專利名稱：：一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及醫學免疫體外診斷試劑領域，更具體地說，涉及一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：弓形蟲(Toxoplasmagondii)是貓科動物的腸道球蟲，由法國學者Nicolle及Manceaux在剛地橋J止鼠(Ctenodactylusgondii)的脾臟單核細胞內發現，蟲體呈弓形，故命名為剛地弓形蟲。弓形蟲病(toxoplasmosis)又稱弓形體病，是由弓形蟲所引起的一種人畜共患寄生蟲病。據文獻報道，弓形蟲可感染多種哺乳動物，家畜感染率可達10-50%。全球約有10億人感染了弓形蟲，我國人群平均感染率為5.16%。弓形蟲是孕婦宮內感染導致胚胎畸形的五大病原體之一，先天性弓形蟲病患者可導致智力發育障礙、神經系統病變如腦癱、癲癇、腦膜炎、弱智等癥狀。我國每年約有9萬名新生兒受弓形蟲病損害，年均耗資上億元，給社會和家庭帶來了沉重的負擔，同時也嚴重地影響了我國的人口素質。當機體遭受弓形蟲感染時，體內會產生相應的抗體(免疫球蛋白，Ig)，來抵抗病原體，以保護機體功能的正常運轉。一般規律是先產生IgM抗體，然后產生IgG抗體。IgM抗體滴度在達到高峰后很快開始逐漸下降至較低水平，下降后一般不易檢出，而IgG抗體達到高峰后則基本穩定在一個較高的滴度且持續較長時間。臨床上檢查出弓形蟲IgG抗體說明曾經感染過，而且有一定的免疫水平。弓形蟲的病原學診斷方法具有確診意義，但存在操作較困難、靈敏度低等缺點。因而，血清學試驗是目前廣泛應用的重要輔助診斷手段。常用的血清學診斷方法主要包括染色試驗(Sabin-FeldmanDT)、間接血凝試驗(IHA)、放射免疫分析(RIA)以及酶聯免疫分析(EIA)等。染色試驗存在需要活蟲操作的缺點。間接血凝試驗雖然與染色試驗符合率高但重復性差、致敏紅細胞不穩定。放射免疫分析雖然高靈敏、高特異，但存在有效期短、具有放射性污染的缺點。酶聯免疫分析雖然有效期長、特異性強，但存在底物大部分有毒或為致癌物質等缺點。化學發光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)是近十年來在世界范圍內發展非常迅速的非放射性免疫分析，是繼放射免疫分析和酶免疫分析之后發展起來的一種超高靈敏度的微量測定技術。化學發光免疫分析將抗原與抗體的高特異性免疫反應與高靈敏的化學發光檢測技術相結合，具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快速、無污染、儀器簡單經濟等優點。它是放射性免疫分析與普通酶免疫分析理想的取代者，是目前最理想的免疫分析方法。采用酶促增強的化學發光免疫分析原理為樣品中的待測物、酶標記物和固相載體上的包被物特異性結合形成酶標記的抗原-抗體復合物，催化發光底物反應，利用化學反應釋放的自由能激發中間體發光，從而檢測樣品中待測物。化學發光底物液通常由A、B溶液組成。A溶液含有化學發光劑及增強劑，并加入緩沖溶液配制而成。B溶液由氧化劑和緩沖溶液配制而成。在使用前兩者混合，加入到待測溶液中進行反應。異硫氰酸熒光素(FITC)是一種很穩定的熒光素，極易結合在蛋白分子上，不僅標記簡單，而且標記物十分穩定。FITC作為半抗原結合到蛋白質載體上具有很強的免疫原性，FITC單克隆抗體與標記在蛋白質上的FITC反應，不僅特異性高，而且親和力也高于抗原抗體的結合。《免疫學雜志》2003年，19(3)期，230-234頁《FITC標記單克隆抗體檢測icIL-lra的方法研究》公開了通過FITC標記抗體、辣根過氧化物酶標記FITC將其應用于ELISA檢測icIL-lra的方法，使用此方法能有效地放大抗原抗體反應敏感性，在免疫分析中有很大應價值。其中，FITC標記單克隆抗體的方法為將純化的抗IL-lra單克隆抗體在50mmol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液透析后，加入DMSO溶解的FITC,4。C反應16小時后經Sephadex-G50純化后，分裝、避光保存。