tau蛋白的制作方法

專利名稱：：tau蛋白的制作方法tau蛋白本申請是分案申請，母案的申請?zhí)枮?2805313.3(國際申請?zhí)朠CT/EP02/00897)，申請日為2002年01月29日，發(fā)明名稱為"tau蛋白"。本發(fā)明涉及阿爾茨海默病(Alzheimer，sdisease)和其它tauo病(tauopathies)。阿爾茨海默病(AD)是最常見的慢性神經(jīng)變性疾病，其在臨床上的特征在于進(jìn)行性和不可逆的認(rèn)知和行為功能喪失。這種疾病可能持續(xù)10年以上，從輕度癥狀開始到極其嚴(yán)重的表現(xiàn)。AD危害了約10%的65歲以上人群和20°/。的80歲以上人群。隨著西方社會的不斷增長，患病人數(shù)正在上升僅在美國就已經(jīng)有500萬患者，且截至到2000年年底，世界上大約有1800萬人患癡呆。在他們中，認(rèn)為有大約三分之二的病例、即1200萬人將成為阿爾茨海默病。它是心臟病、癌癥和中風(fēng)之后的西方世界中的第四大殺手?；及V呆的人的數(shù)量正在快速增加。到2025年，在發(fā)達(dá)國家患癡呆的人的數(shù)量將會為1980年的2倍。護理這些患者的社會成本是巨大的。例如，據(jù)估計美國社會用于診斷和控制AD、主要是用于監(jiān)護的成本目前每年在800億美元。目前，既沒有AD癥狀發(fā)生前的診斷試驗、也不能治愈AD。因此，在臨床上是在癥狀發(fā)生而基本上排除其它形式的癡呆后才能診斷該病。巴伐利亞精神病學(xué)家AloisAlzheimer在93年前的1907年觀察到的AD大腦中的傳統(tǒng)指征老年(神經(jīng)炎)斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)的累積仍然保留為AD的神經(jīng)病理學(xué)特征。胞內(nèi)神經(jīng)原纖維結(jié)構(gòu)(神經(jīng)原纖維纏結(jié)、營養(yǎng)不良性軸突和神經(jīng)纖維網(wǎng)絲)的常見共同特征在于成對螺旋纖絲(PHFs)。PHFs的主要蛋白亞單位是異常高磷酸化形式的微管結(jié)合蛋白tau(Grundke-Iqbal等:1986;Wischik等，1988a，b)。帶有神經(jīng)原纖維改變的神經(jīng)元變性，且這種變性的程度直接與受侵害個體的癡呆程度有關(guān)(Blessed等，1968)。正常tau是主要分布至軸突的微管結(jié)合蛋白。tau蛋白參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元且可能是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞體中的微管(MT)裝配、空間結(jié)構(gòu)和特性(Drewes等，1998;Drubin和Kirschner,1986;LoPresti等，1995)。tau蛋白由位于第17染色體上的單一基因編碼，且在來自成人大腦的組織提取物中以多同種型(isoform)被檢測到(Goedert等，1989;HimmlerA.,1989;Kosik等，1989)。tau蛋白的異質(zhì)性部分是由于可選剪接所導(dǎo)致的，從而在成人大腦中產(chǎn)生6個同種型。這些不同的同種型的區(qū)別在于在氨基末端區(qū)上存在或不存在29-或58-氨基酸插入片段，以及在稱作微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域的tau羧基末端區(qū)上添加或缺失了銜接重復(fù)(可以重復(fù)3或4次)。該區(qū)由不完全重復(fù)的31或32個氨基酸殘基組成。在人體中，最小的tau同種型在MT結(jié)合結(jié)構(gòu)域上含有帶有三個銜接重復(fù)的352個氨基酸殘基且不含氨基末端插入片段，而最長同種型含有441個殘基，帶4個重復(fù)片段和兩氨基末端插入片段。為簡便起見，在本專利申請中所有的編號均指的是含有Goedert等(1989)的全部插入片段(441個氨基酸長)的最長人tau蛋白同種型htau40。已知許多神經(jīng)疾病帶有含微管結(jié)合蛋白tau的絲狀細(xì)胞包涵體，這些神經(jīng)疾病例如有阿爾茨海默病(AD)、進(jìn)行性核上麻瘠(PSP)、皮質(zhì)基底(corticobasal)的變性(CBD)、皮克病(Pick，sdisease)(PiD)和共同稱作帶有與第17染色體相關(guān)的帕金森綜合征的額顳癡呆的一組相關(guān)疾病(FTDP-17)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、克羅伊茨費爾特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakobdisease)(CJD)、拳擊性癡呆(dementiapugilistica)(DP)、格-施-沙病(Gerstmann-Straussler-Scheinkerdisease)(GSSD)、雷維小體病和亨廷頓舞蹈病(Huntingtondisease)(Dickinson等，1998;DiFiglia等，1997;Forno，1986;Hirano和Zimmerman,1962;Nishimura等，1995;Prusiner1996;Reed等，1998;Roberts,1998;Schmidt等，1996;Shankar等，1989;Spillantini等，1998)。盡管這些疾病中包含的病因?qū)W、臨床癥狀、病理學(xué)發(fā)現(xiàn)和生化組成不同，但是出現(xiàn)的證據(jù)提示涉及正常細(xì)胞蛋白聚集成各種絲狀包涵體的機制相差無幾。認(rèn)為啟動生成用于纖絲裝配的核心或種子的微管結(jié)合蛋白tau的最初構(gòu)象改變是關(guān)鍵特征。該過程可以受到正常蛋白質(zhì)的翻譯后修飾、某些基因的突變或缺失和結(jié)合正常蛋白質(zhì)且由此改變其構(gòu)象的因素的影響。tau蛋白是極為親水性的?？梢砸子趶拇竽X組織或培養(yǎng)細(xì)胞中提取它。比較而言，提取自阿爾茨海默病態(tài)大腦組織的絲狀tau是相對不溶性的。不溶性和正?？扇苄缘膖au在翻譯后修飾的程度不同，除磷酸化外，還包括糖基化、糖化、遍在蛋白化和外消旋化(Kenessey等，1995;Ko等，1999;Mori等，1987;Wang等，1996;Yan等，1994)。尚不了解修飾tau蛋白以參與AD中纖絲形成的機制。tau是已知的最可溶性蛋白之一(Cleveland1977a，b;Lee等1988)，且由此AD中它的聚集特別令人費解。tau的磷酸化影響了tau形成聚集物的可能性，從而產(chǎn)生了刺激或抑制作用，推斷這取決于磷酸化位點(Crowther等，1994;Schneider等，1999)。許多體外研究證明在有還原劑二硫蘇糖醇(DTT)、不飽和游離脂肪酸類、RNA或糖胺聚糖類存在的情況下，正常tau可以被轉(zhuǎn)化成纖絲(Goedert等，1996;K卿ers等，1996;Perez等，1996;Wilson和Binder,1997)。此外，通過Cys322上氧化生成的交聯(lián)tau的存在也可以加速^f絲形成過程(Schweers等，1995)。不同纖絲裝配研究中不同的參數(shù)已經(jīng)包括了tau蛋白濃度、pH，而溫育的離子強度高于生理條件下存在于胞質(zhì)中的離子強度許多倍。掃描透射電鏡(STEM)對體外形成的tau纖絲進(jìn)行的檢驗顯示這些纖絲不同于天然成對螺旋纖絲(Ksiezak-Reding,1998)。在沒有聚糖或RNA存在的情況下，在含有未磷酸化或磷酸化野生型tau、正常tau的樣品中沒有可檢測到的PHF-樣纖絲。對化學(xué)交聯(lián)的肝素處理的tau的研究表明肝素處理誘導(dǎo)tau蛋白中的構(gòu)象改變(Paudel和Li，1999)。與體外數(shù)據(jù)共同提示(a)微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)au纖絲裝配而言是重要的;和(b)tau纖絲的形成要求tau的構(gòu)象改變。這些研究同時表明所述的tau修飾中沒有一種能夠單獨誘導(dǎo)與阿爾茨海默病的臨床表現(xiàn)相關(guān)的絲狀tau形成。對引起導(dǎo)致疾病情況中纖絲形成的tau改變而言重要的因素的確定和描述對開發(fā)癥狀發(fā)生前的診斷標(biāo)記和干預(yù)tauo病進(jìn)展的治療劑而言是重要的。因此本發(fā)明的一個目的是提供用于阿爾茨海默病或其它tauo病中的早期治療干預(yù)的可靠藥物靶物。此外，希望提供能夠特異性檢測該藥物靶物并與之發(fā)生相互作用的特異性單克隆抗體。這種抗體不僅應(yīng)適合于在癥狀發(fā)生前檢測所述分子、而且也應(yīng)適合于抑制和消除該分子，由此適合于阿爾茨海默病或其它tauo病的癥狀發(fā)生前的診斷、治療和預(yù)防。使用本發(fā)明實現(xiàn)了這些目的，而本發(fā)明在一個方面中涉及對構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常形式具有特異性的抗體，所述的抗體對正常tau蛋白而言是非特異性的。這類tau蛋白的異常形式代表一族新的分子，它們是在構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的位于神經(jīng)元內(nèi)和神經(jīng)元外的可溶和不溶性的、優(yōu)選異常截短的形式(Novak等，1991,1993)。使用本發(fā)明可以證實這些構(gòu)象不同形式的在本說明書中稱作"tauons"的tau蛋白是種子、即與阿爾茨海默病臨床表現(xiàn)相關(guān)的絲狀tau形成的自我繁殖過程中的成核中心，由此tauons是阿爾茨海默病的重要治療靶物。本發(fā)明的tauons可以是異常截短的tau蛋白。使用本發(fā)明的抗體可以在體外和神經(jīng)元內(nèi)抑制tauons的生物活性。這些抗體具有在AD癥狀發(fā)生前的I、II和III期中對存在的tauons進(jìn)行染色的能力，從而使它們適合于該病的癥狀發(fā)生前的診斷。對本發(fā)明的抗體而言，關(guān)鍵是僅不同構(gòu)象形式的tau蛋白(即"tauon")由這種抗體識別，而正常的tau蛋白不與本發(fā)明的抗體結(jié)合。在本發(fā)明的過程中，將微管結(jié)合蛋白tau的AD截短形式純化至同質(zhì)且證實是來自阿爾茨海默病態(tài)神經(jīng)元的絲狀tau分離物的主要部分。氨基酸序列數(shù)據(jù)顯示tauons的主鏈與蛋白質(zhì)tau的主鏈沒有區(qū)別，而tauons在免疫學(xué)上區(qū)別于正常人tau的方面可能在于本發(fā)明構(gòu)象特異性單克隆抗體所揭示的不同構(gòu)象。這類抗體的具體實例是由在2000年8月22日保藏在歐洲動物細(xì)胞保藏中心(ECACC)、保藏號為00082216的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體DC-ll和在2000年8月22日保藏在ECACC、保藏號為00082215的雜交瘤細(xì)胞系DC-ll/I產(chǎn)生的單克隆抗體DC-11/I。由本發(fā)明提供的該族單克隆抗體通過識別tauon-特定構(gòu)象而不識別正常人可溶性tau來確定。與正常人tau相比不同的構(gòu)象在病理學(xué)上是由迄今為止來自阿爾茨海默病患者測試樣品中tau分子N-末端或C-末端或兩末端上的異常截短所導(dǎo)致的。