專利名稱：一種提高樣本分類準確性的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學技術領域。具體地說，本發明涉及一種提高樣本分類準確性的方法、 以及一種用于檢測樣本中YKL40和MASP2蛋白的試劑盒。
背景技術：
肝癌(HCC)是一種常見的且致命的惡性腫瘤。據統計，每年約新增500,000肝癌患者， 并且近500,000人死于該疾病(參見Parkin, D. M., Bray， F., Ferlay, J.， and Pisani, P. (2001) Estimating the world cancer burden: Globocan 2000. Int J Cancer 94, 153-156.)。現有的肝癌診斷 手段包括超聲波檢測和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein， AFP)檢測，兩者通常結合使用(參見 Spangenberg， H. C., Thimme， R., and Blum, H. E. (2006) Serum markers of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis 26， 385-390.)。當以甲胎蛋白為生物標志物通過ROC曲線進行肝 癌診斷時，其檢測陽性閾值通常為20ng/ml (參見陳季武、范培昌，快速檢測甲胎蛋白的免 疫層析試條的研制，《分析科學學報》，2002年第4期第273-276頁)。超聲和甲胎蛋白聯 合檢測的靈敏度和特異性分別是50-85%和70-90%，但它的假陽性和假陰性率高達40% (參 見Tu, D. G.， Wang, S. T., Chang, T. T.， Chiu， N. T., and Yao, W. J. (1999) The value of serum tissue polypeptide specific antigen in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Cancer 85, 1039-1043; Buscarini, L., Sbolli, G., Cavanna, L., Civardi, G., Di Stasi, M., Buscarini, E.， and Fornari, F. (1987) Clinical and diagnostic features of 67 cases of hepatocellular carcinoma. Oncology 44， 93-97.)。因此，人們迫切需要科技工作者開發出檢測更方便、靈敏度和特異性 更高、而且準確率高的肝癌診斷手段。
YKL-40是人類軟骨糖蛋白39(HcGP-39)(或稱為類幾丁質酶蛋白，chitinase 3-like 1)的 簡寫，又簡寫為CHI3L1、 YKL40。人們經研究發現，血清中YKL-40的水平與許多疾病狀況 比如在骨關節炎、原發性大腸癌、乳腺癌、復發的卵巢癌有關，因而可用于一些疾病的診斷、 預后評估、治療效果監測及病情發展監測。例如，可用于卵巢癌的診斷和預后(參見程明 剛，等。血清YKL-40在卵巢癌患者診斷和預后中的應用。《廣東醫學》2008年29巻2期第 255-256頁)。耶魯大學醫學院研究人員在2007年11月15日出版的《新英格蘭醫學期刊》 (The New England Journal of Medicine)上發表文章稱，臨床試驗結果表明該分子可能在決定
4嚴重哮喘病生理反應時發揮重要作用，與常人相比，哮喘病患者的YKL-40循環血清會更多，
同時也與哮喘的嚴重程度有關。(參見生物通網址
http:〃www.ebiotrade.com/newsf/2007-l 1/20071116165039.htm)。美國圣迭戈加州大學Johansen 等稱，YKL-40是獨立于癌胚抗原(CEA)和乳酸脫氫酶的生物標志物，普通人群血清YKL-40 水平高者，其胃腸道腫瘤患病風險增加2.7倍，且診斷為胃腸道腫瘤后預后欠佳(參見中國 醫學論壇報網絡版。網址http:〃www.cmt.com.cn/article/080221/a08022 lb0301.htm)。人們還 發現，血清YKL-40水平還可作為肝纖維化指標(參見Johansen, J. S., Christoffersen, P.， Moller, S., Price, P. A., Henriksen， J. H., Garbarsch, C.， and Bendtsen， F. (2000) Serum YKL-40 is increased in patients with hepatic fibrosis. Journal of hepatology 32, 911-920.)。然而，迄今未檢 索到關于YKL-40檢測應用于肝癌診斷的報道。