改良的過碘酸鈉法是制備辣根過氧化物酶標記抗體的通用技術，即為在低pH下以Nal04先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與抗體上的氨基相結合，所獲酶標記抗體的產率高，將近70%的HRP和抗體結合，99%的抗體與酶結合，酶與抗體的活性無重大損失，是目前最常用的方法。抗原、抗體反應要求在最適比例條件下進行，其工作濃度不同對結果影響較大，因此必須對包被抗原或抗體和標記抗體或抗原進行最佳工作濃度的滴定和選擇，通常采用棋盤滴定法(也稱方陣實驗或方陣滴定法)選擇最佳抗原或抗體的工作濃度，即為制備抗原或抗體系列梯度稀釋的包被板，按列分別加入用稀釋的強陽性、弱陽性、陰性參考血清及稀釋液，溫育、洗滌后加入系列梯度稀釋的標記抗體或抗原，溫育、洗滌檢測結果，選擇P/N最大的抗原或抗體稀釋度為最佳工作濃度。微孔板的固相包被一4殳采用物理吸附法，而磁性顆粒固相包被則通常采用縮合劑EDC(碳二亞胺)共價偶聯法，即為通過縮合劑EDC將待包被的抗體氨基或羧基與磁性顆粒上活化的功能團羧基或氨基發生縮合反應，形成共價偶聯物。
發明內容為了解決目前臨床上病原學試驗操作不方便、靈敏度低，放免試劑有效期短、放射性廢棄物污染危害以及酶免試劑受多種因素干擾、底物大部分有毒等不足，本發明提供了一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒。本發明的試劑盒由陰性、陽性對照品，固相載體，弓形蟲抗原標記物，酶結合物，化學發光底物液A、B,以及濃縮洗滌液組成，其中，所述的固相載體為包被FITC抗體的微孔板或f茲性顆粒，弓形蟲抗原標記物為FITC標記的弓形蟲抗原，酶結合物為辣根過氧化物酶標記的抗-人IgG單克隆抗體。所述的化學發光底物液A含有1~20mmol/L魯米諾、0.1~0.5mmol/L4-鞋基聯苯、0.01~0.1mmol/L4-碘代苯基硼酸、50500mmol/LpH8.0~10.0硼酸緩沖溶液。所述的化學發光底物液B含有1~5mmol/L過氧化脲、0.05~0.5%(體積)吐溫20、10-50mmol/LpH7.0~7.6磷酸鹽緩沖溶液。所述的濃縮洗滌液含有12~20%(重量)NaCl、0.1~0.7%(重量)KC1、0.05~0.2%(體積)吐溫20、50~500mmol/LpH7.2~7.6Tris畫HCl緩沖液，使用時用蒸餾水20倍稀釋。使用本發明的試劑盒檢測弓形蟲IgG抗體，操作簡便，靈敏度高，特異性好，與病原學檢驗結果符合度極高。在上述技術方案的基礎上，優選方案為所述的化學發光底物液A含有10mmol/L魯米諾、0.3mmol/L4-羥基聯苯、0.05mmol/L4-碘代苯基硼酸、200mmol/LpH8.0~10.0硼酸緩沖液。所述的化學發光底物液B含有3.5mmol/L過氧化脲、0.1%(體積)吐溫20、20mmol/LpH7.0~7.6磷酸鹽緩沖液。在上述技術方案的基礎上，優選方案為所述的濃縮洗滌液含有16%(重量)NaCl、0.4%(重量)KC1、0.1°/。(體積)吐溫20、200mmol/LpH7.4Tris-HCl緩沖液，使用時用蒸餾水20倍稀釋。本發明還提供了一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒的制備方法，包括以下步驟A、包被固相載體的制備用含0.54)Lig/mLFITC抗體20mmol/LpH7.27.4磷酸鹽緩沖液包被固相載體，2~8°C包被18~20小時后，用含20%(體積)小牛血清、5%(重量)蔗糖的20mmol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液封閉18~20小時，棄盡封閉液后抽濕，28。