專利名稱：：組織多肽抗原化學發光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發明提供了一種組織多肽抗原化學發光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法，屬于免疫分析醫學領域。
背景技術：
：TPA是瑞典科學家Bjorklund于1957年從各種腫瘤組織中分離出來的一種不含糖和脂肪的蛋白質，系單鏈多肽，分子量約1745KD其結構與細胞角蛋白—和細胞骨痂蛋白相類似，尤其與中角蛋白同源性較高，是Cytokeratins8，18,19的組織多肽片段的復合物，可作為腫瘤增殖分化的標志。TPA的水平反映了細胞增殖、分化和腫瘤的浸潤程度。大量臨床資料表明，TPA在癌癥病人血清中濃度異常升高，但與腫瘤的病理類型關系不密切，可反映癌癥病人腫瘤細胞增殖以及死亡狀況。在一定程度上可根據血清中TPA濃度的高低來判斷癌癥病人的病程。血清TPA在肝癌、胰腺癌、卵巢癌和肺癌中有較高陽性率，從血清中定量測定TPA，對肝癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌有較高的輔助診斷價值，可用于臨床診斷及預后的觀察，同時可以鑒別診斷轉移癌和非轉移癌、腺癌和鱗癌，對臨床病人治療方案的選擇及實施化療方案有重要的參考價值，是一個極具有推廣價值的腫瘤標志物。對TPA的定量分析，目前常用的是放射免疫分析(RIA)和酶聯免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必須用1251等放射性元素標記，其放射性核素的半衰期短，不能長期保存，同時也給實驗操作人員帶來了放射性傷害。ELISA檢測靈敏度不夠高，檢測范圍窄，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性等缺點也不能滿足臨床的要求。化學發光法作為一種高靈敏度、線性范圍寬的檢測方法，它的優越性逐漸為科學家們所重視，目前已被廣泛應用于醫藥、生物、食品、環境、微生物等各個領域。腫瘤作為一類嚴重危害人們生命健康的惡性疾病，其早期診斷與治療，對其預后具有十分重要的意義，對其復發與預后的監控是提高腫瘤患者生存率的一個重要方面。TPA作為現在臨床中診斷腫瘤的重要指標，應被廣泛應用于臨床，與其它分析方法相比，化學發光法具有檢測靈敏度高、線性范圍寬、檢測儀器簡單等諸多優點，既沒有前面所述的放射免疫分析法的諸多缺點，又沒有熒光免疫分析法實驗儀器價格昂貴、需要專業人員進行操作、試劑保存要求嚴格、容易受到樣品中自然熒光的干擾等缺點；與分光光度酶免疫測定法相比，其線性范圍更寬o化學發光免疫分析技術是把高靈敏的化學發光分析方法和特異性強的免疫分析方法相結合發展起來的一項具有化學發光分析的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性的新的免疫分析技術。本發明采用"雙抗體夾心法"在酶聯免疫分析的基礎上應用酶催化發光底物，通過檢測發光底物產生的光信號代替酶聯免疫分析中的顯色底物，因而其靈敏度大大提高，并且操作簡便適用性廣，既可應用于開放式的半自動化學發光測量儀，也可用于全自動的測量系統，可實現大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應用。
發明內容本發明目的是提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、特異、穩定地檢測組織多肽抗原的試劑盒。根據本發明的組織多肽抗原化學發光免疫分析定量測定試劑盒由組織多肽抗原校準品、組織多肽抗原單克隆抗體或多克隆抗體包被的固相載體、堿性磷酸酶標記的抗組織多肽抗原單克隆抗體或多克隆抗體、堿性磷酸酶所作用的化學發光底物液1,2-二氧乙烷類衍生物以及濃縮洗滌液組成。上述試劑盒中，所述固相載體為微孔板、塑料珠、磁性顆粒。上述試劑盒中，所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛垸)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷。上述試劑盒中，所述濃縮洗滌液為Tris-HCl洗漆液。本發明的另一目的是提供一種組織多肽抗原化學發光免疫分析定量測定試劑盒的制備方法。本發明試劑盒具體制備過程如下配制組織多肽抗原校準品、以組織多肽抗原單克隆抗體或多克隆抗體包被固相載體、以堿性磷酸酶標記抗組織多肽抗原單克隆抗體或多克隆抗體、配制堿性磷酸酶所作用的化學發光底物液、配制濃縮洗滌液、分裝上述各組分以及組裝為成品。根據本發明的方法，優選，所述包被固相載體包括以下步驟包被板制備在包被緩沖液中加入組織多肽抗原單克隆抗或多克隆抗制成工作液，將其負載于固相載體上，然后洗去液體，用封閉液封閉。其中包被緩沖液選用碳酸鹽緩沖液。碳酸鹽緩沖液由Na2C03l.5g、NaHC032.9g、蒸餾水1000ml組成，pH9.6。洗滌液選用生理鹽水。封閉液選用PBS-BSA緩沖液。在上述方法中，所述固相載體為微孔板、塑料珠、磁性顆粒。在上述方法中，所述酶為堿性磷酸酶。