令人關(guān)注的是不同構(gòu)象與tau同種型和磷酸化水平無關(guān)。這種使tauons獲得典型構(gòu)象的不可缺少的病理學(xué)要求是存在大量脯氨酸和微管結(jié)合結(jié)構(gòu)域和截短側(cè)翼區(qū)。此外，tauons區(qū)別于正常人tau的方面可能在于其病理活性，即tauons代表啟動tau聚集和由正常tau和微管蛋白裝配的tauons解裝配微管的種子、即成核中心。與本發(fā)明抗體、尤其是DC-11族單克隆抗體一起預(yù)保溫的tauons沒有表現(xiàn)出解裝配的能力或由正常tau和微管蛋白裝配微管。此外，tauons在對分化的人神經(jīng)元微注射時明顯導(dǎo)致由微管結(jié)合的tau部分取代內(nèi)源性tau、神經(jīng)元收縮并使細(xì)胞變性。如果將tauons與本發(fā)明的單克隆抗體一起微注射，那么在分化的神經(jīng)元中沒有觀察到神經(jīng)變性改變。這一結(jié)果表明本發(fā)明的抗體、尤其是DC-11單克隆抗體抑制神經(jīng)元內(nèi)tauons活性，且由此可以用作胞內(nèi)藥物(例如用作胞內(nèi)治療抗體、即內(nèi)體(intrabodies))。在免疫組織學(xué)方面，正如使用本發(fā)明抗體所觀察到的，tauons已經(jīng)在AD的transenthorinal和enthorinal區(qū)中的前-a-神經(jīng)元內(nèi)的癥狀發(fā)生前I、II和III期出現(xiàn)，因此，在適當(dāng)偶聯(lián)示蹤物后，可以將本發(fā)明的抗體用于活體的AD癥狀發(fā)生前的診斷。優(yōu)選本發(fā)明的抗體與抗體DC-ll相比表現(xiàn)出對tau的構(gòu)象不同形式("tauon")至少50%、優(yōu)選至少90%的特異性?？梢酝ㄟ^任意用于檢測抗體特異性的標(biāo)準(zhǔn)試驗檢測特異性，例如ELISA試驗、放射性免疫測定、使用懸臂連接的結(jié)合配偶體的原子力顯微術(shù)等。一般來說，與構(gòu)象不同的tau蛋白、尤其是其異常截短形式發(fā)生特異性反應(yīng)而不與正?？扇苄詔au反應(yīng)的所有抗體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。8優(yōu)選地，認(rèn)為本發(fā)明的抗體與分子發(fā)生〃特異性反應(yīng)〃，條件是它能夠與分子結(jié)合而由此使該分子與所述抗體偶聯(lián)。術(shù)語〃表位〃指的是可以由抗體識別和結(jié)合的抗原部分?？乖梢詭в幸粋€或一個以上的表位。〃抗原〃能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生能夠結(jié)合該抗原表位的抗體。上述所指的特異性反應(yīng)指的是該抗原可以以高度選擇性方式與其相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，而不與由其它抗原產(chǎn)生的眾多其它抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。本發(fā)明特別優(yōu)選的抗體來源于保藏的雜交瘤細(xì)胞系DC-ll(ECACC保藏號00082216)和DC-11/1(ECACC保藏號00082215)，它們表現(xiàn)出高度特異性和選擇性，且與tau的構(gòu)象不同形式(〃tauon〃)反應(yīng)而不與正常的可溶性tau反應(yīng)?？梢酝ㄟ^任意用于檢測抗體特異性的標(biāo)準(zhǔn)試驗檢測特異性，例如ELISA試驗、放射性免疫測定等。本文所用的〃抗體〃用以指包括完整分子及其片段及其合成和生物衍生物，諸如例如不含F(xiàn)ab、F(ab')2和FY片段，游離或例如在pill或pVIII或其它表面蛋白上的絲狀噬菌體表面或細(xì)菌表面上表達(dá)，其能夠結(jié)合抗原。Fab、F(ab')2和Fv片段缺乏完整抗體的F。片段、從循環(huán)中更為快速地清除，且可以具有較低的非特異性抗體組織結(jié)合能力。此外，易于改造Fy抗體(通常稱作小抗體(minibody))以在其C-末端上攜帶特異性示蹤物，并用于AD的活體早期癥狀發(fā)生前診斷，這是因為由本發(fā)明抗體識別的AD的I、II和III期與智力下降無關(guān)。在本發(fā)明中，優(yōu)選單克隆抗體或單克隆抗體片段。因此，本發(fā)明在另一個方面中還涉及產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本申請中所用的術(shù)語〃tau〃指的是如M.Goedert等1989所述的含有全部可選的剪接插入片段的人微管結(jié)合蛋白tau的最長同種型。按照本申請的另一個方面，本發(fā)明涉及屬于tau蛋白的構(gòu)象不同形式的tau蛋白的異常截短形式，所述的tau蛋白的構(gòu)象不同形式可由本發(fā)明的抗體特異性識別。因此，本發(fā)明涉及一族新的位于神經(jīng)元內(nèi)和神經(jīng)元外的可溶和不溶性異常截短形式的tau蛋白，它們在構(gòu)象上不同于正常的tau且稱作"tauons"?！╰auons〃由此是可以由本發(fā)明所述抗體特異性識別的tau蛋白的構(gòu)象不同形式。用于本發(fā)明的tauons包括SEQIDNo.1的序列，且可以進(jìn)一步側(cè)翼接有其它氨基酸(參見SEQIDNo.2、3)。tauons適宜在約100-400個氨基酸范圍內(nèi)，且在該范圍內(nèi)代表tau蛋白的截短形式。本發(fā)明的tauons可以在N-或C-末端或兩末端被異常截短(參見附圖2-13)。本文所用的術(shù)語〃異常截短的〃指的是用本發(fā)明提供的tauon特異性單克隆抗體在患病的AD神經(jīng)元中鑒定的tau肽("tauons"?？梢酝ㄟ^使用許多任意眾所周知的合成重組技術(shù)來制備人tau蛋白的異常截短形式tauons.簡單地說，在本領(lǐng)域中廣泛實施了用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞、構(gòu)建載體、提取信使RNA、制備cDNA文庫的大部分技術(shù)，且大部分本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知描述具體條件和步驟的標(biāo)準(zhǔn)來源資料。然而，為方便起見，將下面的段落用作指導(dǎo)原則。用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的最常用原核生物系統(tǒng)為大腸桿菌(E.coli)，然而，也可以使用其它微生物菌抹，諸如芽孢桿菌屬(Bacilli),例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis);假單胞菌屬(Pseudomonas)的不同種類；或其它細(xì)菌菌抹。在這類原核系統(tǒng)中，使用了含有來源于與宿主相容的種類的復(fù)制位點和控制序列的質(zhì)粒載體。常用的原核控制序列包括用于轉(zhuǎn)錄起始的啟動子，可選的操縱子以及核糖體結(jié)合位點序列。目前各種真核宿主也用于產(chǎn)生重組外源蛋白質(zhì)。當(dāng)在細(xì)菌中時，可以用直接產(chǎn)生所需蛋白的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化真核宿主，但更常見的情況是提供信號序列來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分泌。真核系統(tǒng)具有另外的優(yōu)點，即它們能夠加工可以在編碼高級生物體蛋白質(zhì)的基因組序列中出現(xiàn)的內(nèi)含子。真核系統(tǒng)還提供了各種加工機制，這些機制例如使某些氨基酸殘基糖基化、氧化或發(fā)生衍生作用、構(gòu)象控制等。常用的真核系統(tǒng)包括酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞和高級植物細(xì)胞。所列實例并未窮盡。合適的啟動子是可得到的，它們對用于這些宿主類型中的每一種而言是相容性和可搡作的，且是終止序列和增強子，諸如例如桿狀病毒多角體啟動子。如上所述，啟動子可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。例如，在哺乳動物系統(tǒng)中，可以通過添加重金屬離子來誘導(dǎo)MTII啟動子。用于構(gòu)建適合于所需宿主的表達(dá)系統(tǒng)的具體實例對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。為了所述蛋白質(zhì)的重組生產(chǎn)，將編碼它的DNA適當(dāng)連入所選擇的表達(dá)系統(tǒng)，然后將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)入相容的宿主細(xì)胞，隨后在發(fā)生外源基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)和維持該細(xì)胞。通過裂解該細(xì)胞或從培養(yǎng)基中回收這種方式產(chǎn)生的本發(fā)明tauons,這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的?？梢酝ㄟ^首先用連接混合物轉(zhuǎn)化適宜的宿主來證實用于質(zhì)粒構(gòu)建的正確連接。正如本領(lǐng)域中可理解的，用氨芐青霉素、四環(huán)素或其它抗生素抗性或使用其它標(biāo)記來篩選成功的轉(zhuǎn)化體，這取決于質(zhì)粒的構(gòu)建方式。本發(fā)明由此涉及tauons制品、尤其是基本上不含其它蛋白的來白人或重組來源的tauons制品、尤其是來自正常tau蛋白的tauons制品?？梢酝ㄟ^一定方法來提供這類制品，所述的方法包括使用本發(fā)明抗體進(jìn)行免疫親和的步驟。優(yōu)選本發(fā)明的制品在總蛋白中含有80%以上的ta讓s、尤其是95%以上的tauons。此外，本發(fā)明還涉及用于檢測阿爾茨海默病腦組織樣品或體液樣品中構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式tauons的試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明的抗體和用于裝載所迷探針的適宜容器。能夠在試劑盒中提供所述抗體以用于檢測或分離tauons。借助于本發(fā)明抗體可以檢觀Jtauon蛋白，并從包括transenthoriiml、enthorinal區(qū)和海馬的阿爾茨海默病態(tài)神經(jīng)元在內(nèi)的各種來源中分離它?？梢詫凑者@種方式分離的tauons進(jìn)一步用作例如對小鼠進(jìn)行免疫接種的免疫原，以便構(gòu)建產(chǎn)生針對tauons而不識別正常全長tau的特異性單克隆抗體的雜交瘤。該方法包括下列步驟筌定來自阿爾茨海默病態(tài)腦組織transenthorinal、enthorinal和海馬區(qū)的神經(jīng)元并使其釋放入防止tauons異常構(gòu)象的溶液中。在制備和純化后，將tauons用作免疫原，每隔一個月經(jīng)皮下注入小鼠。