C干燥18~20小時，加入干燥劑密封；B、FITC標記弓形蟲抗原的制備將用50mmol/LpH9.6碳酸緩沖液透析的弓形蟲抗原加入DMSO溶解的FITC，反應終止后純化、分裝、低溫避光保存；采用棋盤滴定法選擇最佳的FITC標記抗原工作濃度，并溶解于1%(重量)牛血清白蛋白，10mmol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液中以制備FITC標記的弓形蟲抗原工作溶液；C、辣根過氧化物酶標記抗-人IgG單克隆抗體溶液的制備采用改良過碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶標記抗-人IgG單克隆抗體，采用棋盤滴定法選擇最佳的酶標抗體工作濃度，并溶解于1%(重量)牛血清白蛋白，10mmol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液中以制備酶標抗體工作溶液；D、發光底物液的制備化學發光底物液A含有:魯米諾4-羥基聯苯4-硪代苯基硼酸硼酸緩沖液化學發光底物液B含有:過氧化脲1~20mmol/L0.1~0.5mmol/L0.01~0.1mmol/L50500mmol/LpH8.0~10.0;l'~5mmol/L12~20%(重量)0.1~0,7%(重量)0.05~0.2%(體積)50~500mol/LpH7.2~7.60.05~0.5%(體積)1050mmol/LpH7.0~7.6;吐溫20磷酸鹽緩沖溶液E、濃縮洗滌液的制備濃縮洗滌液含有NaClKC1吐溫20Tris-HC1緩沖液使用時用蒸餾水20倍稀釋；F、陰性、陽性對照品的制備收集弓形蟲IgG抗體、HBsAg、HIV(l+2)抗體、TP抗體、HCV抗體為陰性的正常人血清過濾除菌、分裝、低溫儲存。收集弓形蟲IgG抗體陽性，HBsAg、fflV(l+2)抗體、TP抗體、HCV抗體為陰性的患者血清過濾除菌、分裝、低溫儲存。該方法便于生產，易于監控生產過程，保證了批次間的穩定性。在上述技術方案的基礎上，步驟A、包被固相載體還可以采用以下方法制備以磁性顆粒作為固相載體，以EDC共價偶聯法將FITC抗體偶聯到磁性顆粒表面。在上述技術方案的基礎上，優選方案為，所述的化學發光底物液A含有魯米諾4-羥基聯苯4-碘代苯基硼酸硼酸緩沖溶液所述的化學發光底物液B含有:過氧化脲1Ommol/L0.3mmol/L0.05mmol/L200mmol/L3.5mmol/LpH8.0~10.0;吐溫200.1%(體積)磷酸鹽緩沖溶液20mmol/LpH7.0-7.6;在上述技術方案的基礎上，優選方案為，所述的濃縮洗滌液含有:NaClKC1吐溫20Tris-HCl緩沖液使用時用蒸餾水20倍稀釋。16%(重量)0.4%(重量)0.1°/。(體積)200mmol/LpH7.2~7.具體實施例方式以下所舉實例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。實施例1一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒的制備A、包被板制備用含2|ug/mLFITC抗體的20mmol/LpH7.4磷酸緩沖液溶液，以100(iL/孔體積包被微孔板，28。C包被18~20小時后，用含20%(體積)小牛血清、5%(重量)蔗糖的20mmol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液120iuL/孔封閉18~20小時，甩盡封閉液后抽濕，28。C干燥18-20小時，加入干燥劑密封并檢查密封的鋁箔袋是否漏氣，置于28'C保存。B、FITC標記弓形蟲抗原的制備a)、FITC標記將弓形蟲抗原2mg用50mmol/LpH9.6碳酸緩沖液在28。C條件下透析，將FITC溶于二曱基亞砜(DMSO)中，終濃度為lmg/mL,按弓形蟲抗原FITC=lmg:150|ag的比例將FITC二曱基亞砜溶液緩慢加入弓形蟲抗原溶液中混合均勻，暗處4°C反應8小時，加入5mol/L的NH4C1溶液至終濃度50mmol/L,4°C終止反應2小時，將FITC標記的弓形蟲抗原溶液在0.05mol/LpH7.2的磷酸鹽緩沖液中透析至透析液清亮，加入0.1%(重量)NaN3、1%(重量)牛血清白蛋白(BSA)pH7.2的10mmol/L磷酸鹽緩沖液中，4。C暗處保存。b)、FITC標記抗原稀釋液的配制將0.2gNaH2P04.2H20、2.9gNa2HP04.12H20和10g牛血清白蛋白(BSA)加入潔凈容器中，用雙蒸水定溶至1000mL。c)、FITC標i己抗原工作液的配制將制備的FITC標記抗原用稀釋液分別稀釋成不同濃度，使用棋盤滴定法選擇出最佳的稀釋度為1:5500。