MASP2是甘露聚糖結合凝集素相關絲氨酸蛋白酶2 (mannan-binding lectin associated serineprotease-2)的縮寫，與人的免疫缺損病有關，在機體的固有性免疫防御中發揮重要作 用(參見蔡學敏，等。人甘露聚糖結合凝集素相關絲氨酸蛋白酶2N端片段的原核表達， 《免疫學雜志》，2007年03期第235-238頁)。其在肝癌診斷中的應用尚未有報道。
本發明人的研究表明，MASP2基因是一種在肝臟中特異表達的基因。經過大量的研究， 本發明人意外地發現這兩種蛋白都與肝癌癥狀有關，其中YKL-40在肝癌患者血清中的含量 明顯高于正常樣本，而MASP2在肝癌患者體內的表達量則低于正常樣本。于是，我們提出 一個假說將一種癌癥中高表達的蛋白(這個蛋白可以不是對某一癌癥特異，可以在不同的 癌癥中都高表達)和一個組織或器官特異表達蛋白在該組織或器官的低表達(由于癌癥造成 執行組織或器官特異功能的特異蛋白的下調)聯系起來，可以作為診斷癌癥的聯合生物標記 物，提高癌癥檢測的靈敏度和特異性。我們以YKL-40和MASP2這兩種蛋白為例，看它們可 否作為肝癌臨床應用的生物標志物、以及其聯合檢測可否提高疾病診斷和預后的準確性。
發明內容
基于上述發現，本發明的首要目的在于提供一種通過聯合檢測樣本中YKL40和MASP2 蛋白來提高樣本分類準確性的方法。
本發明的另一目的在于提供一種用于檢測樣本中YKL40和MASP2蛋白的試劑盒。
本發明的又一目的在于提供一種通過聯合檢測樣本中癌癥高表達蛋白和組織或器官特異 表達蛋白來提高樣本分析敏感度的方法。
本發明的再一目的在于提供一種用于檢測樣本中癌癥高表達蛋白和組織或器官特異表達 蛋白的試劑盒。為實現上述目的，本發明采用如下技術手段
一種提高樣本分類準確性的方法，其特征在于，聯合檢測樣本中的蛋白YKL-40和 MASP2。
上述聯合檢測包括
(1) 檢測樣本中YKL-40和MASP2的含量；
(2) 對測得的YKL-40和MASP2含量進行數學分析；以及
(3) 根據數學分析結果，對測定樣本進行分類。 一種上述方法在疾病包括癌癥的診斷、預后評估、治療效果監測及病程監測中的應用。 一種用于檢測樣本中YKL40和MASP2蛋白的試劑盒，其包含
(1 )能夠結合YKL40和MASP2的抗體；以及
(2)當YKL40禾口/或MASP2結合于(1)中限定的抗體時，能夠結合于YKL40和MASP2
的標記抗體。
一種提高個體癌癥檢測敏感度的方法，包括
(1) 測試個體樣本內癌癥高表達的蛋白含量；
(2) 測試個體樣本內特定組織或器官特異表達的蛋白含量；
G)對測得的樣本內癌癥高表達蛋白含量和組織或器官特異表達的蛋白含量進行數學分 析；以及
(4) 根據數學分析結果，將個體分為癌癥或健康。 一種用于檢測樣本中癌癥高表達蛋白和組織或器官特異表達蛋白的試劑盒，其包含
(1) 能夠結合癌癥高表達蛋白和組織或器官特異表達蛋白的抗體；以及
(2) 當癌癥高表達的蛋白和/或組織或器官特異表達蛋白結合于(1)中限定的抗體時， 能夠結合于癌癥高表達蛋白和組織或器官特異表達蛋白的標記抗體。
研究表明，采用本發明的方法及試劑盒對個體的樣本中蛋白YKL40和MASP2進行聯合 檢測，可以有效提高癌癥診斷的靈敏度、特異性和準確率，并且可以推廣至許多疾病的診斷、 預后評估、治療效果評估及病程監測。
圖1是對肝癌患者血清樣本進行YKL-40檢測的ROC曲線界面。 圖2是對肝癌患者血清樣本進行MASP2檢測的ROC曲線界面。 圖3是對肝癌患者血清樣本進行YKL40和MASP2聯合檢測的ROC曲線界面。
具體實施例方式
以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明 而不用于限定本發明的范圍。
