200ml含6mmol/l卩-巰基乙醇和1/1000體積的蛋白酶抑制劑的PBS(pH7.4)溶液，緩緩攪拌4'C下過夜，且每毫升加入lmg的1-苯基-3-(2-硫腙基)-2-硫脲防止溶液黑褐化；然后將提取液在4"C下以10000g離心30分鐘，上清液過0.45nm濾膜后-20'C下貯存。1.1.5吸入型霉菌類蛋白提取液干燥的霉菌塊狀固體，用高速種籽粉碎機打成粉末，過4號篩；取適量粉末加入3倍體積的乙醚浸泡振搖2小時，棄去乙醚并將樣品中殘余乙醚揮盡，再加入2倍體積的甲醇浸泡振搖1小時，離心除去甲醇，N2氣下干燥；5g菌粉中加入100ml含2mmo1/1EDTA和8mmo1/1的P-巰基乙醇的PBS溶液4'C下攪拌提取過夜，然后15000g4-C離心30分鐘，上清液-2(TC下貯存。1.2過敏原蛋白的提取過敏原蛋白的粗提取液需經透析、SDS-PAGE電泳免疫印跡確認、割膠、離心提取的較純的過敏原蛋白組分。(1)將浸提液在透析袋(MWCO10000)中對10mmol/LPBS(pH7.2)透析48小時，期間緩緩攪動PBS溶液，并更換PBS液4次；(2)透析后的過敏原蛋白溶液過0.45pm濾膜，并稀釋成4mg/ml的蛋白溶液；(3)過敏原蛋白溶液灌入SDS-PAGE的膠柱，電泳分離；在分子量10-100kD的區域用病人陽性血清在一個電泳膠柱進行免疫印跡，顯色；(4)切割下其余膠柱過敏原蛋白定位的相應條帶，加入適量PBS溶液后，室溫2000g離心IO分鐘；(5)測出過敏原蛋白溶液的濃度，加入適量防腐劑，-20°(:下冷凍貯存。2.膠體金標記抗體的制備2.1膠體金制備膠體金的制備多采用還原法。氯金酸(HAuCU)是主要被還原材料，常用還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。根據還原劑類型以及還原作用的強弱，可以制備0.8nm150nm不等的膠體金。最常用的制備方法為檸檬酸鹽還原法。具體操作方法如下a.將HAuCl4先配制成0.01X水溶液，取100ml加熱至沸；b.攪動下準確加入一定量的1%檸檬酸三鈉(Na3C6H507'2H20)水溶液；c.繼續加熱煮沸15min。此時可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續而轉成黑色，隨后逐漸穩定成紅色。全過程約23min;冷卻至室溫后用蒸餾水恢復至原體積。用此法可制備16147nm粒徑的膠體金。金顆粒的大小取決于制備時加入的檸檬酸三鈉的量。2.2膠體金標記抗人IgE抗體用膠體金標記蛋白質，就是指蛋白質吸附到膠體金顆粒表面。膠體金表面帶有負電荷，能與蛋白質的正電荷靜電吸引而形成牢固的結合。由于這種結合主要是物理作用，所以不會引起蛋白質活性的改變。標記前，需確定膠體金與待標記蛋白質的比例和將pH值調節到標記蛋白質IgG的等電點或略高(pH8.2)。標記時，將待標記抗人IgE抗體lmg加15ml膠體金溶液(IOD)，混合，室溫攪拌15分鐘，在磁性攪拌下加入5%的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為1%，混合5分鐘，離心，再通過離心法或凝膠層析法純化標記的抗人IgE抗體。放在4'C達2年半仍然保持良好性能。3.用過敏原蛋白固化硝酸纖維膜條3.1材料和儀器(1)活化處理過的硝酸纖維素膜(Millipore，MDI，S&S，whatman等國外公司的硝酸纖維素膜)，能與蛋白質分子中的氨基基團反應形成穩定的共價鍵。(2)過敏原蛋白；(3)0.05mol/LTris—HC1緩沖液(pH8.0)或活化增強劑；(4)0.01mol/LPBS溶液；(5)3。/。BSA封閉液；(6)納米芯片噴點系統；(7)金屬箔袋及真空封口機等。3.2步驟(1)過敏原蛋白的硝酸纖維素膜條制備采用Millipore，MDI，S&S，whatman中等流速的硝酸纖維素濾膜。試劑墊、樣本墊、吸收墊采用Millipore公司產品，與玻片相比，膜的優點是與蛋白親和力強，檢測技術成熟，通常無需另外修飾。硝酸纖維素膜、尼龍膜、PvDF膜等都是帶有微孔的濾膜，其孔徑一般在0.45pm左右，在顯微鏡下這種膜就是一個立體的纖維網絡，可以結合更多的蛋白質探針，使檢測更加靈敏。同時，這種多孔結構可使液體在其中進行自由擴散，當在膜的一端給以液體擴散壓力時，液體將沿一定方向擴散，是層析的良好材料，是制作層析過敏原蛋白的非常理想的載體。(2)點樣具體采用0.05mol/L碳酸緩沖液，pH9.6或根據過敏原蛋白的特性選擇的緩沖液適當稀釋過敏原蛋白溶液成0.05pg/ml-l(nig/ml的濃度。稀釋后將過敏原蛋白(100pl)加到噴樣儲液瓶內，應用微量連續型點膜機(如BIO-DOT公司的產品)，將變應原溶液噴線于膜的相應的位點非接觸式連續點樣，即噴點，每次點樣lpl，連續3次；噴點后的硝酸纖維素膜放置2—8t:下反應過夜。