專利名稱：：一種檢測弓形蟲IgM抗體的化學發光免疫分析測定試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及醫學免疫學與體外診斷
技術領域：
，具體地，本發明提供了一種FITC-抗FITC抗體間接包祐j支術結合化學發光免疫分析技術測定弓形蟲IgM抗體測定試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：弓形蟲(Toxoplasmagondii)是貓科動物的腸道球蟲，由法國學者Nicolle及Manceaux在剛地梳趾鼠(Ctenodactylusgondii)的脾臟單核細胞內發現，蟲體呈弓形，故命名為剛地弓形蟲。弓形蟲病(toxoplasmosis)又稱弓形體病，是由弓形蟲所引起的一種人畜共患寄生蟲病。據文獻報道，弓形蟲可感染多種哺乳動物，家畜感染率可達10-50%。全球約有10億人感染了弓形蟲，我國人群平均感染率為5.16%。弓形蟲是孕婦宮內感染導致胚胎畸形的五大病原體之一，先天性弓形蟲病患者可導致智力發育障礙、神經系統病變如腦癱、癲癇、腦膜炎、弱智等癥狀。我國每年約有9萬名新生兒受弓形蟲病損害，年均耗資上億元，給社會和家庭帶來了沉重的負擔，同時也嚴重地影響了我國的出生人口素質。弓形蟲感染后最早出現的抗體為IgM抗體，若在血清中檢測到IgM抗體則提示為急性弓形蟲感染，隨后出現的IgG抗體在感染后2-5個月逐漸達到高峰，并可持續較長時間存在，IgG抗體陽性說明曾感染弓形蟲，一般多為慢性感染。目前，對弓形蟲致畸已引起普遍認識，對異常產史、異常接觸史或有臨床癥狀者進行監測、制定有效的防治措施以有效地加強對育齡婦女弓形蟲感染的檢測，對于提高出生人口素質，搞好計劃生育和優生優育具有極其重要的意義。目前，弓形蟲的實驗室診斷方法主要包括病原學試驗和血清學試驗。病原學試驗具有確診意義，但存在操作較困難、靈敏度低等缺點。因而，血清學試驗是目前廣泛應用的重要輔助診斷手段。常用的血清學診斷方法主要包括染色試驗(Sabin-FeldmanDT)、間接血凝試驗(IHA)、放射免疫分析(RIA)以及酶聯免疫分析(EIA)等。其中染色試驗存在需要活蟲操作的缺點，間接血凝試驗雖然與DT符合率高但重復性差、致敏紅細胞不穩定，放射免疫分析雖然高靈敏、高特異但存在有效期短、放射性污染的缺點，酶聯免疫分析雖然有效期長、特異性強但存在底物大部分有毒或為致癌等缺點。化學發光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)是近十年來在世界范圍內發展非常迅速的非放射性免疫分析，是繼放射免疫分析和酶免疫分析之后發展起來的一種超高靈敏度的微量測定技術。具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快速、標記物穩定性好、無污染、儀器簡單經濟等優點。它是放射性免疫分析與普通酶免疫分析理想的取代者，是目前免疫定量分析最理想的方法，異硫氰酸熒光素(FITC)是一種很穩定的熒光素，極易結合在蛋白分子上，不僅標記簡單，而且標記物十分穩定。FITC作為半抗原結合到蛋白質載體上具有很強的免疫原性，抗FITC單克隆抗體與標記在的蛋白質上FITC反應，不僅特異性高，而且親和力也高于抗原抗體的結合。本發明以抗FITC抗體包被固相載體，通過FITC-抗FITC抗體系統間接包被FITC標記的蛋白，不僅便于放大生產、易于監控生產過程，而且避免了直接包被固相存在的活性損失大、工藝優化繁瑣等缺點，同時保證了批次間的穩定性。本發明解決了目前臨床上病原學試驗操作不方便、靈敏度低，放免試劑有效期短、放射性廢棄物污染危害以及酶免試劑受多種因素干擾、底物大部分有毒等不足。本發明的弓形蟲IgM抗體化學發光測定試劑盒，經臨床實驗證明，操作簡便，靈敏度高，特異性好，與病原學檢驗結果符合度極高，提供了一種高效、靈敏、穩定、特異的弓形蟲急性感染的血清學診斷技術。