眾所周知，當個體開始罹患癌癥、或處于癌癥臨床階段時，癌癥病毒或癌癥基因會高表 達，這種高表達的蛋白比如YKL-40可以作為癌癥的生物標志物；另一方面，該個體的有關 組織或器官功能會下降，致使在該組織或器官中特異表達的蛋白、比如在肝臟中特異表達的 MASP2的表達水平降低，因此組織或器官特異表達蛋白的低表達水平同樣具有用作癌癥生物 標志物的潛力。本領域技術人員熟知，單一生物標志物的測試有時會造成假陽性或假陰性的 增加，降低了測試的準確率。因此，同時測試個體樣本內癌癥高表達的蛋白比如YKL-40含 量和特定組織或器官特異表達的蛋白比如在肝臟中特異表達的MASP2低表達水平，即，在 原有的配對標記物的基礎上進一步增加新標記物以提高檢測敏感度，將會提高癌癥測試的敏 感度，這已在下述的實施例中得以驗證。
毫無疑問，本發明提高個體癌癥檢測敏感度的方法及相關試劑盒可以應用于各種癌癥和 器官病變的診斷、預后評估、治療效果評估及病程監測。
比如，以血液樣本的聯合檢測為例，針對某一特定組織或器官的癌癥或疾病的應用，其 包括如下步驟測定個體血液樣本中癌癥或疾病高表達的蛋白或基因；測定特定組織或器官 特異的蛋白或基因在血液中的低表達；對測得的蛋白含量或基因表達結果進行數學分析；以 及根據數學分析結果，對測定個體樣本進行分類，做出癌癥或疾病的診斷結果。這種結果可 分為健康、癌癥或疾病前期、癌癥或疾病中期、癌癥或疾病晚期等。
應理解，本說明書中術語"聯合檢測"的含義為不僅包括檢測樣本中特定蛋白的含量； 還可以包括對測得的蛋白含量進行數學分析；并且還可以進一步包括根據數學分析結果，對 測定樣本進行分類。
ELISA
本發明使用ELISA技術對個體的樣本進行癌癥高表達蛋白比如YKL40和組織或器官特 異表達蛋白比如MASP2的檢測。
酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)上分子生物學領域常 用的蛋白質含量分析方法，其可用于測定抗原，也可用于測定抗體。根據試劑的來源、樣本 的性狀以及檢測的具備條件，本發明可以采用多種不同類型，比如雙抗體夾心法、雙位點 一步法、間接法測抗體、競爭法、捕獲法測IgM抗體、以及應用親和素和生物素的ELISA等。試劑盒
本發明的ELISA優選使用試劑盒完成，這樣可以實現快捷操作，從而避免常規實驗檢測 的繁瑣。本發明的ELISA試劑盒包括YKL40的免疫酶標試劑盒、MASP2免疫酶標試劑盒、 YKL40和MASP2檢測試劑盒。為提高疾病診斷的靈敏度、特異性和準確率，優選使用YKL40 和MASP2檢測試劑盒，其可以分別或同時測得兩組檢測結果，以達到快捷功效。
本發明的YKL40和MASP2檢測試劑盒至少包含
(1) 能夠結合YKL40和MASP2的抗體；以及
(2) 當YKL40禾卩/或MASP2結合于(1)中限定的抗體時，能夠結合于YKL40和MASP2 的標記抗體。
上述試劑盒還可包含
(3) 由含有已知量YKL40和MASP2的溶液組成的標準樣，該標準樣可以來源于基因 工程菌表達、動物或人的體液；以及
(4) 用于檢測的抗體標記物，例如，作為報告方法的酶標簽比如辣根過氧化物酶，或者 熒光標記，其可以與抗體結合形成偶聯物。
更有選試劑盒還可進一步包括下屬物品中的至少之一(5)攜帶工具，其空間劃分為可 以收容一種或多種容器、96孔板或板條的限定空間，該容器例如是藥瓶、試管、和類似物， 每樣容器都含有一個單獨的用于本發明方法的組分；(6)輔助試劑，比如，顯色劑、酶抑制 劑、緩沖液、穩定劑、稀釋劑、洗滌試劑以及類似物；(7)說明書，其可以寫在瓶子、試管 和類似物上，或者寫在一張單獨的紙上，或者在容器的外部或內部；也可以是多媒體的形式， 比如CD、電腦光盤、錄像等等。
優選抗體可以固定于固相載體上，形成捕獲抗體。
所含抗體包括任何能夠結合YKL40和MASP2的抗體片段，并且可以是重組體、嵌合抗 體、人源化抗體和鼠源性抗體。所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，優選單克隆抗體。 優選抗體偶聯物能夠用ELISA閱讀機，比如，酶標儀進行光度測定。 樣本
本發明所用樣本可以包含多種形式，比如全血、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、或 眼淚。其中優選血清。