C、辣根過氧化物酶標記抗-人IgG單克隆抗體的制備a)、標記方法采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶與抗-人IgG單克隆抗體偶^:,加入50%甘油、置于-20。C凍存。b)、酶標記物稀釋液的配制將0.2gNaH2P04.2H20、2.9gNa2HP04.12H20和10g牛血清白蛋白(BSA)加入潔凈容器中，用雙蒸水定溶至lOOOmL。c)、酶標記物工作液的配制將制備的酶標記物用稀釋液分別稀釋成不同濃度，使用棋盤滴定法選擇出最佳的稀釋度為1:6000。D、發光底物液的制備a)、化學發光底物液A釆用如下配方1Ommol/L魯米諾、0.3mmol/L4-羥基聯苯、O.05mmol/L4-碘代苯基硼酸、pH8.0~10.0200mmol/L硼酸緩沖液。將1.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯苯、0.012g4-碘代苯基硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂加入潔凈容器中用雙蒸水溶解，調整pH值為8.0~10.0,用雙蒸水定溶至1000mL。b)、化學發光底物液B采用如下配方3.5mmol/L過氧化脲、0.1%(體積)吐溫20、pH7.0-7.620mmol/L磷酸鹽緩沖液。將0.329g過氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP04.12H20、8.74gNaH2P04.2H20加入潔凈容器中用雙蒸水溶解，調整pH值為7.0-7.6，用雙蒸水定溶至lOOOmL。使用時將底物液A、B等體積混合。E、濃縮洗涂液的制備采用如下配方16%(重量)NaCl、0.4%(重量)KCl、0.1%(體積)吐溫20、pH7.4200mmol/LTris-HCl緩沖液。將160gNaCl、4gKC1、24.2g三羥曱基氨基曱烷(Tris)、lml吐溫20溶于900ml雙蒸水中，用HC1調整pH至7.4,用雙蒸水定溶至lOOOmL。使用時用雙蒸水20倍稀釋。F、陰性、陽性對照品的制備收集經ELISA法檢測弓形蟲IgG抗體、HBsAg、HIV(l+2)抗體、TP抗體、HCV抗體陰性的正常人血清6份以上，過濾除菌、分裝、低溫儲存。收集經ELISA法檢測弓形蟲IgG抗體陽性，HBsAg、HIV(l+2)抗體、TP抗體、HCV抗體陰性的患者血清6份以上，適當稀釋后過濾除菌、分裝、低溫儲存。實施例2一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒的制備以磁性顆粒作為固相載體，以EDC法將FITC抗體偶聯到磁性顆粒表面，以含12%(重量)NaCl、0.1%(重量)KC1、400mmol/LpH7.2Tris-HCl緩沖液為濃縮洗滌液，其余均以與實施例1相同的方法制備弓形蟲IgG抗體化學發光免疫分析試劑盒。實施例3一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒的制備(1)、發光底物液的制備a)、化學發光底物液A釆用如下配方1mmol/L魯米諾、0.1mmol/L4-羥基聯苯、0.01mmol/L4-碘代苯基硼酸、50mmol/LpH8.0~10.0硼酸緩沖液。將0.177g魯米諾、0.017g4-羥基聯苯、0.0025g4-碘代苯基硼酸、2.85g硼酸、1.225g硼砂加入潔凈容器中用雙蒸水溶解，調整pH值為8.0-10,用雙蒸水定溶至1000mL。b)、化學發光底物液B采用如下配方1mmol/L過氧化脲、0.05%(體積)吐溫20、10mmol/LpH7.0-7.6磷酸鹽緩沖液。將0.094g過氧化脲、0.5mlTween20、25.79gNa2HP04■12H20、4.37gNaH2P04.2H20加入潔凈容器中用雙蒸水溶解，調整pH值為7.0-7.6，用雙蒸水定溶至lOOOmL。使用時將底物液A、B等體積混合。(2)、濃縮洗滌液的制備采用如下配方12%(重量)NaCl、0.1%(重量)KCl、0.05%(體積)吐溫20、50mmol/LpH7.4Tris-HCl緩沖液。