發明內容本發明的目的是提供一種FITC-抗FITC抗體間接包被技術結合化學發光免疫分析測定弓形蟲IgM抗體的化學發光測定試劑盒及其制備方法。本發明的試劑盒由弓形蟲IgM抗體陰性對照、陽性對照、抗FITC抗體包被的固相載體、FITC標記的抗人p鏈單克隆抗體、辣^^過氧化物酶標記的弓形蟲抗原、化學發光底物以及濃縮洗涂液組成。本發明的另一目的為提供了上述試劑盒的制備方法。(1)陰性對照的制備收集經ELISA法檢測弓形蟲IgM抗體、HIV(l+2)抗體、HCV抗體、TP抗體、HBsAg為陰性的正常人血清6份以上，過濾除菌、分裝、低溫儲存。(2)陽性對照的制備收集經ELISA法;險測弓形蟲IgM抗體陽性，HIV(l+2)抗體、HCV抗體、TP抗體、HBsAg陰性的患者血清6份以上，過濾除菌、分裝、低溫儲存。(3)抗FITC抗體包被固相載體的制備用0.020MpH值為7.4的磷酸鹽緩沖液配制成所需濃度的抗FITC抗體包被液，并將包被液負栽于固相載體上，用含20%新生牛血清、5。/。L-巖藻糖的0.02MpH7.4磷酸鹽緩沖液封閉后，抽濕干燥，鋁箔袋密閉，2-8。C保存。其中，所迷包被抗FITC抗體的固相載體為微孔板或磁性顆粒。(4)FITC標記抗體的制備將抗體用pH9.60.05M碳酸鹽緩沖液透析后，與FITC的DMSO溶液避光反應，經50mMNm:i終止反應后，0.02MpH7.4磷酸鹽緩沖液透析、低溫、避光保存。(5)酶標弓形蟲抗原的制備用簡易的過^*酸鈉氧化法將辣#>過氧化物酶與弓形蟲抗原偶聯。(6)化學發光底物的制備基于1000mL所述化學發光底物A液，包括1.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯苯、0.012g4-硤苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值為8.0~10.0;基于lOOOmL所述化學發光底物B液，包括0.329g過氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP04.12H20、8.74gNaH2P04.2H20，其pH值為7.0~7.6。(7)濃縮洗滌液的制備配制含16%NaCl、0.4%KC1、0.1%吐溫20、0."/。Proclin300的0.2MpH7.4Tris-HCl緩沖液作為濃縮洗涂液，使用時按20倍稀釋使用。本發明的試劑盒釆用FITC-抗FITC抗體間接包被技術與化學發光技術相結合，避免了直接物理吸附存在免疫活性損失大、空間位阻、精密性差等缺點，而且簡化工藝優化、便于監控生產過程。本發明的試劑盒利用FITC-抗FITC抗體系統間接包被抗人n鏈單抗，與待測樣本中弓形蟲IgM抗體反應形成固相抗FITC抗體-FITC標記的抗人ja鏈單抗復合物，再與辣根過氧化物酶標記的弓形蟲抗原反應形成固相抗FITC抗體-FITC標記的抗人H鏈單抗-辣根過氧化物酶標記的弓形蟲抗原夾心復合物，然后催化底物化學發光，通過檢測發光底物產生的光信號代替酶免疫分析中的顯色底物從而檢測血清中弓形蟲IgM抗體的含量，大大提高了檢測靈敏度，避免了酶免試劑存在的底物大部分有毒或致癌等缺點，并具有反應速度快、成本低、易儲存等優勢。本發明的試劑盒可以非常專一地檢測出急性感染弓形蟲后人體中的弓形蟲IgM抗體含量。具體實施例方式實施例1制備本發明的弓形蟲IgM抗體化學發光免疫分析測定試劑盒一、陰性對照、陽性對照的制備1、陰性對照的制備收集經ELISA法檢測弓形蟲IgM抗體、HIV(1+2)抗體、HCV抗體、TP抗體、HBsAg陰性的正常人血清6份以上，過濾除菌、分裝、低溫儲存。2、陽性對照的制備收集經ELISA法檢測弓形蟲IgM抗體陽性，HIV(1+2)抗體、HCV抗體、TP抗體、HBsAg陰性的患者血清6份以上，過濾除菌、分裝、低溫儲存。二、抗FITC包被微孔板的制備1、包被包被液的配制將5.8gNa2HP0412H20和0.59gNaH2P042H20用雙蒸水定溶至IOO(M。將包被液中加入適量的抗FITC，混勻后以每孔100^1包被微孔板，置于2-8'C包被18-24h。2、封閉封閉液的配制將5.8gNa風12H20、0.59gNaH2P04.2H20、200ml新生牛血清、50gL-巖藻糖、lmlProclin300加入潔凈容器中，溶解混勻、最后用雙蒸水定溶至1000ml。每孔分別加入封閉液120^1,置于2-8。C封閉18-24h。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。28'C除濕、干燥24小時后，用鋁箔袋封袋，貼簽后置2-8t:保存。三、FITC標記抗人p鏈抗體的制備1、FITC標記工藝(1)、配制pH9.60.05M碳酸鹽緩沖液將2.94gNaHC03、1.59g化20)3加入潔凈容器中，加雙蒸水定容至1000ml。(2)、將2mg/ml抗體用pH9.6的碳酸鹽緩沖液在2-8'C條件下透析三次。(3)、將FITC溶于DMSO中，濃度為lmg/ml。