在上述方法中，堿性磷酸酶標記的抗體，采用戊二醛法連接。在上述方法中，所述化學發光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物。在上述方法中，所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛垸)-1，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷。本發明是針對臨床實驗室和中小型醫院，為其提供一種既能手工操作，又可適用于某些全自動檢測儀器的診斷試劑盒，其操作簡便，成本低廉，反應迅速，重復性好。本發明采用化學發光免疫分析法，利用堿性磷酸酶催化發光底物，當標記的組織多肽抗原抗體與相應抗原結合后，發光底物受堿性磷酸酶作用，發生氧化還原反應，反應中釋放可見光或者該反應激發熒光物質發光，最后用化學發光儀進行檢測。本發明避免放射性元素污染同時，較酶聯免疫吸附實驗的靈敏度有了大幅度的提高。組織多肽抗原單克隆抗體包被固相通過物理吸附作用完成。本發明人考察了不同緩沖體系對組織多肽抗原單克隆抗體在固相上的物理吸附效率。本發明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩定等優點，其各項指標均達到同類進口試劑盒的分析法水平。并且，根據本發明的檢測系統為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學發光測量儀，特別適合廣大的中小醫院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。根據本發明的試劑盒，既有效地利用了化學發光技術原理，又確保了檢測的靈敏度。另外，這種模式還便于操作和生產。圖1為實施例1所制備的試劑盒中的校準品線性圖。圖2為分別使用本發明的試劑盒與酶聯免疫試劑盒測定臨床血樣對比圖。具體實施例方式實施例1組織多肽抗原化學發光免疫分析定量測定試劑盒的制備一、酶標抗體制備酶標組織多肽抗原抗體采用戊二醛法制備，用酶標抗體稀釋液以h2000工作濃度稀釋酶標抗體。(1)戊二醛法制備過程組織多肽抗原抗體用戊二酸與堿性磷酸酶偶聯，對PBS充分透析，加等體積甘油，一2(TC以下保存。(2)酶標抗體稀釋液配方Tris12.120gBSA5gProclin300lmL雙蒸水定容至1000mL二、組織多肽抗原校準品的配制以動物血清或蛋白緩沖液為基質，加入組織多肽抗原純品配制而成。制備的最終濃度為0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL。三、固相包被板的制備(1)包被包被液選用碳酸鹽緩沖液。碳酸鹽緩沖液配方Na2C031.5gNaHC032.9g雙蒸水定容至lOOOmL調整pH值至9.6。碳酸鹽緩沖液以1:5000工作濃度稀釋組織多肽抗原包被抗體，混勻后每孔加入llOpL，'4'C放置12小時。(2)洗滌用生理鹽水洗二次。(3)封閉封閉液配方NaH2P04,2H20Na2HP04-12H20牛血清白蛋白Proclin300雙蒸水0.2g2.9g10glmL定容至lOOOmL將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水定容，溶解混勻，測定pH值為7.0。每孔分別加入封閉液300pL，室溫放置3小時。甩掉封閉液，室溫除濕干燥24小時。立即進行封袋。貼簽后置28。C保存。四、化學發光底物液本發明所使用的堿性磷酸酶(ALP)的化學發光底物液的配制方法-Tris24gNaCl160gKC14gHC115mLAMPPD200mLProclin300lmL雙蒸水定容至1000mL溶解，混勻后分裝。五、濃縮洗滌液Tris24gHC115mLNaCl160gKC14g去離子水1000mL調整pH值至7.4，使用時用蒸餾水稀釋20倍使用。六、半成品及成品組成上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩定性檢定合格才能組裝成定量測定試劑盒。組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。本發明的發明人對試劑盒的反應模式和反應條件進行了試驗研究，最終確定了"雙抗體夾心一步法"反應模式，并就不同的反應時間對試驗結果的影響進行了試驗，確定最適合的反應時間。通過對化學發光底物液發光持續時間的測定及不同發光時間對測定值的影響試驗表明在加入化學發光底物液后30分鐘一60分鐘進行測量為最佳，其結果也較為準確穩定。實施例2組織多肽抗原化學發光免疫分析定量測定試劑盒的制備除以塑料珠為固相載體外，其余均與實施例1相同的方法制備本發明的組織多肽抗原化學發光免疫分析定量檢測試劑盒。實施例3組織多肽抗原化學發光免疫分析定量測定試劑盒的制備除以磁性顆粒為固相載體，以經典的戊二醛法將組織多肽抗原單克隆抗體或多克隆抗體聯結于磁性顆粒表面外，其余均以與實施例1相同的方法制備本發明的組織多肽抗原化學發光免疫分析定量檢測試劑盒。