將120gNaCl、lgKCl、6.05g三羥曱基氨基曱烷(Tris)、0.5ml吐溫20溶于900ml雙蒸水中，用HC1調整pH至7.2,用雙蒸水定溶至lOOOmL。使用時用雙蒸水20倍稀釋。其余步驟同實施例1。實施例4一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒的制備(1)、發光底物液的制備a)、化學發光底物液A采用如下配方20mmol/L魯米諾、0.5mmol/L4-羥基聯苯、0.1mmol/L4-石典代苯基硼酸、500mmol/LpH8.0~10.0硼酸緩沖液。將3.54g魯米諾、0.0857g4-羥基聯苯、0.025g4-碘代苯基硼酸、28.5g硼酸、12.25g硼砂加入潔凈容器中用雙蒸水溶解，調整pH值為8.0-10，用雙蒸水定溶至1000mL。b)、化學發光底物液B采用如下配方5mmol/L過氧化脲、0.5%(體積)吐溫20、50mmol/LpH7.0~7.6磷酸鹽緩沖液。將0.47g過氧化脲、5mlTween20、128.95gNa2HP0412H20、21.85gNaH2P04.2H20加入潔凈容器中用雙蒸水溶解，調整pH值為7.0-7.6,用雙蒸水定溶至lOOOrnL。使用時將底物液A、B等體積混合。(2)、濃縮洗滌液的制備釆用如下配方20%(重量)NaCl、0.7%(重量)KCl、0.2%(體積)吐溫20、50mmol/LpH7.4Tris-HCl緩沖液。將200gNaCl、7gKCl、60.5g三羥曱基氨基甲烷(Tris)、2ml吐溫20溶于900ml雙蒸水中，用HC1調整pH至7.6,用雙蒸水定溶至lOOOmL。使用時用雙蒸水20倍稀釋。其余步驟同實施例1。實施例5一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒的使用方法。(1)、取出實施例1中所制備的弓形蟲IgG抗體化學發光免疫分析診斷試劑盒，室溫平衡15-30分鐘。(2)、將待測樣本用生理鹽水1:100預稀釋。(3)、在包被板分別加入陰性對照、陽性對照以及預稀釋的待測樣本50iaL,然后每孔分別加入50juLFITC標記弓形蟲抗原，振蕩混勻，37。C溫育30分鐘。(4)、用稀釋后的洗滌液洗5次，每孔加滿洗滌液，每次浸泡10秒，最后在干凈的吸水紙上拍干。(5)、各孔加辣才艮過氧化物酶標記抗-人IgG單克隆抗體100juL,振蕩混勻，37。C溫育30分鐘。(6)、用稀釋后的洗滌液洗5次，每孔加滿洗滌液，每次浸泡10秒，最后在干凈的吸水紙上拍干。(7)、各孔加入混合后的化學發光底物液(發光底物液A、B按1:1混合)100juL,室溫(2025°C)避光反應5分鐘。(8)加化學發光底物液后的第530分鐘內測量，在化學發光測量儀上依序測量各孔的發光強度(RLU),測量時間l秒/孔。(9)、Cutoff值=2.1^,RLU值>Cutoff值則樣本判定為陽性樣本；RLU值<Cutoff值則樣本判定為陰性樣本。實施例6一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒的使用方法。(1)、將實施例2中所制備的弓形蟲IgG抗體化學發光免疫分析診斷試劑盒室溫平衡15-30分鐘。(2)、將待測樣本用生理鹽水1:100預稀釋。(3)、將陰性、陽性對照以及待測樣本50juL分別加入編號的圓底聚苯乙烯試管，然后每管分別加入FITC標記抗原50nL、f茲性顆粒100nL,37X:振蕩反應15分鐘。(4)、將試管架置于磁分離器上分離lmin，然后倒轉分離器倒出上清液，將倒轉的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管加入洗滌液500|liL，充分混勻，置于磁分離器上分離1min,倒出上清液，將倒轉的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體，重復4次。(5)、各管加酶標抗體lOO)aL,37。C振蕩反應15分鐘。(6)、重復步驟(4)。(7)、各管加入混合后的化學發光底物液(發光底物液A、B按1:1混合)200400|aL,充分混勻，置于磁分離器內，待》對鼓粒富集于底部后，暗處放置5min,在化學發光測量儀上依序測量各孔的發光強度(RLU),測量時間l秒/管；Cutoff值^2.1^,RLU值》Cutoff值則樣本判定為陽性樣本；RLU值〈Cutoff值則樣本判定為陰性樣本。