專利名稱：：HIV-1p24抗原吖啶酯化學發光免疫分析檢測方法
技術領域：
：本發明屬于臨床血液檢測分析方法
技術領域：
，具體涉及一種用于臨床和實驗室檢測HIV-1p24抗原的方法。該方法靈敏度高、檢測范圍寬、搡作簡便，在新生兒HIV-1感染的診斷、HIV-1感染者病情發展的監測、耐藥性監測、抗病毒治療效果的評價等方面有重要應用。技術背景HIV-1(Humanimmunodeficiencyvirus)病毒感染人體之后,在宿主細胞和病毒中會產生一些HIV感染的標志性物質(NielT.Constantine，HollyZink.HIVtestingtechnologiesaftertwodecadesofevolution.IndianJMedRes121.2005:519-524),通過這些標志物我們可以進行病毒檢驗、監測病毒在體內的復制情況、了解感染后病情的發展、并實時掌握人體的免疫系統狀況。病毒感染后，這些標志物隨著病毒侵染過程，p24抗原作為標志物之一，在病毒診斷方面受到了人們的廣泛關注。通常來講HIV-1的核酸(RNA)檢測是靈敏性和特異性的方法，但是在實際應用方面，核酸檢驗具有很多不便于推廣的因素。核酸檢測同其它檢驗方法相比，所需的實驗費用比較昂貴，所需的實驗儀器和實驗條件也比較苛刻。另外，核酸檢驗的操作復雜，為了增加檢驗結果的可靠性，就要求實驗操作人員有比較高的專業操作水平。同時，核酸實驗整體耗時較長。而從全球艾滋病毒感染者的分布情況來看(■IDS,WHO.AIDSepidemicupdate2006.)，大部分的感染者都分布在經濟不發達的地區，如非洲等，這就為HIV-l的RNA4企測在不發達地區的推廣造成了不便。為了解決這一方面的問題人們在其它檢驗方法上估支了4艮多嘗試，如全淋巴細胞計數、紅細胞檢測、血清白蛋白檢測、p24抗原檢測、抗p24抗體檢測等，試圖以此來替代核酸檢測方法進行艾滋病的相關檢測，其中HIV-1p24抗原檢測方法的研究最為廣泛。在新生兒HIV-l診斷、HIV-l感染者病情發展的監測、抗病毒治療效果的檢驗等方面都具有4艮好的效果，并同核酸;險測方法具有4艮好的相關性，有望替代核酸才企測在廣大不發達地區廣泛推廣。常用的HIV-1p24抗原;險測方法為酶聯免疫分析法(Enzymelinkedimmuno-sorbentassay,ELISA),并多采用雙抗夾心法進行檢測，檢測的靈敏度在3.5-10pg/ml，檢測寬度在2-3個數量級。為了提高檢測靈敏度，使HIV-1p24抗原檢測方法能在檢測靈敏性和特異性方面不斷接近核酸檢測的水平，在過去的二十幾年時間里人們在普通ELISA基礎上做了各種改進，其中最為成功的方法有ELASTELISA方法和IPCR(Immunepolymerasechainreaction)-ELISA方法等。Ledergerberetal在文獻中報道，應用ELASTELISA方法(Perkin-ElmerLifeSciences,Boston,MA)進行HIV-1型p24抗原的檢測，其才全測限可以達到0.5pg/ml。JanetM.Barletta應用免疫PCR方法同ELISA方法(Zeptomertrix，Buffalo,NY)結合，檢測低限可以達到1000個p24抗原分子。但/人實際應用中來分析以上兩種方法第一種方法所應用的》丈大體系主要是生物素-鏈親和素放大系統，這種體系常會在血清樣品檢驗中出現非特異性的反應，同時引入放大系統后操作步驟增加，反應時間也會延長，為了減少非特異性反應洗滌次數也要增加；第二種體系中引入的免疫PCR反應，在反應時間和操作步驟上增加難度之外，在核酸標記反應上也為實驗體系的操作上增加了不便。化學發光免疫分析方法其原理與酶聯免疫方法相似，是把化學發光物質與免疫學反應結合起來，用光反應表現被測的免疫成分濃度。即把高靈敏的光反應與特異性的免疫學反應相結合，用發光強度來對抗原、抗體等物質進行定量分析的方法。其中化學發光是伴隨化學反應過程所產生的光的發射現象。某些物質在進行化學反應時吸收了反應過程中所產生的化學能，使反應產物從分子狀態激發到電子激發態。當電子從激發態的最低振動能級回到基態的各個振動能級時產生輻射，多余的能量以光子的形式釋放出來，這一現象稱為化學發光(吳建民.臨床化學自動化免疫分析.科學出版社，2000)。