將來自這些動物的脾臟用于構(gòu)建產(chǎn)生針對tauons的單克隆抗體的雜交瘤。使用首先由K(ihler和Milstein介紹的充分建立的雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)這些雜交瘤(參見M.K6hler和C.Milstein,"分泌預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)"("ContinuousCulturesofFusedCellsSecretingAntibodyofPre-DefinedSpecificity〃)，《自然》(Nature)，256，pp.495-497,1975)。在足夠長時間的免疫接種后，從動物的脾臟、淋巴結(jié)或外周血液中得到產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞.優(yōu)選這些淋巴細(xì)胞獲自脾臟。然后通常在有諸如聚乙二醇(PEG)這樣的融合劑存在的情況下使脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合。按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以將任意數(shù)量的骨髓瘤細(xì)胞系用作融合配偶體；例如P3-NS1/1-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653骨髓瘤細(xì)胞系。隨后使包含所需雜交瘤的所得細(xì)胞生長在諸如HAT培養(yǎng)基這樣的選擇培養(yǎng)基中，其中未融合的親本骨髓瘤或淋巴細(xì)胞最終死亡。僅雜交瘤細(xì)胞存活，且可以在限制條件下生長至得到分離的克隆。例如，通過使用已經(jīng)用于免疫接種的抗原的免疫測定技術(shù)篩選雜交瘤上清液中存在的具有所需特異性的抗體。然后在有限稀釋條件下或在軟瓊脂上亞克隆陽性克隆，且可以分離產(chǎn)生的單克隆抗體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中所公知的技術(shù)使按照這些方法生產(chǎn)的雜交瘤在體外或體內(nèi)增殖(腹水中)。用于純化(purfying)單克隆抗體的常用方法包括硫酸銨沉淀、離子交換、層析法和親和層析法(例如，參見H.Zola等，"用于單克隆抗體產(chǎn)生和性質(zhì)鑒定的技術(shù)"("TechniquesfortheProductionandCharacterizationofMonoclonalAntibodies")-《單克隆雜交瘤抗體技術(shù)與應(yīng)用》(MonoclonalHybridomaAntibodies:TechniquesandApplications),J.G.R.Hurell(編輯),pp.51-52(CRCPress1982"。優(yōu)選本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步含有用于檢測所述抗體與所迷構(gòu)象不同的tau蛋白之間結(jié)合情況的工具。優(yōu)選次級抗體、尤其是特異性標(biāo)記的次級抗體。此外，在本發(fā)明范圍內(nèi)可以使用磁珠技術(shù)以及應(yīng)用抗體的其它蛋白質(zhì)鑒定方法。該方法包括在來自人的測試樣品中筌定異常截短的tau蛋白tauon的步驟。本文所用的〃測試樣品〃指的是來自懷疑含有tauons的人的生物樣品。測試樣品可以包括含異常截短的tau蛋白的腦組織，諸如海馬組織或額皮質(zhì)組織；或所述的測試樣品可以包括腦脊液(CSF)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的測試樣品包括CSF,且所鑒定的蛋白是CSF-tauon。異常截短的tau蛋白tauons的鑒定適宜包括鑒定測試樣品中的抗原的步驟，該抗原能夠結(jié)合與異常截短的tau蛋白tauons發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體，其中所述的tauons包含序列(SEQIDNo.1)，且側(cè)翼接有氨基酸以使得所述的tauons的長度在約100-400個氨基酸的范圍，且特征在于不同于正?？扇苄缘鞍譼au的tauon的特異構(gòu)象；或該抗原能夠結(jié)合與異常截短的tau蛋白tauons發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體，其中所述的tauons包含序列(SEQIDNo.1),且側(cè)翼接有氨基酸以使得所述的tauons的長度在約100-400個氨基酸的范圍，且特征在于不同于正?？扇苄缘鞍譼au的tauon特異構(gòu)象。tauon的存在表明與AD患者和其它患tauo病(tauopathies)的患者體內(nèi)tauons的累積有關(guān)的疾病.本發(fā)明的另一個方面涉及患者體液中構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式的檢測方法，該方法包括下列步驟將所述體液與本發(fā)明的抗體混合、檢測所述抗體與構(gòu)象不同的tau蛋白(tauon)之間存在的結(jié)合情況，且可選地測定與所述抗體結(jié)合的構(gòu)象不同的tau蛋白的量。tauon的存在表明包括AD和其它tauo病(tauopathies)在內(nèi)的疾病的人體內(nèi)tauons的累積有關(guān)的疾病。患者的體液可以是來自懷疑含有tauons的人的任意生物測試樣品。這種體液可以包括腦組織，諸如海馬組織或額組織或皮質(zhì)組織或腦脊液(CSF)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的體液包括CSF且所筌定的蛋白質(zhì)是CSF-tauons。正如本領(lǐng)域中可以理解的，可以通過生化或細(xì)胞化學(xué)方法或通過諸如許多免疫測定生產(chǎn)商的手冊中所迷的酶免疫測定法便利地完成這種對tauons的鑒定。當(dāng)使用生化方法時，優(yōu)選使用0.01-10g、尤其是0.5-1g的含有患病tau蛋白的組織；使其在凝膠上遷移并通過Western印記來鑒定。認(rèn)為這類技術(shù)確實適于在沒有已經(jīng)證實不與本發(fā)明抗體反應(yīng)的年齡匹配的對照組的情況下進(jìn)行。細(xì)胞化學(xué)方法染色已經(jīng)證實與正常組織無反應(yīng)性。通過ELISA檢測來自患AD的患者和患非-AD神經(jīng)性疾病以及正常受試者的CSF以便對tauons的水平進(jìn)行定量。與患非AD神經(jīng)性疾病的患者和對照組相比，AD患者體內(nèi)的CSFtauon水平顯著增加。在AD中，發(fā)現(xiàn)這種顯著增加與發(fā)作的年齡、載脂蛋白E基因型和臨床階段無關(guān)。對ADCSF蛋白的Western印記顯示了幾種具有與異常截短的tau蛋白一致的50-15kD的表觀分子量免疫反應(yīng)帶。這些結(jié)果表明CSF-tauons反映出由AD進(jìn)展導(dǎo)致的患病tau漸進(jìn)累積。本發(fā)明的抗體在另一個方面中可以用于制備治療阿爾茨海默病患者的藥物。可以將該抗體以生物技術(shù)方式修飾成裝配有耙向序列的單鏈分子，其能夠?qū)⑺龅姆肿愚D(zhuǎn)運入表達(dá)tauons的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞。在本AD細(xì)胞模型內(nèi)，抗體結(jié)合tauons并干擾其病理作用(正常tau的結(jié)合)，且增加tau蛋白的異常截短形式的降解。使用異常截短的tau蛋白及其與阿爾茨海默病嚴(yán)重程度的相關(guān)性進(jìn)行的體外試驗(tau蛋白結(jié)合、纖絲裝配、微管解裝配)證實它們是重要的藥物把物。通過下列實施例和附圖來更具體地描述本發(fā)明，但它們不應(yīng)用來限制本發(fā)明。附圖l表示tauon制備的概述；附圖2表示tauon氨基酸序列的總示意圖附圖3表示最小tauon;附圖4表示C-末端截短的tauon;附圖5表示N-末端截短的tauon;附圖6表示tau的示意圖；附圖7表示人tau37;附圖8表示人tau39;附圖9表示人tau40;附圖10表示人tau43;附圖11表示人tau44;附圖12表示人tau46;且附圖13表示大鼠的大tau。實施例實施例1對tauons具有特異性的DC11族單克隆抗體的制備作為免疫接種用抗原的可溶性和不溶性tauons的制備(附圖1)為了從人AD大腦中分離tauons，部分基于Kopke等(1993)以及Greenberg和Davies(1990)所述的方法開發(fā)了一種新方法。選擇表現(xiàn)出具有短期死后延緩(postmortemdelay)(PMD)的ADI.-III.Braak，s階段改變特征的人大腦。選擇包括enthorinal和transenthorinal區(qū)、扁挑體和海馬區(qū)的顳葉塊。解剖該組織并立即浸入最低必需培養(yǎng)基(Gibco)中。將組織精細(xì)切碎并壓過150nm目網(wǎng)篩。在該階段將大腦樣品分成兩個等分部分樣品A和樣品B。將樣品A進(jìn)一步在20mMpH8的TRIS、0.32M蔗糖、10mMp-巰基乙醇、5mMEGTA、ImMEDTA、5mMMgS04、5mM千脒、10mM甘油磷酸、6mM苯甲基磺酰氟、50mM氟化鈉、5pg/ml亮抑酶肽、1.5ng/ml胃酶抑制劑和2pg/ffll抑酶肽中處理并在4"C下以25000xg離心35分鐘以除去細(xì)胞碎片。然后以200000xg40分鐘使上清液沉淀。在室溫下將所得沉淀用8M脲萃取70分鐘并在室溫下以300000xg旋轉(zhuǎn)45分鐘。將上清液對頻繁更換的pH7.6的10mMTRIS透析24小時且然后對100mMMES、0.5mMMgCl2、1mMEDTA、2mMEGTA、1mM二辟u蘇糖醇、0.75mMNaCl、0.1mM笨甲基磺酰氟和50mMNaF、pH2.7透析24小時。通過以200000xg離心40分鐘而除去沉淀的蛋白質(zhì)。將200000xg上清液對pH6.4的25mMMES、0.5mMMgCl2、0.1mMEDTA和1mM二硫蘇糖醇透析、且隨后在用相同緩沖液平衡的磷酸纖維素柱上進(jìn)行分級分離。使2mg/ml的蛋白質(zhì)上柱并用20ml線性梯度的NaCl(0-1M)的平衡緩沖液溶液洗脫。通過Western印跡評價用0.1-0.8MNaCl洗脫的蛋白質(zhì)，并通過真空離心蒸發(fā)濃縮(speedvacuum)設(shè)備濃縮。將樣品B放入玻璃勻化器內(nèi)10個體積的冷緩沖液(IOmMTRIS，1mMEGTA，0.8MNaCl，10%蔗糖，pH7.4)中。在4t:下以27000xg離心30分鐘后，保留上清液并將沉淀與所述緩沖液一起勻化，且以27000xg離心30分鐘。合并來自兩次離心的27000xg上清液、調(diào)節(jié)至1%(wtArol)N-月桂酰基肌氨酸和1%(vol/vol)p-巰基乙醇，并在37"C下的搖動器上保溫3小時。在以35000rpm離心30分鐘后，將沉淀在補充了1%巰基乙醇的5ml勻化緩沖液中勻化并通過0.45jim濾膜過濾。將濾液以35000rpm離心l小時。將沉淀重新懸浮于pH6.8的50mMTris中，并用2.5%甲酸萃取2分鐘，且然后以10000xg離心10分鐘以沉淀不溶性物質(zhì)。在4C下將上清液對pH7.4的10mMTris透析過夜，并如上所述進(jìn)行離心。