實施例4本發明的試劑盒的使用方法以上實施例1制備的試劑盒的具體操作如下1)平衡所有檢測試劑和樣本至室溫；2)取需用量的板條；3)每孔依次加入25pL校準品(0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、20ng/mL)和待測樣本；4)每孔依次加入lOOpL酶標抗體，于微量振蕩器上振蕩30秒使其混合均勻；5)37。C溫育60mm;6)用自動洗板機進行洗板，將固定在固相載體上的包被抗體一抗原一酶標抗體復合物與未結合物分離；7)每孔加入體積為lOOpL的化學發光底物液，室溫避光溫育30min，在30min后利用化學發光檢測儀進行檢測；8)使用Log(x)-Log(y)的雙對數數據擬合方式，進行標準曲線的建立，計算實驗測定結果。實施例5本發明的試劑盒與酶聯免疫試劑盒的方法學鑒定比較本發明試劑盒按實施例4所述使用方法進行實驗，酶聯免疫試劑盒為外購，嚴格按期說明說步驟使用，兩種試劑盒的性能評價指標見表1。表1兩種診斷試劑盒的性能指標評價<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表1數據分析，本發明"組織多肽抗原化學發光免疫分析定量測定試劑盒"的精密性、靈敏度、特異性和穩定性完全符合要求。并且，靈敏度顯著優于酶聯免疫試劑盒。實施例6本發明的組織多肽抗原化學發光免疫分析定量測定試劑盒與酶聯試劑盒比較臨床血樣收集醫院臨床確診肺癌病人50例、胰腺癌50例、卵巢癌25例、肝癌25例、胃癌20例、乳腺癌20例、直腸癌5例、正常人血清標本200例。分別使用本發明實施例1的試劑盒和酶聯免疫試劑盒進行血樣檢測，統計實驗結果并進行相關分析，這兩種方法高度相關(相關系數為0.9302)。表2本發明試劑盒與進口試劑盒檢測臨床血樣分析報告臨床實驗項目本發明試劑盒酶聯免疫試劑盒<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表2數據分析可知，酶聯免疫試劑盒出現4份假陽性，本發明試劑盒出現2例假陽性，臨床符合率較酶聯免疫試劑盒高，充分顯示出了本發明試劑盒的高特異、高靈敏的優越性，更有益于癌癥患者的病情診斷。權利要求1、一種組織多肽抗原化學發光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由組織多肽抗原校準品、組織多肽抗原單克隆抗體或多克隆抗體包被的固相載體、堿性磷酸酶標記的抗組織多肽抗原單克隆抗體或多克隆抗體、堿性磷酸酶所作用的化學發光底物液1，2-二氧乙烷類衍生物以及濃縮洗滌液組成。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為微孔板、塑料珠、磁性顆粒。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液為Tris-HCl洗滌液。5、一種制備權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟配制組織多肽抗原校準品、以組織多肽抗原單克隆抗體或多克隆抗體包被固相載體、以堿性磷酸酶標記抗組織多肽抗原單克隆抗體或多克隆抗體、配制堿性磷酸酶所作用的化學發光底物液、配制濃縮洗滌液、分裝上述各組分以及組裝為成品。6、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述組織多肽抗原校準品由動物血清或蛋白緩沖液加入適量組織多肽抗原制備。7、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述包被固相載體包括包被、洗滌、封閉三個步驟。8、如權利要求7所述的方法，其特征在于，包被液由碳酸鹽緩沖液與適當濃度的組織多肽抗原單克隆抗體或多克隆抗體混合制成，并將其負載于固相載體上；洗滌液選用生理鹽水；封閉液選用PBS-BSA緩沖液，然后進行干燥和封板處理。9、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述以堿性磷酸酶標記組織多肽抗原抗體采用戊二醛方法進行標記。10、如權利要求9所述方法，其特征在于，酶標記的組織多肽抗原抗體用酶標抗體稀釋液以l:2000稀釋而成。全文摘要本發明公開一種組織多肽抗原化學發光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法，屬于免疫分析醫學領域。本發明試劑盒由組織多肽抗原校準品、組織多肽抗原抗體包被的固相載體、堿性磷酸酶標記物、化學發光底物液、濃縮洗滌液組成。進一步，試劑盒的制備包括以下步驟配制校準品、包被固相載體、以酶標記抗體、配制化學發光底物液、配制濃縮洗滌液以及分裝上述各組分最后組裝為成品。本發明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩定等優點。文檔編號G01N21/76GK101377510SQ20081010266公開日2009年3月4日申請日期2008年3月25日優先權日2008年3月25日發明者于尚永,宋勝利,應希堂,矯黎明,胡國茂,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術有限公司