樣本制備可根據普通方法比如離心等進行，例如，參見如下文獻Young, D. S. & Bermes, E. W. "Specimen collection and processing" in Tietz Textbook of Clinical Chemistry 2nd Edition" Eds. Burtis, C. A. & Ashwood, E. R., Saunders (1994); Methods in Enzymology, H. Van Vunakisand J, J. Langone (Eds), 1981， 72(B); Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, P Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, R. J. Burden and P. H. Van Knippenberg (Eds), Elsevier, 1985; Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, T. Chard, ibid, 3rd Edition, 1987; Methods in Enzymology， H. Van Vunakis and J. J. Langone (Eds) 1981, 74(C)。 ROC曲線
在用ELISA檢測出樣本中癌癥高表達蛋白比如YKL40和組織或器官特異表達蛋白比如 MASP2的濃度后，可用數學分析方法對測得的樣本中癌癥高表達蛋白比如YKL40和組織或 器官特異表達蛋白比如MASP2濃度進行統計學處理，在此基礎上獲得具有樣本分類意義的 分級標準。這樣的數學方法優選由計算機完成，比如用這些數據繪制ROC曲線，從而對個體 的樣本進行分類。
ROC曲線全稱為受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve),又稱為接 收者操作特性曲線，主要用于臨床生化診斷試驗。ROC曲線是反映真陽性率(靈敏度，又稱 敏感性，sensitivity)和假陽性率(l-特異性，specificity)連續變量的綜合指標，是用構圖法 揭示靈敏度和特異性的相互關系。它通過設定一系列不同的的分界值(閾值或臨界值，cut-off value,是劃分診斷試驗結果正常與異常的界值)作為連續變量，從而計算出一系列靈敏度和 特異性，再以靈敏度為縱坐標、1-特異性為橫坐標繪制的曲線，曲線下面積(AUC)越大， 診斷準確性越高。在ROC曲線上，最靠近坐標圖左上方的點為靈敏度和特異性均較高的臨界 值。ROC曲線AUC值在1.0和0.5之間。在AUC〉0.5的情況下，AUC越接近于1，說明診 斷效果越好。AUC在0.5 0.7時有較低準確性，AUC在0.7 0.9時有一定準確性，AUC在 0.9以上時有較高準確性。
ROC曲線的評價方法與傳統的評價方法不同，根據實際情況，允許有中間狀態，可以把 試驗結果分為多個有序分類，比如正常、大致正常、可疑、大致異常和異常五個等級。
上述有序分類，對于疾病的診斷而言，可分為陰性、不確定、陽性。進一步地，對于
癌癥診斷而言，可分為癌癥、健康。
因此，以檢測樣本中蛋白YKL40和MASP2為例，本發明提高樣本分類準確性的方法， 可以包括如下步驟
(1 )分別測定樣本中蛋白YKL-40和MASP2的含量；
(2)以YKL40與MASP2蛋白含量的比值為變量，根據不同的閾值對癌癥診斷的靈敏 度和特異性繪制出ROC曲線，并計算曲線下面積AUC;以及(3)按照期望的靈敏度和特異性，對測定樣本進行分類(癌癥或健康)。 ROC曲線的繪制可以使用現有技術領域的軟件或系統，比如MedCalc 9.2.0.1醫學統計 軟件、SPSS 9.0、 ROCPOWER.SAS、 DESIGNROC.FOR、 MULTIREADER—POWER.SAS、 CREATE一ROC.SAS、 GB STAT VI0.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, MD, USA)等等。
肝癌的診斷、預后評估、治療效果監測或病程監測