用3%BSA封閉液，37°C下保溫2小時。層析膜條一般25—30mm長，可以噴線2—10條線或噴點2—30點，(3)固化人IgE陽性的質控區；a.材料人IgE抗體來源于人血漿中經親和色譜純化，純度>95%的人IgE抗體(購自美國Biodesign公司)。b.步驟用樣品稀釋液將人IgE抗體配制成濃度為50IU/ml，在過敏原蛋白硝酸纖維素膜條上端固化人IgE抗體即為陽性質控區。4.將過敏原蛋白固化硝酸纖維膜條放入多通道加樣槽中采用切割機將固化好的過敏原蛋白硝酸纖維素膜條切成所需的規格和形狀，放入相應的多通道加樣槽中，再加入干燥劑裝入金屬箔袋內密封，在2—8"C下貯存。多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒具有20塊多通道吸入型過敏原快速檢測試劑板，每塊試劑板如圖1所示，圖中1為樣品加樣窗，2為過敏原蛋白固化的硝酸纖維膜條，3為加樣槽微流通道，4為吸水墊出口窗。5.配制緩沖液0.05mol/LpH8.0的Tris—HCl中含2°/。胎牛血清，0.15mol/LNacl，0.5%Tween-20和20mg/L慶大霉素；6.分級比色卡制作根據國際上特異性IgE抗體濃度和分級標準的關系，印制分級比色卡。本發明的多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒的使用方法l.檢測步驟(1)將所有試劑平衡至室溫(20^25°C)。(2)測定時用加樣吸管向檢測板上標本孔內加入23滴血清(若使用定量加樣器，每孔加10015(HU血清)，血清標本遷移至質控區指示線時加入緩沖液1滴。(3)20—30分鐘觀察結果。2.結果判斷a.目測:(1)陽性結果在檢測板上質控區和相應的過敏原平行處的檢測線出現紅色反應帶。(2)陰性僅質控區出現一條紅色條帶(3)無效質控區未出現紅色條帶b.使用分級比色卡可半定量分級判斷陽性結果呈陽性的指標應與分級比色卡級別應基本一致，其分級結果只允許在相鄰兩個級別間變化。國際上過敏原特異性IgE濃度的分級方法國際分級標準_過敏程度分級分級IgE濃度_0級<0.35IU/ml陰性1級0.35—0.70IU/ml弱陽性2級0.71—3.50IU/ml陽性實施例2篩查型多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒中共同固化過敏原蛋白的選擇在分子水平上通過細胞結合IgE反應性的蛋白質的IgE結合抗原決定簇的識別來推測蛋白質的過敏反應性。美國過敏、哮喘和免疫學學會(theAmericanAcademyofAllergy,AsthmaandImmunology(AAAAI))禾口美國過敏、哮喘禾口免疫學學院(theAmericancollegeofAllergy,AsthmaandImmunology(ACAAI))聯合接受的文件"食物過敏實用參數(Foodallergy:apracticeparameter)"中認為，蛋白質促發過敏反應是因為蛋白質存在的功能氨基酸序列，包括線性序列上或構象上能與B細胞上特定的受體蛋白結合的結構，即抗原決定簇。如果兩種蛋白質或多肽均含有的一個或幾個主要過敏原蛋白的氨基酸序列的等同性達70%或兩個蛋白質或多肽共享8個或8個以上連續相同的氨基酸序列，就可認為該兩個蛋白質或多肽存在著相同過敏癥狀的抗原決定簇(ChapmanJAetal，2006，Foodallergy:apracticeparameter,AnnAllergyAsthmaImmunol,96:Sl-S68)。依據這一原則，從互聯網上的大型數據庫NCBI、0.51—17.5IU/ml50.01—100IU/ml17.51—50.0IU/ml較強陽性強陽性特強陽性超強陽性PubMed、EBI或文獻中檢索比對同類型致敏材料的主要過敏原蛋白的氨基酸序列，將符合該原則的材料的過敏原蛋白等量混合，共同固化在硝酸纖維素膜條的同一位點表面。將它們的過敏原蛋白共同固化在硝酸纖維素膜條的同一位點表面o普遍存在的吸入型過敏物質螨蟲，世界上主要有三種類型Dermatophagoidespteronyssinus、Dermatophagoidesfarinae禾口Euroglyphusmaynei。從它們所含的過敏原蛋白的蛋白組學分子研究可知，主要過敏原蛋白Derpl、Derfl、Eurml及Derp2、Derf2、Eurm2的氨基酸序列有84-86%的等同性(見圖2，圖3)，將三種螨蟲過敏原蛋白提取物混合，固化在硝酸纖維素膜條的同一位點表面，篩選螨蟲致敏。吸入型過敏物質花粉中也有很多符合該原理的例子，如藜科植物花粉的過敏原蛋白的Chea2與梯牧草花粉過敏原蛋白phlpll，橄欖及樺樹花粉過敏原蛋白的01ee2Betv2的氨基酸序列的等同性也達70%以上(圖4)。