專利名稱：：Iii型前膠原n端肽化學發光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明提供了一種III型前膠原N端肽化學發光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發展的必經階段。肝硬化是一類嚴重威脅人類生命和健康的惡性疾病。及早診斷和治療肝纖維化是對抗肝硬化的有效手段之一，因此，肝纖維化的早期診斷是非常重要的。目前，臨床較常用診斷肝纖維化的血清標志物有III型前膠原N端肽、IV型膠原、III型前膠原N端肽、脯氨酰羥化酶、層粘蛋白、層粘蛋白-Pl片段、TGF-Pl等，常用III型前膠原N端肽、IV型膠原、m型前膠原N端肽、層粘蛋白作為肝纖四項診斷肝纖維化程度的標志物。現今，肝纖維化診斷試劑盒多采用放射免疫分析方法，該方法對人體有害，易造成污染。一般的檢測方法很難對其進行精確的定量，III型前膠原N端肽是常用的肝纖維化標志物之一，對肝纖維化程度，特別是早期診斷有較高價值。因此，如何能夠有效地測定III型前膠原N端肽水平與其它標志物共同診斷肝纖維化診程度一直是人們關注并希望解決的問題。近十年來標記免疫分析技術的研究和應用發展迅速，已廣泛應用于生物醫學基礎理論研究及臨床疾病診斷各領域。其中技術工藝成熟，具有先進性且實用性強，易于推廣的主要有放射免疫分析、酶聯免疫分析、時間分辨焚光免疫分析和化學發光免疫分析等方法。這些超微量檢測技術的基本理論大體相同，但是所用示蹤劑及所發出的信號各不相同。根據大量的實驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩定性、準確性及發展前景來看，依次為化學發光免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、酶聯免疫分析以及放射免疫分析。目前III型前膠原N端肽檢測方法主要有放射免疫分析法，酶聯免疫吸附層析和時間分辨熒光免疫分析方法等，以酶聯免疫吸附層析方法最為普及。放射免疫分析法存在諸多缺點，如操作復雜、測定結果不穩定、試劑保存時間短、放射性污染、儀器昂貴等；時間分辨熒光免疫分析方法需要用稀有金屬進行標記；酶聯免疫分析技克服了放射性污染，應用廣，但是由于存在酶不穩定，光度測量范圍窄，靈敏度不高，難以定量等不足之處，受到了應用上的限制；化學發光免疫分析具有靈敏度高，特異性強，線性范圍廣，檢測快速等優點，并且所用試劑毒性低，無放射性污染，并有良好的穩定性；適用面廣，已經廣泛地用于抗原、半抗原、抗體的免疫檢測。化學發光免疫分析法是一種較先進而有效的方法，然而，目前化學發光免疫分析技術在III型前膠原N端肽免疫分析產品的應用方面仍處于起步發展階段。一方面，產業應用需要解決成品的高效性和穩定性問題。另一方面，現有技術中的化學發光免疫分析試劑盒均為封閉式全自動化學發光測量系統，需要昂貴的全自動化學發光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用于臨床診斷和科研工作。本發明的試劑盒可應用于開放式的半自動化學發光測量儀，也可用于全自動的測量系統，可實現大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應用。
發明內容本發明同時解決了上述問題，即將化學發光技術與III型前膠原N端肽的免疫分析學有效地結合，提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩定地檢測III型前膠原N端肽的試劑盒，該試劑盒適于在產業上有效地推廣應用。本發明的目的是提供一種III型前膠原N端肽化學發光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法。200810102020.4說明書第3/ll頁根據本發明的試劑盒包括1)III型前膠原N端肽校準品；2)包被有III型前膠原N端肽的單克隆抗體的固相栽體；3)酶標記的III型前膠原N端肽的單克隆抗體；上述酶所作用的化學發光底物；以及5)濃縮洗滌液。進一步，根據本發明的制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以III型前膠原N端肽純品配制III型前膠原N端肽校準品；2)用酶標記III型前膠原N端肽的單克隆抗體；3)以III型前膠原N端肽的單克隆抗體包被栽體；4)配制化學發光底物；5)配制濃縮洗滌液；6)分裝上述III型前膠原N端肽校準品、酶標記的III型前膠原N端肽的單克隆抗體、該酶所作用的化學發光底物和濃縮洗滌液；以及7)組裝為成品。在上述根據本發明的試劑盒及其制備方法中，所述載體為固相栽體、優選微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。所述酶可以為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。