(4)、按蛋白質FITC-lmg:150ug的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中，邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻，避光2-8'C反應8小時。(5)、加入5M的NH4C1至終濃度50mM,2-8'C終止反應2小時。(6)、將標記物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。(7)、標記物的鑒定蛋白濃度(mg/ml)=[A28。-0.31xA州]/1.4=1.5mg/ralF/P比例:3.1xA495/[A28。-0.31xA495]=4，該值應介于2.5-6.5之間。(8)、FITC標記蛋白應置于pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入0.l%NaN3、1%BSA,2-8'C避光保存。2、FITC標記抗體稀釋液的配制將0.2gNaH2P042H20、2,9gNa2HP04■12眼10gPEG20000和lmlProclin300加入潔凈容器中，用雙蒸水定溶至1000ml。3、FITC標記抗體工作液的配制將制備的FITC標記抗體用稀釋液分別稀釋成不同濃度，使用棋盤滴定法選擇出最佳的稀釋度為1:5000。四、辣根過氧化物酶標記弓形蟲抗原的制備1、弓形蟲抗原的標記工藝釆用EDC法將辣根過氧化物酶與弓形蟲抗原偶聯，加入50y。甘油、置于-20。C凍存2、弓形蟲抗原標記物稀釋液的配制將0.2gNaH2P042眼2.9gNa2HP0412H20、10gPEG20000和lmlProclin300加入潔凈容器中，用雙蒸水定溶至lOOOml。3、弓形蟲抗原標記物工作液的配制將制備的弓形蟲抗原標記物用稀釋液分別稀釋成不同濃度，使用棋盤滴定法選擇出最佳的稀釋度為1:4000。五、化學發光底物A液魯米諾1.7716g4-羥基聯苯0.05lg4-硤苯硼酸0.012g硼酸11.4g硼砂、4.9g雙蒸水定溶至1000mLpH8.0-10.0六、化學發光底物B液過氧化脲0.329gTween20lmlNa2HP0412H2051.58gNaH2P042H208.74g雙蒸水定溶至1000mLpH7.0-7.6使用時A液與B液等比例混合。七、濃縮洗滌液將160gNaCl、4gKCl、24.2g三羥曱基絲曱烷(Tris)、lml吐溫20、lralProclin300溶于900ml雙蒸水中，用HCl調整pH至7,4,用雙蒸水定溶至lOOOml。使用時用雙蒸水稀釋20倍。本發明的發明人對試劑盒的反應模式和反應條件進行了系統的優化，并就不同的反應時間對試驗結果的影響進行了試驗，確定最適合的反應時間。通過對化學發光底物液發光持續時間的測定及不同發光時間對測定值的影響試驗表明在加入化學發光底物液后5-30分鐘之間進行測量為最佳，其結果也較為準確。實施例2制備本發明的弓形蟲IgM抗體化學發光免疫分析測定試劑盒除以磁性顆粒作為固相載體，以戊二醛法將抗FITC偶聯到磁性顆粒表面外，其余均以與實施例1相同的方法制備弓形蟲IgM抗體化學發光免疫分析測定試劑合JUL。實施例3本發明的試劑盒的使用方法以上實施例1制備的弓形蟲IgM抗體化學發光免疫分析測定試劑盒的具體操作如下1)自2-8。C冰箱中取出弓形蟲IgM測定試劑盒(化學發光法)，室溫平衡30分鐘；2)將待測樣本用生理鹽水按1:1000預稀釋；3)每次實驗設TOXIgM陰性對照3孔、陽性對照2孔。分別加入陰性對照、陽性對照以及預稀釋的待測樣本50ixl，然后每孔分別加入50nlFITC標記物，振蕩混勻，37。C溫育30分鐘；4)用稀釋后的洗滌液洗5次，每孔加滿洗滌液，每次浸泡10秒，最后在千凈的吸水紙上拍干；5)各孔加酶標記物IOOmI，振蕩混勻，37。C溫育30分鐘；6)用稀釋后的洗滌液洗5次，每孔加滿洗涂液，每次浸泡10秒，最后在千凈的吸水紙上拍干；5)各孔加化學發光底物液A、B各50ji1，室溫(20~25°C)避光反應5分鐘。6)必須于加化學發光底物液后的第5~30分鐘內測量，在化學發光測量儀上依序測量各孔的發光強度(RLU)，測量時間1秒/孔。7)Cutoff值=2.1而，若待測樣本的RLU值>Cutoff值則樣本判定為陽性樣本；RLU值<Cutoff值則樣本判定為陰性樣本。實施例4本發明的試劑盒臨床試驗評價用實施例1制備的試劑盒對81例正常人樣本和確診的弓形蟲急性感染患者樣本45例進行平行檢測，檢測程序和結果判斷嚴格按照實施例3提供的使用方法進行。