實施例7采用實施例1中所制備的弓形蟲IgG抗體化學發光免疫分析診斷試劑盒按實施例5所述方法對100例育齡婦女孕前篩查血樣進行才企測，同時采用5朱海經濟特區海泰生物制藥有限公司生產的國藥準字S20040019號弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法)作為對照，比較檢測結果。結果如下表1本發明試劑盒與酶聯免疫試劑測定弓形蟲IgG抗體結果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>從實驗結果可看出，本發明弓形蟲IgG抗體化學發光免疫分析診斷試劑盒與對照試劑盒;f全測結果一致。實施例8采用實施例2中所制備的弓形蟲IgG抗體化學發光免疫分析診斷試劑盒按實施例6所述方法對87例育齡婦女孕前篩查血樣進行檢測，同時釆用珠海經濟特區海泰生物制藥有限公司生產的國藥準字S20040019號弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法)作為對照，比較檢測結果。結果如下表2本發明試劑盒與酶聯免疫試劑測定弓形蟲IgG抗體結果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>從實驗結果可看出，本發明弓形蟲IgG抗體化學發光免疫分析診斷試劑盒與對照試劑盒兩種檢測方法的符合率為100%。實施例9采用實施例3中所制備的弓形蟲IgG抗體化學發光免疫分析診斷試劑盒按實施例5所述方法對109例育齡婦女孕前篩查血樣進行檢測，同時采用珠海經濟特區海泰生物制藥有限公司生產的國藥準字S20040019號弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法)作為對照，比較檢測結果。結果如下表3本發明試劑盒與酶聯免疫試劑測定弓形蟲IgG抗體結果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>—1070107本發明試劑盒+022合計1072109從實驗結果可看出，本發明弓形蟲IgG抗體化學發光免疫分析診斷試劑盒與對照試劑盒兩種檢測方法的符合率為100%。以上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。權利要求1.一種檢測弓形蟲IgG抗體化學發光免疫分析診斷試劑盒，由陰性、陽性對照品，固相載體，弓形蟲抗原標記物，酶結合物，化學發光底物液A、B，以及濃縮洗滌液組成，其特征在于，所述的固相載體由FITC抗體包被，弓形蟲抗原由FITC標記，酶結合物為辣根過氧化物酶標記的抗-人IgG單克隆抗體。2.根據權利要求1所述的化學發光免疫分析診斷試劑盒，其特征在于，所述的固相載體為包被FITC抗體的微孔板或磁性顆粒。3.根據權利要求1所述的化學發光免疫分析診斷試劑盒，其特征在于，所述的化學發光底物液A含有.諾1~20mmol/L4-羥基聯苯0.1~0.5mmol/L4-石典代苯基硼酸0.01—0.1mmol/L硼酸纟爰沖;容液50~500mmol/LpH8.0-10.0;所述的化學發光底物液B含有過氧化脲1~5mmol/L吐溫200.05~0.5%(體積)磷酸鹽緩沖溶液1050mmol/LpH7.0~7.6。4.根據權利要求1所述的化學發光免疫分析診斷試劑盒，其特征在于，所述的化學發光底物液A含有魯米諾10mmol/L4-羥基耳關苯0.3mmol/L4-碘代苯基硼酸0.05mmol/L硼酸緩沖溶液200mmol/LpH8.0-10.0;所述的化學發光底物液B含有'.過氧化脲3.5mmol/L吐溫200.1%(體積)磷酸鹽緩沖溶液20mmol/LpH7.0~7.6。5.根據權利要求1-4之任意一項所述的化學發光免疫分析診斷試劑盒，其特征在于，其中的濃縮洗滌液含有NaCl12~20%(重量)KC10.1~0.7%(重量)吐溫200.05~0.2%(體積)Tris-HCl緩沖液50500mmol/LpH7.2~7.6。6.根據權利要求5所述的化學發光免疫分析診斷試劑盒，其特征在于，所述的濃縮洗滌液含有NaCl16%(重量)KC10.4%(重量)吐溫200.1%(體積)Tris畫HCl緩沖液200mmol/LpH7.2~7.6。