化學發光免疫分析方法自身具有靈敏度很高的靈敏性(C.Dodeigne,LThunus,R.Lejeime.ChemiluminescenceasDiagnosticTool.Talanta2000,51:415-439)，由于不需要外來光源，避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音，因而本底低且具有比熒光法更高的信噪比，其靈敏度比酶聯免疫分析或放射性免疫分析方法高1至2個數量級;另外化學發光試劑本身也有檢測線性范圍寬的優點A.C.Calokerinos,N.T.Deftereos，W.R.G.Baeyens.ChemiluminescenceinDrugAssay.JournalofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis.1995，13:1063-1071.),可達6-7個lt量級。吖啶酯類化合物作為一種常用的化學發光試劑，在化學發光免疫分析體系的研究中得到了廣泛的關注。它具有靈敏度高、容易標記到蛋白、多肽和小分子上的優點。而且由于吖啶酯或吖咬磺酰胺類化合物在有11202的稀堿溶液中即能發生化學發光，無需催化過程，也不需要增強劑，從而降低了背景發光，提高了信噪比，干擾作用少，因此是化學發光免疫分析的理想的發光底物。例如，美國CibaCorning公司研制的ACS-180免疫分析試劑盒體系就是采用二曱基吖啶酯直接標記的，靈敏度可達10—15g/l。用來進行固相免疫學反應的吖啶酯類化合物可以選擇4-(2-琥珀酰亞氨基羧基)苯基-10-曱基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸鹽(AcridiniumC2NHSEster)等，目前已臨床用于曱狀腺功能、生殖生理、腫瘤標志物、藥物監測及心血管等多個項目得到應用。但還未見有吖咬酯化學發光免疫分析檢測方法用于HIV-lp24抗原4企測的才艮道。
發明內容本發明的目的在于提供一種靈敏度高、檢測范圍寬、簡單、快捷，便于自動化的HIV-1p24抗原吖啶酯化學發光免疫分析檢測方法。本發明采用雙抗夾心的方法，以激發劑激發標記于抗HIV-1p24抗體上的吖咬酯發光，進行HIV-1p24抗原的定性和定量分析，具體步驟如下(1)用抗HIV-1p24抗體對固相載體進行包被；(2)處理HIV-1樣品，即解離HIV-1樣品，分離HIV-1p24抗原；(3)將步驟(2)中處理后的HIV-1樣品和吖啶酯類化合物標記的抗HIV-1p24配對抗體加入步驟(1)中的反應體系進行免疫反應；(4)將激發劑1和激發劑2加入步驟(3)中的反應體系，進行化學發光反應；(5)檢測步驟(4)中化學發光反應產生的光子數，進行定性或/和定量分析。其中，步驟(1)中的抗HIV-1p24抗體可以對各種各樣的固相載體進行包被，如聚苯乙烯乳膠、聚苯乙烯塑料制品、聚氯乙烯塑料制品、脂質體、免疫磁性微珠等。步驟(2)中所述的HIV-1樣品為任意來源的HIV-1p卩4抗原。任意來源是指，HIV-1艾滋病毒感染者的血液、以HIV-l病毒侵染細胞后得到的細胞培養產物、以原核生物或真核生物為表達載體根據基因工程而得到的p24重組抗原。其中，血液需要通過物理方法離心得到血清。細胞培養產物需要物理方法、化學方法和生物方法使其裂解，離心取其上清。重組抗原需要通過物理方法、化學方法和生物方法使其純化。血液來源和細胞培養物來源的p24抗原，以游離的p24抗原分子和p24抗原及其抗體的復合物的一種或任意組合的形式存在，需要預先進行加熱解離或酸性解離以使抗原從抗原抗體復合物中解離出來。步驟(2)中所述的HIV-1樣品包含任意類型的HIV-1型病毒。任意類型是指M亞群和O亞群的一種或任意組合。所述的M亞群中包括A、B(B')、C、D、E、F、G、H、I和J等10個亞型。步驟(4)中所述的激發劑1為過氧化氫和硝酸的混合液，其中過氧化氫的濃度為0.05-0.1M,硝酸的濃度為0.1-0.5M;所述的激發劑2為曲拉通100和氯氧化鈉的混合液，其中曲拉通100的濃度為0.1-0.5M,氫氧化鈉的質量分數為2-5%;過氧化氫和氫氧化鈉主要為吖啶酯類化合物提供堿性的發光環境；優選加入激發劑1,0.5-1秒鐘后再加入激發劑2。