檢測結果如表1所示表1本發明的試劑盒臨床試驗評價結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表1所述數據表明，本發明試劑盒特異性、敏感性均優良，本發明的試劑盒陽性預測值、陰性預測值均為100%。本發明的試劑盒，可以作為產前優生優育診斷的輔助手段，對于提高出生人口素質，搞好計劃生育和優生優育具有極其重要的意義。權利要求1、一種弓形蟲IgM抗體化學發光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由陰性對照、陽性對照、抗FITC抗體的固相載體、FITC標記的抗人μ鏈單抗、辣根過氧化物酶標記的弓形蟲抗原、化學發光底物和濃縮洗滌液組成。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為微孔板或磁性顆粒。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發光底物為魯米諾或異魯米諾。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液為含16%NaCl、0.4%KC1、0.1%吐溫20、0.1%Proclin300的0.2MpH7.4Tris-HCl緩沖液，使用時用蒸餾水20倍稀釋使用。5、一種制備權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟配制陰性對照、陽性對照，抗FITC抗體包被固相載體，標記單抗、抗原，配制發光底物和濃縮洗滌液，分裝上述組份并組裝為成品。6、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述陰性對照為經ELISA檢測弓形蟲IgM抗體為陰性的正常人血清混合物。7、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述陽性對照為經ELISA檢測弓形蟲IgM抗體陽性患者血清的混合物。8、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述以抗FITC包被固相載體采用以下方法制備用0.020MpH值為7.4的磷酸鹽緩沖液配制成所需濃度的抗FITC包被液，并將包被液負載于固相栽體上，用含20%新生牛血清、5%L-巖藻糖的0.02MpH7.4磷酸鹽緩沖液封閉后，抽濕干燥，鋁箔袋密閉，2-8'C保存。9、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述化學發光底物的配制方法為基于1000mL所述化學發光底物A液，包括1.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯苯、Q.012g4-硤苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值為8.0~10.0。基于lOOOmL所述化學發光底物B液，包括0.329g過氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP0412H20、8.74gNaH2P04.2H20,其pH值為7.0~7.6。10、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述濃縮洗滌液的配方為含16%NaCl、0.4%KC1、0.IV土溫20、0.1%Proclin300的0.2MpH7.4Tris-HCl緩沖液，使用時用雙蒸水20倍稀釋使用。全文摘要本發明公開了一種FITC-抗FITC間接包被技術與化學發光免疫分析技術相結合的弓形蟲IgM抗體測定試劑盒及其制備方法。本發明的試劑盒由陰性對照、陽性對照、抗FITC抗體的固相載體、FITC標記的抗人μ鏈單抗、辣根過氧化物酶標記的弓形蟲抗原、化學發光底物和濃縮洗滌液組成。本發明的試劑盒可以作為產前優生優育診斷的輔助檢測指標，對于提高出生人口素質，搞好計劃生育和優生優育具有極其重要的意義。文檔編號G01N33/543GK101377504SQ200810104140公開日2009年3月4日申請日期2008年4月16日優先權日2008年4月16日發明者唐寶軍,宋勝利,應希堂,彭京勝,胡國茂,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術有限公司