本發明在醫學領域的具體應用，主要體現在肝癌的診斷、預后評估、治療效果監測或病 程監測方面，包括操作方法以及實現該方法的器具一試劑盒。眾所周知，肝炎的病程與肝癌 轉化密切相關，典型的病程為肝炎(比如乙肝、丙肝)—肝硬化4肝癌。本發明人的研究 發現，肝炎病毒的表達也可以作為肝癌檢測的生物標志，其與YKL40和MASP2的表達結合 起來，進行聯合檢測可以顯著提高肝癌診斷的成功率。因此，本發明還提供了一種用于肝癌 的診斷、預后評估、治療效果監測或病程監測的方法，其包括檢測個體血液樣本中肝炎病 毒的表達；檢測個體血液樣本中YKL40和MASP2的表達；對測得的肝炎病毒表達水平和 YKL40和MASP2的表達水平進行數學分析；以及根據數學分析結果，對測定血液樣本進行 分類，做出肝癌的判斷結果。這種結果可分為肝癌前期、肝癌中期、肝癌晚期等。
其中，肝炎病毒的表達可以采用本技術領域標準的方法進行，比如標準的血樣檢測試紙 法、血樣檢測試劑盒法，以及常規的血樣化驗方法，等等。
顯而易見，將血液樣本中肝炎病毒表達、YKL40和MASP2的表達整合在一個試劑盒中 檢測，將會帶來肝癌檢測的便利性、時效性、經濟性。因此，本發明還提供了一種用于肝癌
的診斷、預后評估、治療效果監測或病程監測的聯合測試試劑盒，其至少包含(1)能夠結
合肝炎病毒、YKL40和MASP2的抗體；以及(2)當肝炎病毒和/或YKL40禾Q/或MASP2結 合于(1)中限定的抗體時，能夠結合于肝炎病毒和域YKL40和MASP2的標記抗體。優選 試劑盒還包含(3)由含有已知量肝炎病毒、YKL40和MASP2的溶液組成的標準樣，該標 準樣可以來源于基因工程菌表達、動物或人的體液；以及(4)用于檢測的抗體標記物，例如， 作為報告方法的酶標簽比如辣根過氧化物酶，或者熒光標記，其可以與抗體結合形成偶聯物。 以下以個體的血清為樣本進行肝癌診斷為例，對本發明作進一步詳細說明。
實施例l
樣本的采集
在浙江大學醫學院一附院隨機采取25例50-60歲肝癌患者的血清1 mL;作為陽性對照， 另采取15例50-60歲健康志愿者的正常血樣1 mL，進行YKL40和MASP2濃度測試。
10測YKL-40含量
根據廠商的指導，使用Quidel公司(San Diego, CA,美國)的YKL-40試劑盒、并且使 用Bio-Rad 680型酶標儀(美國)進行ELISA操作，包括
1、 取出冷藏儲存的試劑盒，放置，恢復溫度至室溫(20-25 °C)。計算要檢測的標本總數 和質控數。每個標本需要一個抗原包被孔。每次實驗都要做陽性對照、陰性對照和校準品。 確定需要的微孔數量。當板條溫度至室溫時，打開板條的保護袋，拿出抗原包被的微孔板條。 本次實驗不需要使用的試劑條應放入這個可重新密封的袋子，密封，重新存放在2-8。C。
2、 依次在微孔板上加入20^L的標準液、對照液和血清樣本。此過程務必在三十分鐘內 完成。
3、 在每個微孔中加入100pL的捕獲液，用移液器在孔中反復吹打進行混勻。
4、 用微孔板蓋蓋好板，在室溫下(18-25。C)進行溫育55 — 65分鐘。
5、 按下述步驟手工洗板3次
A、 劇烈搖動并倒掉板中的液體；
B、 在孔中加滿洗液。保證孔中無殘余氣泡。
C、 再重復前兩步驟兩次。
D、 搖動并去除孔中的洗液。把板翻轉，在紙巾上輕拍，以便能拍干所有洗液。觀察微 孔板，確保無殘留的洗液。
6、 在酶標抗體復合物的瓶子里加入7mL的再生緩沖液，存放于室溫下待用。
7、 按照同樣的次序把稀釋好的酶復合物加100 pL到微孔板上
8、 用微孔板蓋蓋好板，在室溫下(18-28 。C)進行溫育55—65分鐘。
9、 配制底物，在底物緩沖液中加入一片底物固體，30-60分鐘后溶解，強烈搖晃，使溶 液完全混合。
10、 按照步驟5中A到D的方法進行洗板。
11、 以同樣的速度和次序把底物液加100pL到每孔中。
12、 微孔板在室溫下(18-28 。C)進行溫育55_65分鐘。
13、 以同樣的速度和次序在每個孔中加入100)aL的終止液。加了終止液后應輕輕敲打微 孔板，確保樣品全部混勻。
14、 設置酶標儀的檢測波長在405 rim處。檢測每個孔的OD值。應在加了終止液的15 鐘之內進行讀數。
15、 用一線性校準曲線"Y=mx+b"來分析YKL-40或MASP2的結果。16、通過標準曲線來讀出血清樣本和對照液中YKL-40或MASP2的濃度。 結果
經上述步驟，得到的檢測結果如表1所示。表l
_血淸中蛋白濃度(ng/mL)
樣品編號 診斷結果 YKL-40 MASP-2 YKL-40/MASP2的比值