本發明方法中采用吖啶酯類化合物標記配對抗體。主要通過化學反應將一種分子共價連接到另一種分子上，參與偶聯反應的兩種物質分別稱為標記物和被標記物。化學標記的目的是使被標記物保持自身的性質(如免疫學性質)且又具有標記物的某些性質(如發光性質)。吖啶酯類化合物通過化學反應使吖啶酯通過共價鍵與被標記的蛋白、多肽或核酸的氣基結合。本發明所涉及的硝酸和曲拉通100為吖啶酯類化合物發光的激發劑、增強劑，使吖啶酯類化合物在激發劑的作用下瞬時即可發光，同以往酶聯免疫分析反應相比大大縮短了#:作的時間。本發明所涉及的吖啶酯類化合物的激發劑以即時加樣即時檢測的方法進行檢測，發光即可檢測光子數，不需要加入終止試劑、信號放大體系等額外反應，也減少了操作步驟。普通的化學發光免疫分析方法的自動化程度已經很高，目前國內外的全自動化學發光儀已經很多，如CibaCorning公司的ACS:180、PerkinElmer公司的MulUlabelCounterVICTOR1420等。本發明方法采用的即時加入激發劑的方法對于自動化操作、減少人為操作誤差、提高檢測靈敏度都很有幫助。與現有技術相比較，本發明具有以下有益效果1)靈敏度較高，可達到O.5pg/ml，達到國際先進水平。2)檢測范圍較寬，可達到5-6個數量級，對較高濃度的樣品無需稀釋即可檢測。3)操作簡便，反應時間短，吖啶酯類化合物在激發劑作用下兩秒內即可發光。4)有利于反應體系的自動化操作。圖1、吖啶酯化學發光免疫分析HIV-1p24抗原的胡克效應。圖2、吖啶酯化學發光免疫分析HIV-1p24抗原標準曲線擬合。以下結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步說明。具體實施方式材料和試劑吖"定酉旨(AcridiniumC2NHSEster)購自Assaydesigns公司；固相載體(白色96微孔板ImmunoMaxiSorp)購自Nunc公司;包被緩沖液Na2C03-NaHC030.05MpH9.5洗滌緩沖液Na2HP04-NaH2P040.01MNaCl0.9%pH7.4封閉緩沖液Na2HP04-NaH2P040.05MNaCl0.9%BSA1%PH7.4分析緩沖液Na2HP04-NaH2P040.05MNaCl0.9%200.05%BSA0.5%pH7.0激發劑1:HN030.1MH2020.08M激發劑2:TritonX-1002%NaOH0.2MHIV-1樣品HIV-1p24重組抗原(病毒所提供)；HIV-lp24抗原國家參考品(購自中國藥品生物制品;險定所)包括20支HIV-lp24抗原陰性參考品，編號為Nl-N20;10支HIV-1p24抗原陽性參考品，編號為Pl-P10;IO支線性靈敏度參考品，編號為L1-L10;HIV-lp24抗原檢測精密度參考品,編號為AgCV;陰性對照人血清(VironostikaHIV-1Antigen,bioMerieuxInc.,Durham,NC);陽性對照重組p24抗原(VironostikaHIV-lAntigen,bioMerieuxInc.,Durham,NC)。實施例1)用包被緩沖液將包被用抗p24抗體稀釋至6pg/ml后，于白色96微孔板中，每孔加入100p1,4。C封閉16個小時；2)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入300pl洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次；3)每孔加入封閉緩沖液300p1,37。C恒溫震蕩1個小時；4)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入300jul洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次，晾千后4。