7.檢測弓形蟲IgG抗體化學發光免疫分析診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟A、包被固相載體的制備用含0.54嗎/mLFITC抗體的20mmol/LpH7.27.4磷酸鹽緩沖液包被固相載體，28。C包被18~20小時后，用含20%(體積)小牛血清、5%(重量)蔗糖的20mmol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液封閉18~20小時，棄盡封閉液后抽濕，28。C干燥18~20小時，加入干燥劑密封；B、FITC標記弓形蟲抗原的制備將用50mmol/LpH9.6石友酸鹽緩沖液透析后的弓形蟲抗原加入DMSO溶解的FITC,反應終止后純化、分裝、低溫避光保存；采用棋盤滴定法選擇FITC標記抗原工作濃度，并溶解于1%(重量)牛血清白蛋白，10mmol/LpH7.2磷酸鹽ll沖液中以制備FITC標記的弓形蟲抗原工作溶液；C、辣根過氧化物酶標記抗-人IgG單克隆抗體溶液的制備釆用改良過碘酸鈉法制備辣根過氧化物酶標記抗-人IgG單克隆抗體，采用棋盤滴定法選擇最佳的酶標抗體工作濃度，并溶解于1%(重量)牛血清白蛋白，10mmol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液中以制備酶標抗體工作溶液；D、發光底物液的制備1~20mmol/L0.1~0.5mmol/L0.01~0.1mmol/L50500mmol/LpH8.0~10.0;1~5mmol/L0.05~0.5%(體積)10~50mmol/LpH7.0—7.6;化學發光底物液A含有魯米諾4-羥基聯苯4-碘代苯基硼酸硼酸緩沖溶液化學發光底物液B含有過氧化脲吐溫20磷酸鹽緩沖溶液E、濃縮洗滌液的制備濃縮洗滌液含有NaCl12~20%(重量)KC10.1~0.7%(重量)吐溫200.05~0.2%(體積)Tris畫HCl緩沖液50~500mmol/LpH7.2~7,6;F、陰性、陽性對照品的制備弓形蟲IgG抗體、HBsAg、HIV(1十2)抗體、TP抗體、HCV抗體為陰性的正常人血清過濾除菌、分裝、低溫儲存；弓形蟲IgG抗體陽性，HBsAg、HIV(l+2)抗體、TP抗體、HCV抗體為陰性的患者血清過濾除菌、分裝、低溫儲存。8.根據權利要求7所述的化學發光免疫分析診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，所述包被固相載體由如下方法制備以磁性顆粒作為固相載體，以EDC共價偶聯法將FITC抗體偶聯到磁性顆粒表面。9.根據權利要求7-8之任意一項所述的化學發光免疫分析診斷試劑盒的制備方法，其特征在于，所述的化學發光底物液A含有魯米諾10mmol/L4-羥基聯苯0.3mmol/L4-石典代苯基硼酸0.05mmol/L硼酸緩沖溶液200mmol/LpH8.0-10.0;所述的化學發光底物液B含有過氧化脲3.5mmol/L吐溫200.1%(體積)磷酸鹽緩沖溶液20mmol/LpH7.0~7.6;所述的濃縮洗滌液含有NaCl16%(重量)KC10.4%(重量)吐溫200.1%(體積)Tris-HCl緩沖液200mmol/LpH7.2~7.6。全文摘要本發明公開了一種檢測弓形蟲IgG抗體的化學發光免疫分析診斷試劑盒，由陰性、陽性對照品，固相載體，弓形蟲抗原標記物，酶結合物，化學發光底物液A、B，以及濃縮洗滌液組成。本發明還公開了一種弓形蟲IgG抗體化學發光免疫分析診斷試劑盒的制備方法。使用本發明制備的試劑盒檢測弓形蟲IgG抗體，具有操作簡便，靈敏度高，特異性好，與病原學檢驗結果符合度極高等特點，可以作為孕前檢驗的重要指標之一，對于提高出生人口素質、優生優育具有意義。文檔編號G01N33/577GK101373189SQ20081010550公開日2009年2月25日申請日期2008年4月29日優先權日2008年4月29日發明者于尚永,唐寶軍,宋勝利,應希堂,彭京勝,胡國茂,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術有限公司