782.2359.957.52
76.8250.230.70
705195.7360.25
1444.690.31599.78
165.3281.7558.67
98,7248.439.73
317.258.5542.22
354.181.6433.95
211.7167.2126.61
87.833.9259.00
734.4292.9250.73
184.4935.99.70
94.6206,445.83
313208.3150.26
137.3124,7110.10
475.3241.6196.73
66.5282.723.52
177.62244.5472.63
59.96426.6714.05
44.9680.2956.00
99.9630.0515.86
115.68215.5653.66
183.47339.7154.01
440.81106.86412.51
36.09244.0614.79
34.418518.59
21.517112.57
57.37247.91
54443.912.16
62.9356.217.66
47.5330.714.36
25.8699.93.69
43.8837.75.23
48.5470.510.31
16.7384.24.35
14.8739.42.00
39.6柳.48.44
11363.23.03
10.4330.13.15
265.8530.150.14
癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌癌康康康康康康康康康康康康康康康
11,肝F,肝F肝lf肝FP肝肝臥t肝肝肝ww^^健健健健健健健健健健健健健健健
012345678901
222222222233
4
3
7
3
13由表1可以看出，YKL-40的濃度與肝癌癥狀有密切的相關性，即，肝癌患者血清中 YKL-40蛋白的含量明顯高于健康志愿者血清中的含量。 ROC曲線繪制
使用GB STAT V10.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, MD USA)系統，以 YKL-40蛋白含量為變量，根據不同的閾值對癌癥診斷的靈敏度和特異性繪制出ROC曲線， 并計算曲線下面積AUC;繪制出ROC曲線并計算曲線下面積(AUC)，如圖l所示。
圖1顯示，ROC曲線的AUC為0.98。當YKL-40濃度的閾值為0.87 (ng/mL)時，診斷 肝癌的靈敏度為0.92 (即92%)， l-特異性為0.87 (即87%)，診斷肝癌的成功率為0.9 (即 90%)。
實施例2
測MASP2含量
采用與實施例1項類似的步驟，不同之處在于根據廠商的指導，使用荷蘭Hycult生物 技術公司(Uden，荷蘭)的MASP2試劑盒進行ELISA操作，檢測血清樣本中MASP2蛋白 的濃度。結果如表1所示。
由表1可以看出，MASP2的濃度也與肝癌癥狀有密切的相關性，即，肝癌患者血清中 MASP2蛋白的含量明顯低于健康志愿者血清中的含量。
ROC曲線繪制
使用GB STAT V10.0系統，以MASP2蛋白含量為變量，根據不同的閾值對癌癥診斷的 靈敏度和特異性繪制出ROC曲線，并計算曲線下面積(AUC)，如圖2所示。
圖2顯示，當MASP2濃度的閾值為292.9 ng/mL時，診斷肝癌的靈敏度為0.87， 1-特異 性為0.77，實際診斷肝癌的成功率為0.8。
實施例3
結合使用YKL40和MASP2,即，使用GB STATV10.0系統，以YKL40和MASP2蛋白
含量的比值為變量，根據不同的閾值對癌癥診斷的靈敏度和特異性繪制出ROC曲線，繪制出 ROC曲線并計算曲線下面積AUC，如圖3所示。
圖3顯示，當閾值為12.57 (比值)時，診斷的靈敏度為100%，實際診斷肝癌的成功率 為90%。大大高于目前常用的甲胎蛋白檢測成功率(基本為70%)。
另夕卜，通過圖3與圖1和2的比較可以看出，當閾值為12.57時，聯合檢測YKL40和 MASP2時的肝癌診斷的靈敏度高于使用任何一種單一標記物(結合使用時的靈敏度為1，使 用單一 YKL40或MASP2時靈敏度分別為0.92和0.87)，實際診斷肝癌的成功率為0.9。雖然以上以各自獨立的YKL40或MASP2試劑盒進行ELISA操作，以肝癌診斷為例，繪 制出聯合檢測YKL40和MASP2的ROC曲線，對本發明的技術方案進行了闡述，但是根據 本發明的公開，本發明的方法毫無疑問可以推廣至其他一些疾病的診斷、預后評估、治療效 果監測及病情發展監測，這對于本領域的技術人員來說是顯而易見的。因此，在不違背本發 明的思想下，本領域技術人員可以在此基礎上對本發明作出的各種改動或者修改，同樣應屬 于本發明的范圍。