C保存；5)分別將濃度為80、40、20、10、5pg/ml的五個陽性對照樣品加入孔中，每個濃度2個復孔，每孔加入100)n1,將陰性對照樣品分別加入4個孔中，每孔加入100pl，將HIV-1p24抗原國家參考品40個樣品(N1-N20、PI-P10和L1-L10)各加入1孔，每孔加入lOOjil,將AgCV樣品分別加入4個孔中，每孔加入100|ul，3rc恒溫振蕩1個小時；6)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入30(^1洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次；7)用分析緩沖液對吖啶酯標記的抗p24抗體進行1:200倍稀釋后，每孔加入lG0iil;8)將HIV-1樣品和吖啶酯標記的抗HIV-lp24抗體充分混合后，于37。C恒溫振蕩1個小時；9)甩凈孔中液體，將洗滌緩沖液每孔加入30(^1洗滌，每次洗滌3分鐘，共洗滌3次；10)將50|il激發劑1和50pl激發劑2,分別通過多功能分析儀即時力口入孔中，兩試劑加入時間相隔1秒；11)加入激發劑后立即檢測發光值，檢測結果如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表lHIV-1p24抗原國家參考品檢測結果評價標準20支HIV-1p24抗原陰性參考品不得出現陽性反應(20/20)。IO支HIV-Ip24抗原陽性參考品不得出現陰性反應(10/10)。10支線性靈敏度參考品對HIV-1p24抗原檢測試劑，最低檢出量不得高于1.25U/ml(至少檢測出LI-L5),進行p24定量測定時，LI-L5共5個樣品測定值統計分析后線性關系系數(R值)必須>0.95。精密度測定統計分析后CV《15%。結合評價標準可知本發明方法檢測結果符合HIV-lp24抗原國家參考品標準的要求。相應參數的確定1、分析靈每文度將HIV-lp24重組抗原用分析緩沖液進行梯度稀釋，分別得到0,0.05pg/ml,0.1pg/ml，0.2pg/ml，0.5pg/ml,1pg/ml,2pg/ml，5pg/ml,10pg/ml,20pg/ml,50pg/ml,100pg/ml，200pg/ml,500pg/ml等濃度梯度，每個濃度3個復孔，每孔加入100pU。0標準和各樣品作10次批內重復測定，求每組的均值(M)、標準差(SD)和變異系數(cvy。)。反應所應用的吖。定酯標記抗體為1:1000倍稀釋。激發劑1和2均為多功能分析儀即時加樣、即時檢測。將各濃度梯度所得(M-3SD)x值與陰性對照的(M+3SD)NC值進行比較，選取(M-3SD)X>(M+3SD)NC時的最小濃度值為該體系的檢測限，經比較本發明方法的檢測限為0.5pg/ml。2、檢測寬度2.1胡克效應將HIV-lp24重組抗原用分析緩沖液進行梯度稀釋，分別得到0,lng/ml，5ng/ml,10ng/ml，20ng/ml,50ng/ml，100ng/ml,200ng/ml，500ng/ml，lOOOng/ml,2000ng/ml，5000ng/ml等濃度梯度,每個濃度3個復孔，每孔加入10(^1。0標準和各樣品4次批內重復測定，求每組的均值。反應所應用的吖啶酯標記抗體為1:100倍稀釋。激發劑1和2均為多功能分析儀即時加樣、即時檢測。100ng/ml的濃度梯度所對應的發光值最高。當被;險測的HIV-lp24抗原濃度大于100ng/ml時，其發光值不^f旦沒有升高反而急劇下降，呈明顯的鉤狀，如圖1所示。2.2檢測寬度將HIV-lp24重組抗原用分析緩沖液進行梯度稀釋，分別得到0，10pg/ml，20pg/ml,50pg/ml,100pg/ml,200pg/ml，500pg/ml，lng/ml，2ng/ml，5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml,lOOng/ml等14個濃度的樣品，每個濃度2個復孔，每孔加入10(^1。0標準和各樣品作4次批內重復測定，求每組的變異系數。反應所應用的吖啶酯標記抗體為1:1000倍稀釋。激發劑1和2均為多功能分析儀即時加樣、即時檢測。在所選的濃度范圍內，各個梯度的變異系數均小于20%,故此將100ng/ml作為檢測范圍的上限。對于檢測范圍的下限，通常選取功能靈敏度，本發明方法的功能靈敏度為0.5pg/ml,由此得出本發明HIV-1p24吖。定酯化學發光免疫分析方法檢驗的線性范圍是0.5pg/ml-100ng/ml,共6個數量級。