使用真空離心蒸發(fā)濃縮設(shè)備濃縮所得上清液(級分II),并通過SDS-PAGE、隨后通過Western印跡評價。保留來自用2.5%甲酸萃取后含有不溶性tauons(級分III)的樣品B的沉淀并用于免疫接種和斑點試驗。合并級分(I、II和III)中的Tauons，并用作對小鼠進(jìn)行免疫接種的抗原(參見附圖1)。產(chǎn)生DC-11族單克隆抗體的雜交瘤的制備將6周齡Balb/c小鼠分成3組(A,B，C)。使前2組(A，B)接觸溶于弗氏完全佐劑(Sigma)的50ng抗原，且間隔3周加強接種5次溶于弗氏不完全佐劑的50pg相同抗原(Ag)。在A組中，將所有劑量注入足墊，在B組中經(jīng)皮下給予Ag的劑量。對第3組小鼠僅將溶于PBS中的一個劑量直接注入脾(脾內(nèi)免疫接種)，并在該接觸抗原后的1周將脾用于融合。融合前3天時經(jīng)靜脈內(nèi)對A組和B組中的小鼠注射50jig溶于PBS的免疫原。按照Kontsekova等1988的方法使來自免疫接種小鼠的脾細(xì)胞與NS/0骨髓瘤細(xì)胞融合。將108個脾細(xì)胞與2x107個NS/0骨髓瘤細(xì)胞混合(比例5:1)，并在補充了10%二甲亞砜的不含血清的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)內(nèi)的lml50%PEG1550(Serva)中融合1分鐘將融合的細(xì)胞以2.5x105個脾細(xì)胞/孔的密度重新懸浮于96-孔平板上的DMEM中，該DMEM含有20%馬血清、L-谷氨酰胺(2mM)、次黃嘌呤(O.1mM)、氨基蝶呤(0.004mM)、胸苷(0.016mM)和艮他霉素(40U/ml)'將細(xì)胞在37"C下保溫10天，并通過ELISA和免疫組織化學(xué)篩選用于產(chǎn)生抗-tauon特異性單克隆抗體的生長的雜交瘤。通過ELISA進(jìn)行抗ta謹(jǐn)s抗體篩選將ELISA用于檢測針對tauons的雜交瘤培養(yǎng)物上清液中的單克隆抗體。使用如上所迷制備且具有下列改變的tauons作為固相。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳從級分中分離真空離心蒸發(fā)濃縮的合并物，并通過按照Donofrio等(1986)的方法經(jīng)電洗脫回收tau蛋白的截短形式，且通過SDS-PAGE評價。在4C下用異常截短的tau蛋白PBS溶液將微量滴定板包被過夜(10pg/ml，50pl/孔)。在用1%脫脂奶粉封閉以減少非特異性結(jié)合后，將該平板用PBS-0.05%TVeen20洗滌，并在37"下與50jil/孔的培養(yǎng)物上清液一起保溫1小時。用與辣根過氧化物酶(DAKO)綴合的綿羊抗小鼠Ig檢測結(jié)合的單克隆抗體。用鄰苯二胺溶液作為過氧化物酶底物使反應(yīng)顯色，并用50nl2MH2S04終止該反應(yīng)。使用MultiscanMCC/340ELISA讀出器(Labsystems)測定492nm處的吸收度。將至少兩倍于陰性對照值的讀取值看作是陽性的。按照Kontsekova等1991的步驟在軟瓊脂上進(jìn)一步亞克隆陽性培養(yǎng)物。重新篩選用于產(chǎn)生特異性抗-tauon單克隆抗體的分離的亞克隆?？箃auon抗體的免疫組織化學(xué)篩選如下在AD大腦組織上重新篩選在抗-tauonELISA中鑒定為陽性而對正常tau鑒定為陰性的單克隆抗體的特異性在冠狀板上將尸解時取出的AD患者的大腦切成lcin間隔的切片并儲存在-20X:下。將海馬、enthorinal、顳、額、枕和頂葉皮層塊固定在4C的4%緩沖低聚甲醛中4天以上。在振動切片機上切一系列額切片(50pm)并儲存在4"C下的PBS(pH7.0)中。用98%冷甲酸將自由移動的振動切片機切片預(yù)處理2-3分鐘、與PBS/TritonX100中的免疫前血清一起保溫。所用的血清與第二抗體來自相同動物種類。在37"C下將切片與ELISA(如上所述)中陽性的單克隆抗體一起保溫60分鐘。在室溫下與第二生物素化抗體(VectastainElite試劑盒，Vector)保溫1小時。使用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(VectastainElite試劑盒，Vector)和6mg3-3-二氨基聯(lián)笨胺-4HC1(SIGMA)、250mgNiCl2(MERCK)的含100^1H202的10ml0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6)使免疫反應(yīng)顯色。通過在PBS/Triton中洗滌切片終止反應(yīng)(Kiss等，1988;Cuello等，1993,Thorpe和Kerr,1994)。實施例2使用DC-11族單克隆抗體對異常截短的tau蛋白(tauons)進(jìn)行的定量測定如上所述分離tauons。單克隆抗體DC30(識別正常和病理性tau)與DC-11族單克隆抗體(對異常截短的tau具有特異性)的組合對由AD-大腦制備的測試樣品中的tauons進(jìn)行量化。通過蛋白質(zhì)A柱層析法從不含血清的培養(yǎng)基中純化抗體。在4K下用濃度為10ng/ml(50nl/孔)的DC-11單克隆抗體混合物的PBS溶液將高結(jié)合微量滴定板(Nunc)的孔包被過夜。通過加入200^11%的脫脂奶粉的磷酸緩沖鹽水(PBS)在室溫下60分鐘而將孔中的非特異性結(jié)合飽和。將該平板用PBS-0.05%Tween20(v/v)洗3次。加入含濃度為100-1000pg/ml的重組tauons的PBS液的連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和含有50jil用量的AD-tauons測試樣品。在37C下保溫60分鐘后，洗滌平板，并加入在PBS中1/5000稀釋的辣根過氧化物酶綴合的抗體DC加(soni/孔)、在37X:下持續(xù)60分鐘。在最終的洗滌后，向各孔中加入50nl的鄰笨二胺溶液和0.003%H202，并將平板在黑暗中保溫20分鐘。用50jil的2MH2S04使反應(yīng)終止。用ELISA讀出器MultiscanMC344(Ubsystems,Finland)上讀取492nm處的吸收度。根據(jù)獲得的數(shù)值構(gòu)建重組tauons的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定測試樣品中tauons的相應(yīng)濃度。實施例3通過Western印跡、使用單克隆抗體DC-ll檢測tauons。使純化的重組全長人tau和異常截短的tau蛋白tauons上樣5-2096梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠，并使其在Laemmli(1970)的變性條件下遷移。SDS-PAGE后，在pH12的10mMCAPS緩沖液中，將轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯膜(Milipore)上的步驟在350mA、冷卻下進(jìn)行1小時。印記后在PBS中洗滌該膜，并在室溫下用1%脫脂奶粉PBS液封閉1小時。將轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)與單克隆抗體DC-ll—起在4t:下保溫過夜。在用PBS-0.05%Tween20(v/v)洗滌后，使用按1/1000稀釋的用辣根過氧化物酶標(biāo)記的大鼠抗小鼠免疫球蛋白并在室溫下保溫1小時。然后將該膜在PBS-Tween20中洗滌4次、用底物溶液(12mg4-氯-1-萘酚(naphtol)、4ml甲醇、16mlPB、0.03%v/v&02)使反應(yīng)顯色，并在H20中終止該反應(yīng)。結(jié)果表明抗體DC-11僅識別異常截短的tau即tauons,相反，單克隆抗體DC30是普遍識別所有已知來自許多種類(人、猴、牛、豬、大鼠、小鼠)的tau同種型的全tau抗體，而與其翻譯后修飾的狀態(tài)無關(guān)。實施例4tauons的免疫組織化學(xué)鑒定DC-ll族單克隆抗體適合于在不同類型免疫組織化學(xué)方法中使AD-大腦中的tauons顯色。光學(xué)顯微鏡標(biāo)記在冠狀板上將尸解時取出的患AD患者的大腦切成lcffl間隔的切片并儲存在-20"C下'將海馬、entorhinal、顳、額、枕和頂葉皮層塊固定在4"C的4%緩沖低聚甲醛中4天以上。在振動切片機上切一系列額切片(50nm)并儲存在4X:下的PBS(pH7.0)中。用98%冷甲酸將自由移動的振動切片機切片預(yù)處理2分鐘、與PBS/TritonX100中的免疫前血清一起保溫。所用的血清與第二抗體來自相同動物種類。在37"C下將切片與單克隆抗體DC-ll—起保溫60分鐘。在室溫下與第二生物素化抗體(VectastainElite試劑盒，Vector)保溫1小時。使用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(VectastainElite試劑盒，Vector)和6mg3-3-二氨基聯(lián)苯胺-4HC1(SIGMA)、250mgNiCl2(MERCK)的含lOOfil&02的10ml0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6)使免疫反應(yīng)顯色。通過在PBS/Triton中洗滌切片終止反應(yīng)(Kiss等，1988;Cuello等，1993，Thorpe和Kerr，1994)。光學(xué)顯微鏡雙標(biāo)記用98%冷甲酸將自由移動的振動切片機切片預(yù)處理2-3分鐘、與PBS/TritonX100中的免疫前血清一起保溫。所用的血清與第二抗體來自相同動物種類。在37TC下將切片與在封閉溶液(596馬血清、PBS、0.1%Triton)中按1:1000稀釋的第一種過氧化物酶綴合的單克隆抗體DC-11—起保溫60分鐘、在0.06%DAB、0.01%11202的PBS溶液(pH7.2)中展開。通過在PBS/Triton中洗滌切片終止反應(yīng)。在37TC下將相同切片與第二單克隆抗體一起保溫60分鐘在室溫下與生物素化抗體(VectastainElite試劑盒，Vector)保溫1小時。使用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(VectastainElite試劑盒，Vector)和0.06%3-3-二氨基聯(lián)苯胺-4HC1(SIGMA)、0.01%H202、2.5%NiCl2(MERCK)的0.1M乙酸鹽緩沖液使免疫反應(yīng)顯色，并通過在0.1M乙酸鹽緩沖液中洗滌切片終止反應(yīng)(Kiss等，1988;Cuello,1993)。使用快速甲酚紫(cresylviolet)進(jìn)行的復(fù)染在完成免疫組織化學(xué)染色后，將切片置于載玻片上并放入56C下的恒溫器中60分鐘。在保溫后將載玻片浸入蒸餾(destilled)水中5分鐘、在4r下用快速甲酚紫溶液染色5-10分鐘、用水沖洗并轉(zhuǎn)入96%乙醇，直到除去大部分甲酚紫染色、用二甲笨(xylen)凈化并用Entellan固定。免疫熒光染色用98%冷甲酸將自由移動的振動切片機切片(30pm)預(yù)處理2分鐘、與PBS/TritonX100中的免疫前血清一起保溫。