將Chea2與梯牧草花粉過敏原蛋白phlpll;橄欖及樺樹花粉過敏原蛋白的01ee2Betv2過敏原蛋白提取物混合，固化在硝酸纖維素膜條的同一位點表面。實施例3用多通道吸入型過敏原快速檢測試劑試驗對103例過敏患者(2—18歲的30人，18—70歲的43人)，抽取血液制備血清定性篩査(屋塵螨、粉塵螨、貓毛、狗毛、樺樹、梧桐、艾蒿、豚草)過敏原。按上述多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒的使用方法測出患者血清在不同過敏原特異性IgE濃度，根據分級比色卡判斷為陽性結果。檢測結果如下表皮炎患者中致敏環境篩查結果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>檢測結果表明，采用本發明的試劑盒能夠簡便、快速、準確地檢測出致敏過敏原，靈敏度達91.0%，特異性達83.0%，準確性85.0%。權利要求1、多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒組成包括已固化的吸入型螨蟲類、動物皮屑類、鳥羽絨類、花粉類、蟑螂類、霉菌類過敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條，膠體金標記的抗體，緩沖液，分級比色卡；其中已固化的吸入型螨蟲類過敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括屋塵螨、粉塵螨；已固化的吸入型動物皮屑類過敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括貓、狗、馬、牛、羊；已固化的吸入型鳥羽絨類過敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括雞、鴨、鵝、鴿；已固化的吸入型花粉類過敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括樺樹、楓樹、榿樹、構樹、棕櫚、葵樹、榛樹、柏樹、松樹、杉木、栗樹、櫟樹、梧桐、楊樹、柳樹、桑樹、榆樹、艾蒿、豚草、藜草、車前草、白茅草、牛毛草、狗牙草、梯牧草、蘆葦、葎草、蒼耳、香蒲、莎車、芨芨草、向日葵；已固化的吸入型蟑螂類過敏原蛋白的硝酸纖維膜條片包括德國小蠊、美洲大蠊；已固化的吸入型霉菌類過敏原蛋白的硝酸纖維膜條包括點青霉菌、多主枝孢霉菌、煙曲霉菌、交鏈孢霉菌、黑根霉菌、釀酒酵母菌、小麥黑粉菌、毛霉菌、黑孢霉菌；膠體金標記的抗體膠體金標記的抗人IgE抗體；緩沖液0.05mol/LpH8.0的Tris—HCl中含2％胎牛血清，0.15mol/LNacl，0.5％Tween-20和20mg/L慶大霉素；比色卡根據國際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級標準的關系，制作的分級比色卡。2.根據權利要求1所述的多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒，其特征在于固化的吸入型過敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條置于多通道加樣槽中。3.根據權利要求1所述的多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)過敏原蛋白的制備將含過敏原蛋白的材料經粉碎、脫脂、提取、SDS-PAGE電泳確證、洗脫、干燥；2)膠體金標記抗體的制備用膠體金標記的抗人IgE抗體；3)用過敏原蛋白和人IgE抗體固化硝酸纖維膜條，構成測試線和質控區，并封閉；4)將固化處理過的硝酸纖維膜條放入多通道加樣槽中；5)配制緩沖液0.05mol/LpH8.0的Tris—HCl中含2%胎牛血清，0.15mol/LNacl,0.5%Tween-20和20mg/L慶大霉素；6)根據國際上通用的特異性IgE抗體濃度和分級標準的關系，制作分級比色卡。全文摘要本發明公開了多通道吸入型過敏原快速檢測試劑盒及其制備方法，試劑盒組成包括已固化的吸入型螨蟲類、動物皮屑類、鳥羽絨類、花粉類、蟑螂類、霉菌類環境過敏原蛋白和人IgE抗體的硝酸纖維膜條，膠體金標記抗人IgE抗體、緩沖液和分級比色卡。采用該試劑盒，目測可定性判斷結果，使用比色卡可對檢測結果進行半定量分級，臨床檢測中可以一次加樣，每一個通道可快速檢測10-20種過敏原，多個通道可同時檢測30-60種不同的過敏原，具有簡便、快速、靈敏、穩定的優點，為體外輔助診斷確定使患者致敏的過敏原及過敏反應程度提供了有效的手段。文檔編號G01N33/558GK101393215SQ20081012229公開日2009年3月25日申請日期2008年11月17日優先權日2008年11月17日發明者吳善東申請人:杭州浙大生物基因工程有限公司