權利要求
1.一種提高樣本分類準確性的方法，其特征在于，聯合檢測樣本中的蛋白YKL-40和MASP2。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述聯合檢測包括(1) 檢測樣本中YKL-40和MASP2的含量；(2) 對測得的YKL-40和MASP2含量進行數學分析；以及(3) 根據數學分析結果，對測定樣本進行分類。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述YKL-40和MASP2的含量分別測定。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述數學分析為繪制ROC曲線，其中以YKL40 與MASP2蛋白含量的比值為變量，根據不同的閾值繪制出ROC曲線，并計算曲線下面積 AUC;并且按照期望的靈敏度和特異性，對測定樣本進行分類。
5. 如權利要求1~4中任一項所述的方法，其特征在于，所述YKL-40和MASP2中的至 少一個的含量使用ELISA技術完成。
6. 如權利要求1 4中任一項所述的方法，其特征在于，所述樣本選自于由全血、血漿、 血清、尿液、腦脊液、唾液、和眼淚所構成的組。
7. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，用于癌癥的診斷、預后評估、治療效果監測 及病程監測。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述癌癥是肝癌。
9. 一種用于實施如權利要求1~8中任一項所述方法的試劑盒，其包含(1) 能夠結合YKL40和MASP2的抗體；以及(2) 當YKL40禾Q/或MASP2結合于(1)中限定的抗體時，能夠結合于YKL40和MASP2 的標記抗體。
10. 如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，還包含(3) 由含有己知量YKL40和MASP2的溶液組成的標準樣；以及(4) 用于檢測的抗體標記物，其可以與抗體結合形成偶聯物。
11. 一種對個體特定組織或器官的癌癥或疾病進行診斷、預后評估、治療效果監測或病 程監測的方法，其包括(1) 測定個體血液樣本中癌癥或疾病高表達的蛋白或基因；(2) 測定特定組織或器官特異的蛋白或基因在血液中的低表達；(3) 對測得的蛋白含量或基因表達結果進行數學分析；以及(4) 根據數學分析結果，對測定個體樣本進行分類，做出癌癥或疾病的診斷結果。
12. —種用于肝癌的診斷、預后評估、治療效果監測或病程監測的方法，其包括(1) 檢測個體血液樣本中肝炎病毒的表達；(2) 檢測個體血液樣本中YKL40和MASP2的表達；(3) 對測得的肝炎病毒表達水平和YKL40和MASP2的表達水平進行數學分析；以及(4) 根據數學分析結果，對測定血液樣本進行分類，做出肝癌的判斷結果。
13. —種用于實施如權利要求12所述方法的試劑盒，其包含(1) 能夠結合肝炎病毒、YKL40和MASP2的抗體；以及(2) 當肝炎病毒和/或YKL40和/或MASP2結合于(1)中限定的抗體時，能夠結合于 肝炎病毒和/或YKL40和MASP2的標記抗體。
全文摘要
本發明公開了一種通過聯合檢測樣本中YKL40和MASP2蛋白來提高樣本分類準確性的方法，其包括測定樣本中YKL-40和MASP2的含量；以YKL40和MASP2蛋白含量的比值為變量，根據不同的閾值對癌癥診斷的靈敏度和特異性繪制出ROC曲線，并計算曲線下面積AUC；按照AUC值、靈敏度和特異性將樣本進行分類。本發明還公開了一種用于檢測樣本中YKL40和MASP2的試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK101587125SQ200810108528
公開日2009年11月25日 申請日期2008年5月21日 優先權日2008年5月21日
發明者林標揚 申請人:林標揚