在37"C下將切片與第一種初級單克隆抗體DC-11—起保溫60分鐘，然后在室溫下與按照本領(lǐng)域中所用的標(biāo)準(zhǔn)方法與在PBS/Triton中按1:500稀釋的FITC-綴合的山羊抗體小鼠次級抗體(Immunotech)—起保溫30分鐘，在用PBS洗滌后，在37C下將切片與TRITC-綴合的初級抗體一起保溫60分鐘，并固定在0.1%對苯二胺/甘油溶液中實施例5使用tauons進(jìn)行的徵管裝配和微管結(jié)合試驗微管蛋白純化通過溫度依賴性微管聚合與解聚循環(huán)、隨后通過磷酸纖維素(WatmanPll磷酸纖維素)離子交換層析法(Valee,1986)從自當(dāng)?shù)赝涝讖S獲得的鮮豬腦中分離微管蛋白。微管裝配試驗在+4C下將純化的tauons(5mM)與預(yù)凈化的純化微管蛋白(10mM)和GTP(1mM)在裝配緩沖液(100mMPIPESpH6.9,2mMEGTA，1mMMgS04)中混合。該微管蛋白的濃度低于自發(fā)裝配的臨界濃度(Black,1987)。將樣品用移液管吸入預(yù)熱至37"C的石英池中。在熱穩(wěn)定控制的分光光度計(LKB)中以分光光度方式測定濁度的改變，并記錄為10s間隔的OD35。改變、持續(xù)30分鐘的期限。微管結(jié)合試驗如上所述確定含微管的tauons的結(jié)合曲線(Gustke，1992)。在37"C下，在有GTP(1mM)和紫杉醇(20^M)存在的情況下，將純化的微管蛋白在結(jié)合緩沖液(IOOmMPIPESpH6.9、1mMEGTA、1mMMgS04、1mMDTT)中保溫10分鐘。用分別不干擾tauons或正常tau蛋白及其它MAPs結(jié)合的紫杉醇穩(wěn)定微管(Valee，1986;Wallis，1993),由此消除微管裝配的影響。加入濃度分別為2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、15mM、20mM的Tauons。在37"下以43000xg離心35分鐘后，將沉淀重新懸浮于P緩沖液(50mMPIPESpH6.9、1mMEGTA、0.2mMMgCl2、5mMDTT、500mMNaCl)中。在SDS-PAGE凝膠上分析上清液與沉淀(Laemmli,1970)、用銀染色(Bloom,1987)。在HPScanJet(Hewlett-Packard)掃描儀上掃描凝膠，并應(yīng)用公共域NIHImage程序(美國國家健康研究所(U.S.NationalInstitutesofHealth)研發(fā)并可在國際互連網(wǎng)上獲得，網(wǎng)址http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)在Macintosh計算機上進(jìn)行分析。使用內(nèi)標(biāo)法和校正曲線將帶強度轉(zhuǎn)化成濃度。實施例6重組tauons的制備使用"EraseaBaseSystem"(Pro邁ega)、按照技術(shù)手冊制備tau蛋白的重組截短形式。該系統(tǒng)基于從5，突出端開始特異性消化插入DNA的外切核酸酶III。在恒溫下消化率是均勻的。通過Ndel-EcoRI限制位點將tau基因克隆入pET17b載體產(chǎn)生pET/T40向該基因的C-末端添加Kpnl限制位點和Kpnl位點的全部三個讀框下游中的三個終止密碼子。EcoRI酶留下5，突出端作為exoIII的底物。Kpnl留下耐exoIII消化的3'突出端。將用EcoRI、KpnI/NEB雙消化和乙醇沉淀的lpgpET/T40載體在20fUlxExoIII緩沖液中稀釋，并在37X:/消化率450個堿基/分鐘條件下用80uexoIII消化。在添加ExoIII后，就1份樣品而言，間隔30s將2.5ja1樣品轉(zhuǎn)入水上的7.5ja1Sl-核酸酶混合物/1.5uSl-核酸酶中。在室溫下將收集的樣品保溫30分鐘以除去剩余的單鏈尾。用KlenowDNA聚合酶形成鈍端。直接用樣品的連接混合物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。通過PstI-Xhol限制性酶切篩選亞克隆，并使用pET載體中T7-引物對合適的構(gòu)建體測序。重組tauons的表達(dá)、純化和定量在大腸桿菌BL21(DE3)(Studier，1986)中表達(dá)Tauons。將單細(xì)菌菌落接種入500ml的LBAMP(LB培養(yǎng)基，lOOpg/ml氨千青霉素)。使細(xì)菌培養(yǎng)物在37X:下的旋轉(zhuǎn)搖動器上生長，直到其0De。。達(dá)到0.6-0.8,然后通過添加IPTG(0.4mM終濃度)誘導(dǎo)。3小時后，通過在4"C下以5000g離心15分鐘使細(xì)菌細(xì)胞沉淀(Sigma6K15,轉(zhuǎn)子12500)，將細(xì)胞沉淀迅速冷凍在液氮中，且儲存在-70TC下至進(jìn)一步應(yīng)用為止。為了制備細(xì)胞裂解物，將細(xì)菌沉淀重新懸浮于緩沖液A中(20mMPIPESpH6.9、50mMNaCl、1mMEGTA、1mMMgS04、2mMDTT、0.1niMPMSF)，通過在水上超聲處理6分鐘使細(xì)胞破碎，并通過在+2TC下以45000rpm離心15分鐘而除去細(xì)胞碎片(轉(zhuǎn)子TLA-120.2，BeckmamiOptimaTLX),通過0.22,濾膜(Millipore)過濾上清液，并立即在磷酸纖維素柱(磷酸纖維素WhatmanPll)上通過離子交換層析純化tauons。在使樣品上柱后，用10個床體積的緩沖液A洗滌該柱。用20ml線性梯度的NaCl(50mM-0.5M)緩沖液A洗脫Tauons。收集1ml級分，并在SDS-PAGE上鑒定含有蛋白質(zhì)的那些級分。合并含有tauons的級分，并在4匸下對PBS透析3x60分鐘。將來自透析液的等分部分真空干燥(SpeedVac)并儲存在-20iC下。通過PAGE、使用連續(xù)稀釋的牛血清白蛋白(BSA)作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記對重組tauons進(jìn)行定量。用考馬斯藍(lán)染色凝膠、干燥并使用ScionImage(Beta3b,ScionCorp.)計算BSA和tau帶的強度。構(gòu)建BSA的校正曲線并用于對tauons定量。實施例7從人AD-大腦中分離tauons為了從人AD大腦中分離tauons，部分基于Kopke等(1993)以及Greenberg和Davies(1990)所述的方法開發(fā)了一種新的方法。選擇表現(xiàn)出具有短期死后延緩(PMD)的ADI.-III.Braak，s階段改變特征的人大腦。逸擇包括enthorinal和transenthorinal區(qū)、扁糸fe體和海馬區(qū)的顳葉塊。解剖該組織并立即浸入最低必需培養(yǎng)基中(Gibco)。將組織精細(xì)切碎并壓過150nm目網(wǎng)篩。在該階段將大腦樣品分成兩個等分部分樣品A和樣品B。將樣品A進(jìn)一步在20mMpH8的TRIS、0.32M蔗糖、10mMp-巰基乙醇、5mMEGTA、lmMEDTA、5mMMgS04、5mM節(jié)脒、10mM甘油磷酸、6mM苯甲基磺酰氟、50mM氟化鈉、5ng/ml亮抑酶肽、1.5pg/ml胃酶抑制劑和2ng/ml抑酶肽中處理并在4"C下以25000xg離心35分鐘以除去細(xì)胞碎片。然后以200000xg40分鐘使上清液沉淀。在室溫下將所得沉淀用8M脲萃取70分鐘并在室溫下以300000xg旋轉(zhuǎn)45分鐘。將上清液對頻繁更換的pH7.6的10mMTRIS透析24小時，且然后對100mMMES、0.5mMMgCl2、1mMEDTA、2mMEGTA、1mM二辟u蘇糖醇、0.75mMNaCl、0.1mM笨甲基磺酰氟和50mMNaF、pH2.7透析24小時。通過以200000xg離心40分鐘而除去沉淀的蛋白質(zhì)。將200000xg上清液對pH6.4的25mMMES、0.5mMMgCl2、0.1mMEDTA和1mM二疏蘇糖醇透析，且隨后在用相同緩沖液平衡的磷酸纖維素柱上進(jìn)行分級分離.使2mg/ml的蛋白質(zhì)上柱并用線性梯度的NaCl(O-lM)的平衡緩沖液溶液洗脫。通過Western印跡評價用0.1-0.8MNaCl洗脫的蛋白質(zhì)，并通過真空離心蒸發(fā)濃縮設(shè)備濃縮。將樣品B放入玻璃勻化器內(nèi)10個體積的冷緩沖液(IOmMTRIS,1mMEGTA,0.8MNaCl,10%蔗糖，pH7.4)中。在4tl下以27000xg離心30分鐘后,保留上清液，并將沉淀與所述緩沖液一起勻化，且以27000xg離心30分鐘。合并來自兩次27000xg離心的上清液、調(diào)節(jié)至1%(wt/vol)N-月桂?；“彼岷?%(vol/vol)p-琉基乙醇，并在37TC下的搖動器上振動保溫3小時。在以35000rpm離心30分鐘后，將沉淀在補充了1%巰基乙醇的5ml勻化緩沖液中勻化并通過0.45nm濾膜過濾。將濾液以35000rpm離心1小時。將沉淀重新懸浮于pH6.8的50mMTris中，并用2,5%甲酸萃取2分鐘，然后以10000xg離心IO分鐘以沉淀不溶性物質(zhì)。將上清液對pH7.4的10mMTris在4t:下透析過夜，并如上所述進(jìn)行離心。使用真空離心蒸發(fā)濃縮設(shè)備濃縮所得上清液，并通過SDS-PAGE、隨后通過Western印跡評價。實施例8從人、豬和牛大腦組織中純化正常tau通過對Lindwall和Cole.,1984方法進(jìn)行修改的方法純化tau。將大腦組織(lmg/ml)在0.1mMMES、0.5mMMgCl2、1mMEGTA、1MNaClpH6.5中勻化，并在4"C下以100000xg離心90分鐘。將上清液制成0.5%(v/v)2-巰基乙醇溶液、在100X:下加熱5分鐘并在4X:下以20000xg離心30分鐘。將該第二次的上清液制成45%的(NH4)2S04飽和溶液，且如上所述以20000xg離心，并將所得沉淀重新懸浮于不含NaCl的MES緩沖液中。在用2.5%(v/v)高氯酸沉淀并進(jìn)一步以20000xg離心后，將最終的上清液對pH7.4的5mMTris4C透析過夜。實施例9由tauons逐漸導(dǎo)致的正常tau結(jié)合和聚集成纖絲纏結(jié)將量逐漸增加的正常tau(5-100jig/100ul)與固定量的分離自級分I的(10ng/100ul)tauons混合。使該反應(yīng)在100ml終體積的結(jié)合緩沖液(含有2mMEGTA、2%牛血清白蛋白、0.5mMMgCl2、1jiM抑酶肽和20[iM亮抑酶肽的pH7.6的100mMMES)中進(jìn)行。在室溫下使該混合物發(fā)生相互作用45分鐘，然后置于150nl80%蔗糖結(jié)合緩沖液溶液，以100000xg離心1小時。除去上部的150pl，并對剩余部分超聲處理以便通過放射性免疫-斑點-印記測定法測定tauons與正常tau之間的相互作用。蔗糖層中存在tau表明tauon結(jié)合了健康的tau。實施例10DC-11族單克隆抗體抑制神經(jīng)元變性將神經(jīng)元母細(xì)胞瘤細(xì)胞和生長因子一式三份置于培養(yǎng)皿上。第一組僅接受ta,s,而第二組接受tauons和DC-ll單克隆抗體的混合物。用免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染的tauons在室溫下將細(xì)胞在含有80mMPIPES、1mMMgCl2、1mMEGTA，pH6.6的0.2%TritonX100中透化5分鐘。在相同緩沖液中用2%低聚甲醛將細(xì)胞水上固定15分鐘。通過間接免疫熒光抗生物素蛋白羅丹明檢測系統(tǒng)(Sigma)檢測Tauons。神經(jīng)元分化早期抑制的檢測使細(xì)胞與分化誘導(dǎo)因子一起生長。評價分化水平。帶有tauons而不含抗體的該組細(xì)胞具有的分化能力顯著下降。