3、標準曲線擬合將HIV-lp24重組抗原用分析緩沖液進行梯度稀釋，分別得到0，0.1pg/ml,0.2pg/ml，0.5pg/ml,1pg/ml,2pg/ml,5pg/ml，10pg/ml,20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml,200pg/ml，500pg/ml，lng/ml,2ng/ml,5ng/ml,lOng/ml,20ng/ml，50ng/ml,lOOng/ml等20個濃度的樣品，每個濃度4個復孔，每孔加入100nl，求每個濃度的光子數均值。反應所應用的吖啶酯標記抗體為1:1000倍稀釋。激發劑1和2均為多功能分析儀即時加樣，即時檢測。通過曲線擬合得到曲線，如圖2所示，得出擬合方程為四參數logistic曲線形式CPS/CPSmax為不同濃度p24抗原所對應的吖啶酯發光值與此次檢測中最高發光值之間的比值；四個參數<3、6分別為0.9953、0.04764，c為2,934，d為1.209，W為0.9990，具有非常好得統計學意義。HIV-1p24吖啶酯化學發光免疫分析方法的功能靈敏度為0.5pg/ml，比普通的ELISA方法低1-2個數量級；分析靈敏度為0.5pg/ml;線性范圍在0.5pg/ml-100ng/ml，比普通的ELISA方法高1-2個數量級。權利要求1.一種HIV-1p24抗原吖啶酯化學發光免疫分析檢測方法，具體步驟如下(1)用抗HIV-1p24抗體對固相載體進行包被；(2)處理HIV-1樣品；(3)將步驟(2)中處理后的HIV-1樣品和吖啶酯類化合物標記的抗HIV-1p24配對抗體加入步驟(1)中的反應體系進行免疫反應；(4)將激發劑1和激發劑2加入步驟(3)中的反應體系，進行化學發光反應；(5)檢測步驟(4)中化學發光反應產生的光子數，進行定性或/和定量分析。2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(l)中所述的固相載體為聚苯乙烯乳膠、聚苯乙烯塑料制品、聚氯乙烯塑料制品、脂質體或免疫磁性微珠。3、根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的HIV-1樣品選自血清、血漿、HIV-1細胞培養物裂解上清或HIV-lp24重組抗原的一種或多種。4、根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的HIV-1樣品包含的HIV-1型病毒為M亞群和0亞群的一種或任意組合。5、根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的M亞群中包括A、B、B'、C、D、E、F、G、H、I和J亞型。6、根據權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的激發劑1為過氧化氫和硝酸的混合液，其中過氧化氫的濃度為0.05-0.1M，硝酸的濃度為0.1-0.5M。7、根據權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的激發劑2為曲拉通100和氫氧化鈉的混合液，其中曲拉通100的濃度為0.1-0.5M，氬氧化鈉的質量分數為2-5%。8、根據權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(4)中加入激發劑1，0.5-1秒鐘后再加入激發劑2。全文摘要HIV-1p24抗原吖啶酯化學發光免疫分析檢測方法屬于臨床血液檢測分析方法
技術領域：
。現有HIV-1p24抗原檢測方法存在靈敏度不高且操作繁瑣等問題。本發明以吖啶酯類化合物標記抗HIV-1p24抗體，通過雙抗夾心的方法進行p24抗原抗體間的免疫結合；以激發劑過氧化氫、硝酸、曲拉通100和氫氧化鈉，激發吖啶酯類化合物進行化學發光反應；檢測光子數，進行定性或/和定量分析。本發明具有與普通的ELISA檢測方法具有很好的相關性，在P≤0.01情況下，相關系數為0.951；靈敏度高、檢測限為0.5pg/ml，檢測范圍廣、5-6個數量級；反應時間短，操作更為簡便等優點。文檔編號G01N21/76GK101281196SQ200810111678公開日2008年10月8日申請日期2008年5月16日優先權日2008年5月16日發明者娟馮,毅曾,鐘儒剛,馬雪梅申請人:北京工業大學