然而，用tauons和抗體混合物處理的組分化至與來自用無關(guān)蛋白處理的對照組的細(xì)胞相差無幾的水平。本發(fā)明進(jìn)一步如下進(jìn)行描述1.對構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常形式具有特異性的抗體，所述的抗體對正常tau蛋白是非特異的。2.段落1的抗體，該抗體來源于在ECACC中保藏的具有保藏號00082215和00082216的雜交瘤細(xì)胞系DC-ll和DC-11/I。3.段落1或2的抗體，該抗體與由所述在ECACC中保藏的具有保藏號00082215和00082216的雜交瘤細(xì)胞系DC-ll或DC-ll/I產(chǎn)生的抗體相比，對所述tau的構(gòu)象上不同形式具有至少50%的特異性，尤其是具有至少90%的特異性。4.段落l-3中任意一項的抗體，其特征在于它是合成抗體。5.產(chǎn)生段落l-4中任意一項的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。6.構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式，所述tau蛋白的構(gòu)象上不同形式可由段落1-4中任意一項的抗體特異性識別。7.段落6的tau蛋白形式，其特征在于該蛋白質(zhì)與正常tau相比在N-末端或C-末端或兩末端上被異常截短，且所述的tau蛋白形式至少包括正常tau蛋白質(zhì)序列中的100個氨基酸-400個氨基酸。8.用于檢測或分離腦組織或體液樣品中構(gòu)象上不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式的試劑盒，該試劑盒包括段落1-4中任意一項的抗體和用于裝載探針的適宜容器。9.段落8的試劑盒，其特征在于它進(jìn)一步含有用于檢測所述抗體與所述構(gòu)象不同的tau蛋白之間結(jié)合情況的工具，優(yōu)選二抗，尤其是特異性標(biāo)記的二抗。10.段落8或9的試劑盒，其特征在于它進(jìn)一步含有用于對所述構(gòu)象不同的tau蛋白定量的工具，尤其是構(gòu)象不同的tau蛋白標(biāo)準(zhǔn)制-口011.患者腦組織或體液中構(gòu)象不同于正常tau的tau蛋白的異常截短形式的檢測方法，該方法包括下列步驟將所述的體液與段落1-4中任意一項的抗體混合，檢測所述抗體與所述構(gòu)象不同的tau蛋白之間存在的結(jié)合情況，且可選地測定與所述抗體結(jié)合的構(gòu)象不同的tau蛋白的量。12.段落1-4中任意一項的抗體在制備用于治療阿爾茨海默病患者的藥物中的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)BlackMM(1987)Comparisonoftheeffectsofmicrotubule-associatedprotein2andtauon也epackingdensityofinvitroassembledmicrotubulesProcNatlAcadSciUSA84:7783-7787BlessedG，TomlisonBE,RothM(1968)Theassociationbetweenqualitativemeasauresofdemen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GluAsriAlaLys'AlaLys'ThrAspHisGlyAlaGlulieValTyrLys85■.9095SerProValVal.SerGly-Asp-ThrSerProArgHisLeuSerAsnVal100105110SerSerThrGly5erlieAspMetValAspSerProGinLeuAlaThr115120'125LeuAlaAspGluValSerAlaSerLeuAlaLysGinGlyLeu130135140<2;0>'4<211>381<212>PRT<213>人類<400>.4.MetA^aGluProArgGinGluPheGluValMetGluAspHisAla|Gly15-1015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGinGlyGlyTyxThrMetHis2025■-30GinAspGinGluGlyAspThrAspAlaGly.LeuLysGl'uSerProLeu.354045Gin.ThrProThrGluAspGlySerGluGluProGlySerGluThrSer5055.60AspAlaLysSerThrProThrAlaGluAlaGluGluAlaGlylieGly6570—-■"7580Asp'ThrPro.SerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGinAla859095ArgMetVal.SerLysSerLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLys100105110.AlaLysGlyAlaAspGlyLysThrLyslieAlaThrProArgGlyAla11512012'5AlaProPro.GlyGinLysGlyGinAlaAsnAlaThrArglieProAla130135140LysThrProProAlaProLys—ThrProProSerSerGlyGluProPro-145150155160LysSerGlyAspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThr165170175ProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrProProThrArg180185190GluProLysLysValAlaValValArgThrProProLys'SerProSer195200205SerAlaLysSerArgLeuGinThr—AlaProValProMetProAspLeu210.215220LysAsnValLysSerLyslieGlySerThrGluAsnLeuLysHisGin22523023540ProGlyGlyGlyLysValGinlieValTyrLysProValAspLeu.Sei:245250255LysValThrSerLjrsCysGlySerLeuGlyAsnlieHisHisLysPro■260265270GlyGlyGlyGinValGluValLys.SerGluLysLeuAspPheLysAsp275280285ArgValGinSertyslieGlySerLeuAspAsnlieThrHisValPro290295300GlyGlyGlyAsnLysLyslieGluThrHisLysLeuThrPheArgGlu305310315320AsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGlulieValTyrLysSer325330335ProValValSerGlyAspThrSerProAtgHisLeuSerAsnValSer340345350SerThrGlySeflieAspMetValAspSerProGinLeuAlaThrLeu355360365AlaAspGluValSerAlaSerLeuAlaLysGinGlyLeu37037&'380'<210>5<211>410<212>PRT<213>人類<400>5MetAlaGluProArgGinGluPheGluValMetGluAspHisAlaGly151015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGinGlyGlyTyrThrMetHis202530GinAspGinGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysGluSerProLeu354045GinThrProThrGluAspGly.$erGluGluProGlySerGluThrSer505560AspAlaLysSerThrProTh^AlaGluAspValThrAlaProLeuVal.65707580Asp(SluGlyAlaProGlyLysGinAlaAlaAlaGinProHisThrGlu859095lieProGluGlyThrThrAlaGluGluAlaGlylieGlyAspThrPro100105110SerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGinAlaArgMetVal115120125SerLysSprLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLysAlaLysGly130135"0AlaAspGlyLysThrLyslieAlaThrProArgGlyAlaA^aProPro145150155160GlyGinLysGlyGinAlaAsnAlaThrArglieProAlaLysThrPro165170175ProAlaProLysThrProProSerSerGly'GluProProLysSerGly180185190AspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThrProGlySer195200.205ArgSerArgT"hrProSerLe'uProTl^rProProThrArgGluProLys210215220LysValAlaValValArgThrProProLysSerProSerSer'AlaLys225230235240SerArgLeuGinThrAlaProValProMetProAspLeuLysAsnVal245250255LysSerLyslieGlySerThrGluAsnLeuIiysHisGinProGlyGly260'265270GlyLysValGinlieValTyrLy.sProValAspLeuSerLysValThr275280285SerLysCysGlySerLeuGlyAsnlieHisHisLysProGlyGlyGly290295300GinValGluValLysSerGluLysleuAspPheLysAspArgValGin305310315320Ser'LyslieGlySerL_euAspAsnlieThrHisValProGly<31y'Gly325.330335AsnLysLyslieGluThrHisLysLeuThrPheArgGluAsnAlaLys'340345350AlaLysThrAspHisGlyAlaGlulieValTyrLysSerProValVal355360365SerGlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsnValSerSerThrGly370375380SerlieAspMetValAspSerProGinl>euAlaThrLeuAlaAspGlu3.85390395400ValSerAlaSerLeuAlaLysGinGlyLeu405410<210>6<211>441<212>PRT<213>人類<400>6MetAlaGluProArgGinGluPh&GluValMetGluAspHisAlaGly151615ThriyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGibGlyGlVTyrThrMetHis202530GinAspGinGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysGluSer^roLeu354045GinThrProThrGluAspGlySerGluGluProGlySerGluThrSer505560Asp-AlaLysSerThrProThrAlaGluAspValThrAlaProLeuVal65707580AspGluGlyAlaProGlyLysGinAlaAlaAlaGinProHisThrGlu859095lieProGluGlyThrThrAlaGluGluAlaGlylieGlyAspThrPro100105110SerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGinAlaArgMetVal115120125SerLysSerLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLysAlaLysGly130135140AlaAspGlyLysThrLyslieAlaThrProArgGlyAlaAlaProPro145150155160GlyGinLysGlyGinAlaAsnAlaThrArglieProAlaLysThrPro165170175ProAlaProLysThrProProSerSerGlyGluProProLysSerGly180.185190AspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThrProGlySer195200205ArgSerArgThrProSerLeuProThrProProThrArgGluProLys210215220LysValAlaValValArgThrProProLysSerProSerSerAlaLys225230235240SerArgLeuGinThrAlaProValProMetProAspLeuLysAsnVal245250255LysSerLyslieGlySerThrGluAsnLeuLysHisGinPjcoGlyGly260265270GlyLysValGinlielieAsnLy'sLysLeuAspLeuSerAsnValGin275280285SerLysCysGlySerLysAspAsnlieLysHisValProGiyGlyGly290-295300SerValGinlieValTyrLysProValAspLeuSerLysValThrSer305310315320LysCysGlySerLeuGlyAsnlieHisHisLysProGlyGlyGlyGin325330335ValGluValLysSerGluLysLeuAspPheLysAspArgValGinSer340345350LyslieGlySerLeu'AspAsnlieThrHisValProGlyGlyGlyAsn355360365LysLyslieGluThrHisLysLeuThrPheArgGlu'AsnAlaLybAla370375380LypThrAspHisGlyAla'GlulieValTyrLysSerPro.ValValSer385390395400GlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsnValSerSerThrGlySer405410415lieAspMetValAspSerProGinLeuAlaThrLeuAlaAspGluVal420425430SerAlaSerLeuAlaLysGinGlyLeu435440<210>7<211>383<212>PRT<213>人類<400>7MetAlaG'luProArgGinGluPheGluValMetGluAspHisAlaGly15.1015ThrTyrGlyL>euGlyAspArgLysAspGinGlyGlyTyrThrMetHis202530GinAspGinGiuGlyAspThrAspAlaGlyI<euLysAlaGluGluAla35.404SGlylieGlyAspThrProSerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisVal505560ThrGinAlaArgMetValSerLys6570lieProAlaLysThrProProAla115120SerLysAs^>GlyThrGlySerAsp7580LyslieAlaThrPro95AlaAsnAlaThrArg110ProLysThrProProSerSerGly125AspLysLysAlaLysGlyAlaAspGlyLysThr8590ArgGlyAlaAlaProProGlyGinLysGlyGin100105GluProProLysSerGlyAspArgSerGlyTyrSerSerProGlySer130135"0ProGlyTip:ProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrPro"5150155160ProThrArgGluProLysLysValAlaValValArgThrProProLys165170175SerProSerSerAlaLysSerArglieuGinThrAlaProValProMet180185190Pr)AspLeuLysAsnValLysSer.LyslieGlySerThrGluAsnLeu195200205LysHisGinProGlyGlyGlyLysValGinlielieAsnLysLysLeu210215220AspLeuSerAsnValGinSerLysCysGlySerLysAspAsnlieLys225230235240HisValProGlyGlyGlySerValGinlieValTyrLysProValAsp245250255LeuSerLysValThrSerLysCysGlySerLeuGlyAsnlieHisHis260265270LysPyoGlyGlyGlyGinValGluValLysSerGluLyslieuAspPhe275280285LysAspArgValGinSerLyslieGlf-SerLeuAspAsnlieThrHis29029'5300ValProGiyGlyGlyAsnLysI*ys305310ArgGluAsn,AlaLys-AlaLysThf.325LysSerProValValSerGlyAsp340ValSerSerThrGlySerlieAsp355360ThrLeuAlaAspGluValSerAla370375lieGluThrHisLysLeuThrPhe315320AspHisGlyAlaGlulie/alTyr330335ThrSerProArgHisLeu.SerAsn345350MetValAspSerProGinLeuAla365SerLeuAlaLysGinGlyLeu380<210>8<211>35.2<212>PRT<213>人類<400>8MetAla<31u'ProArgGinGluPheGluValM^.tGluAspHisAlaGly151015ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGinGlyGlyTyrThrMetHis202530GinAspGinGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysAlaGluGluAla354045GlylieGlyAspThrProSerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisVal50S560ThrGl'nAlaArgMetValSerLysSerLysAspGlyThrGlySerAsp65707580Asp'LysLysAlaLysGlyAlaAspGlyLysThrLyslieAlaThrPro859095ArgGlyAlaAlaProProGlyGinLysGlyGinAlaAsnAlaThrArg100105110lieProAlaLysThrProProAlaProLysThrProProSerSerGly115120125<51uProProLysSerGlyAspArgSerGlyTyrSerSerProGlySer13013514ttProGlyThrProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrPro145150155160ProThrArgGluProLysLysValAlaValValArgThrPro.ProLys165170175SerProSerSerAlaLysSerArgLeuGinThrAlaProValProMet180185190ProAspLeuLysAsnValLysSerLyslieGlySerThrGluAsnLeu1^5200205LysHisGinProGlyGlyGlyLysValGinlieValTyrLysProVal210215220AspteuSerLysValThrSer.LysCysGlySerLeuGlyAsnlieHis225230235240.His'LysProGly.Gly.GlyGinValGluValLys'SerGiuLysLeuAsp245250255PheLysAspArgValGinSerLyslieGlySerLeuAspAsnlieThr'260265270HisValProGlyGlyGlyAsnLysLyslieGluThrHisLysLeuThr275280285PheArgGluAsnAlaLysAlaLysThrAspHisGlyAlaGlulieVal29029.5300TyrLysSerProValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeuSer305310315320AsnValSerSerThrGlySerlieAspMetValAspSerProGinLeu325330335AlaThrLeuAlaAspGluValSer'AlaSerLeuAlaLysGinGlyLeu34i)345350<210>9<211>412<212>PRT<213>人類<400>9MetAlaGluProArgGin5GluPheGluVal'Met10GluAspHisAlaGly15ThrTyrGlyLeuGlyAspArgLysAspGinGlyGlyTyrThrMetHis202530GinAspGinGluGlyAspThrAspAlaGlyLeuLysGluSerProLeu354045GinThrProThrGluAspGlySerGluGluProGlySerGluThrSer505560AspAlaLysSerThrProThrAlaGluAlaGluGluAlaGlylieGly65707580AspThrProSerLeuGluAspGluAlaAlaGlyHisValThrGinAla859095ArgMetValSerLysSerLysAspGlyThrGlySerAspAspLysLys100105110AlaLysGlyAlaAspGlyLysThrLyslieAlaThrProArgGlyAla115120125AlaProProGlyGinLysGlyGinAlaAsnAlaThrArglieProAla-130135140LysThrProProAlaProLysThrProProSerSerGlyGluProPro145150155160LysSerGlyAspArgSerGlyTyrSerSerProGlySerProGlyThr165170175ProGlySerArgSerArgThrProSerLeuProThrProProThrArg180185190GluProLy.sLysValAlaValValArgThrProProLysSerProSer195200205SerAlaLysSerArgLeuGJLnThrAlaProValProMetProAspLeu210215220LysAsnValLysSerLyslieGlySerThrGluAsnLeuLysHisGin225230235240ProGlyGlyGlyLysValGinlielieAsnLysLysLeuAspLeuSerAsnValGinSerLysCysGlySer"LysAspAsnlieLysHisValPro260265270GlyGlyGlyS^rVal'GinlieValTyrLysProValAspLeuSerLys275280285ValThrSerLysCysGlySerLeuGlyAsnlieHisHisLysProGly290295300GlyGlyGinValGluValLysSerGluLysLeuAspPheLysAspArg305310315320ValGinSerLyslieGlySerLeuAspAsnlieThrHisValProGly325330335GlyGlyAsnLysLyslieGluThrHisLysLeuThrPheArg(lu'Asn■3-0345350AlaLysAliLysThrAspHisGlyAlaGlulieValTyrLysSerPro355360365ValValSerGlyAspThrSerProArgHisLeuSerAsnVal'SerSer370375380ThrGlySerlieAspMetValAspSerProGinLeuAlaThrLeuAla385330395400AspGluVal'SerAlaSer'LeuAlaLysGinGlyLeu405410<210>10<211>686<212>PRT<213>大鼠<400>10MetAlaGluProArgGinGluPheAspThrMetGluAspGinAlaGly151015AspTyrThrMet-LeuGinAspGinGluGlyAspMetAspHisGly-Leu20.2530LysGluSerProProGinProProAlaAspAspGlySerGluGluPro354045GlySerGluThrSerAspAlaLysSerThrProThrAlaGluAspVal505560ThrAlaProLeuValGluGluArgAlaProAspLysGinAlaThrAla65707580GinSerHisThrGlulieProGluGlyThrThrAlaGluGluAlaGly859095lieGlyAspThrProAsnMetGluAspGinAlaAlaGlyHisyalThr100105110GinGluProGinLysValGlulie.PheSerGinSerLeuLeuValGlu115120125ProGlyArgArgGluGlyGinAlaProAspSerGlylieSerAspTrp130135140ThrHisGinGinValProSerMetSerGlyAlaProLeuProProGin"5150155160GlyLeuArgGluAlaThrH'isGinProLeuGlyThrArgProGluAsp165170175ValGluArgSerHisProAlaSer.GluLeuLeuTrpGinGluSerPro180185190GinLysGluAlaTrpGlyLysAspArgLeuGlySerGluGluGluVal195200205AspGluAsplieThrMetAspGluSerSerGinGluSerProProSer21<j215220GinAlaSerLeuAlaProGlyThrAlaThrProGinAlaArgSerVal225230235240SerAlaSerGlyValSerGlyGluThrThrSerlieProGlyPhePro245250255AlaGluGlySerlieProLeuProAlaAspPhePheSerLysValSer260265270AlaGluThrGinAlaSerProProGluGlyProGlyThrGlyProSer275'280285GluGluGlyHisGluAlaAlaProGluPheThrPheHisValGlulie29029'5300LysAlaSerAlaProLysGluGinAspLeuGluGlyAlaThrValVal305310315320GlyAlaProAlaGlu.GluGinLysAlaArgGlyProSerValGlyLys325330335GlyThrLysGluAlaSerLeuLeuGluProThrAspLysGinProAla340345350AlaGlyLeuProGlyArgProValSerArgValProGinLeuLysAla355360365ArgValAlaGlyValSerLysAspArgThrGlyAsnAspGluLys.Lys370375380AlaLysGlyAlaAspGlyLysThrGlyAlaLyslieAlaThrPro-Arg385390395400GlyAlaAlaThr.ProGlyGinLysGlyThrSerAsnAlaThrArglie4.0$410415ProAlaLysThrThrProSerProLysThrProProGlySerGlyGlu420425'430ProProLysSerGlyGluArgSerGlyTyrSer^erProGlySerPro435440445GlyThrProGlySerArgSerArgThrProSe;:LeuProThrProPro450455460ThrArgGluProLysLysValAlaValValArgThrProProLysSer465470475480ProSerAlaSerLysSerArgLeuGinThrAlaProValProMetPro485490495AspLeuLysAsnValArgSerLyslieGlySerThrGluAsnLeuLys500505510HisGinProGlyGlyGlyLysValGinlielieAsnLysLysLeuAsp515520'525LeuSerAsnValGinSerLysCysGlySerLysAspAsnlie'LysHis530535540ValProGlyGlyGlySerValHislieValTyrLysProValAspLeu545550555560SerLysValThrSerLysCysGly565'ProGlyGlyGlyGinVal.GluVal580AspArgValGinSerLy.slieGly595600ProGlyGlyGlyAsnLysLyslie610615SerLeu(SlyAsnlieHisHisLys570575LiysSerGluLysI*euAspPheLys585590SerLeuAspAsnlieThrHisVal605GluThrHisLy6LeuThrPheArg620GluAsnAlaLysAlaLysThrAsp625630SerProValValSerGlyAspThr645SerSerThrGlySerlieAspl^et660LeuAlaAspGluValSerAlaSer675680HisGlyAlaGlulieValTyrLys635.640SerProArgHisLeuSerAsnVal650655ValAspSerProGinLeuAlaThr665670LeuAlaLysGinGlyLeu68權(quán)利要求1.對在N-末端上或在N-和C-末端兩者上被截短的人tau蛋白的截短形式具有特異性的抗體，所述截短形式通過與由在ECACC中保藏的具有保藏號00082215和00082216的雜交瘤細(xì)胞系DC-11或DC-11/I產(chǎn)生的抗體結(jié)合而在免疫學(xué)上區(qū)別于正常人tau，并且所述截短形式至少包括由441個氨基酸組成的最長人tau同種型中的第300位氨基酸到第400位氨基酸殘基，所述抗體不與正常tau蛋白結(jié)合，并且所述抗體對所述人tau蛋白的截短形式是特異性的。2.權(quán)利要求1的抗體，其特征在于，所述抗體對所述人tau蛋白的截短形式的特異性依賴于所述人tau蛋白的磷酸化水平。3.由在ECACC中保藏的具有保藏號00082215和保藏號00082216的雜交瘤細(xì)胞系DC-ll或DC-ll/I產(chǎn)生的抗體。4.產(chǎn)生權(quán)利要求l-3中任一項的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。5.在N-末端上或在N-和C-末端兩者上被截短的人tau蛋白的截短形式，所述截短形式通過與由在ECACC中保藏的具有保藏號00082215和00082216的雜交瘤細(xì)胞系DC-11或DC-ll/I產(chǎn)生的抗體結(jié)合而在免疫學(xué)上區(qū)別于正常人tau。6.權(quán)利要求5的人tau蛋白的截短形式，其特征在于，所述人tau蛋白的截短形式通過其作為用于啟動tau聚集的成核中心的能力而進(jìn)一步區(qū)別于正常人tau。7.權(quán)利要求5或6的人tau蛋白的截短形式，其特征在于，所述人tau蛋白的截短形式通過其從正常人tau中解裝配微管的能力而進(jìn)一步區(qū)別于正常人tau。8.權(quán)利要求5-7的人tau蛋白的截短形式，其特征在于，所述人tau蛋白的截短形式至少包括由441個氨基酸組成的最長人tau同種型中的第300位氨基酸到第400位氨基酸殘基。9.用于檢測或分離腦組織或體液樣品中權(quán)利要求5-8中任一項的人tau蛋白的截短形式的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求l-3中任一項的抗體和用于裝載所述樣品的適宜容器。10.權(quán)利要求9的試劑盒，其特征在于，它進(jìn)一步含有用于檢測所述抗體與所述人tau蛋白的截短形式之間結(jié)合情況的工具，其優(yōu)選地是二抗，特別是被特異性標(biāo)記的二抗。11.權(quán)利要求9或10的試劑盒，其特征在于，它進(jìn)一步含有用于對所述人tau蛋白的截短形式定量的工具，其特別是所述人tau蛋白的截短形式的標(biāo)準(zhǔn)制品。12.患者腦組織或體液樣品中權(quán)利要求5-8中任一項的人tau蛋白的截短形式的體外檢測方法，該方法包括下列步驟將所述樣品與權(quán)利要求1-3中任一項的抗體混合，檢測所述抗體與所述人tau蛋白的截短形式之間存在的結(jié)合情況，且可選地測定與所述抗體結(jié)合的所述人tau蛋白的截短形式的量。13.權(quán)利要求1-3的抗體在制備用于治療阿爾茨海默病患者的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及對在構(gòu)象上不同于正常tau且不與正常tau蛋白結(jié)合的異常截短形式的tau蛋白具有特異性的抗體、在構(gòu)象上不同的tau蛋白(“tauons”)和與阿爾茨海默病和相關(guān)tauo病(tauopathies)有關(guān)的診斷和治療方面。文檔編號G01N33/53GK101307107SQ20081010815公開日2008年11月19日申請日期2002年1月29日優(yōu)先權(quán)日2001年2月2日發(fā)明者M(jìn)·諾瓦克申請人:阿克松神經(jīng)科學(xué)研究和發(fā)展股份有限公司