所述化學發光底物可以為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾，其中所述1,2-二氧乙烷類衍生物可以為(金剛烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star在根據本發明的方法中，其中所述包被載體的步驟3)包括以下步驟1)包被將制備的包被緩沖液與III型前膠原N端肽的單克隆抗體混合，并將所得混合液負栽于固相載體上；2)用生理鹽水洗滌上述載體；以及3)封閉將配制的封閉液封閉上述洗滌后的固相載體。具體的上述試劑盒可以包括III型前膠原N端肽校準品、抗體包被板、酶標記物與化學發光底物液、20倍濃縮洗滌液等。其中，所述m型前膠原N端肽校準品為標準級，純度不低于卯％、抗體包被板為48或96孔的微孔板條、酶標記III型前膠原N端肽單克隆抗體為偶聯堿性磷酸酶、化學發光底物液為AMPPD、濃縮洗滌液為Tris-HCl洗液。本發明"III型前膠原N端肽化學發光免疫分析定量測定試劑盒"可以非常專一地定量檢測出病人III型前膠原N端肽的含量，可以根據III型前膠原N端肽含量的多少判斷治療肝纖維化病人藥物的效果及其病情的變化。它具有簡便、快速、靈敏、穩定等優點。該III型前膠原N端肽測定試劑盒(化學發光法)的各項指標均達到或超過酶聯免疫分析法。并且，根據本發明的檢測系統為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學發光測量儀，特別適合廣大的中小醫院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。根據本發明的試劑盒，酶標記的III型前膠原N端肽單克隆抗體與載體上包被的III型前膠原N端肽單克隆抗體和被測樣品的III型前膠原N端肽蛋白片段形成"雙抗體夾心，，結構，因此本發明采用的"雙抗體夾心一步法"反應模式，既有效地利用了化學發光技術原理、又確保了檢測的靈敏性。另外，這種模式還便于操作和生產。本發明的試劑盒應用的是酶催化發光底物，通過檢測發光底物產生的光信號代替酶聯免疫分析中的顯色底物，因而具有與酶聯免疫分析同等的特異性，而靈敏度大大提高，比現今的酶聯免疫吸附分析靈敏度大大提高，可為肝纖維化的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據。圖1為實施例1所制備的試劑盒中的校準品線性圖。圖2本發明試劑盒與PIIINP酶聯免疫檢測試劑盒的相關性。具體實施例方式實施例1制備本發明的III型前膠原N端肽定量測定試劑盒一、酶標抗體制備III型前膠原N端肽單抗用戊二醛法與堿性磷酸酶偶聯，對PBS充分透析，加等體積甘油，-2(TC以下保存。二、III型前膠原N端肽校準品的制備用III型前膠原N端肽純品配制，分裝0、6.2、12.5、25、50、100ng/ml共6瓶。三、酶標抗體濃度選定采用方陣法選擇酶標抗體的工作濃度大于1:6000。四、固相包被板的制備(1)包被檸檬酸三鈉2.92g檸檬酸L78g雙蒸水400ml溶解混勻后，調整PH至4.8,加入適量III型前膠原N端肽單克隆抗體混勻，然后加入樣i孔板各孔中，每孔110uL,4。C過夜。(2)洗滌用生理鹽水洗三次。(3)封閉NaH2P042H200.2gNa2HP0412H202.9gBSA10gProclin3001ml雙蒸水定容至1000ml將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水定容，溶解混勻，測定pH值為7.0。每孔分別加入封閉液300pL,室溫放置3小時。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時。立即進行真空封袋，每袋中放入一枚干燥劑。封袋后放置15分鐘檢查無漏氣，如果有漏氣需重新封袋。貼簽后置2~8'C保存。五、化學發光底物液Tris24gNaCl160gKC14gHC115mL雙蒸水1000mLProclin3001mLAMPPD200ml溶解后混合均勻。六、20倍濃縮洗滌液Tris24gNaCl160gKC14gHC115ml去離子水1000ml調整PH至7.4七、半成品及成品組成上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩定性檢定合格才能組裝成III型前膠原N端肽定量測定試劑盒(化學發光法)。組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。綜上，在本發明的研究過程中，本發明的發明人首先對所用的原材料進行了篩選實驗和質量鑒定，包括標記抗體與包被抗體的活性、載體(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和變異大小、ALP的活性、化學發光底物的發光強度及發光持續時間等。然后對包被方法進行了研究，用不同的包被緩沖液和保護液進行實驗，選擇出最適合的包被緩沖液和保護液，通過抗體不同包被濃度實驗找到最佳的濃度條件。對于ALP的標記可以有不同的方法，通過反復探索和對比實驗最終找到了簡便、產率高、成本低、質量可靠的標記方法，并對不同的酶稀釋液進行了長期的考察實驗，配制出了能夠使酶標記物長期保持活性穩定的稀釋液。本發明的發明人還對試劑盒的反應模式和反應條件進行了實驗研究，最終確定了雙抗體夾心一步法反應模式，并就不同的反應時間對實驗結果的影響進行了實驗，確定最適合的反應時間。通過對化學發光底物液發光持續時間的測定及不同發光時間對測定值的影響實驗表明在加入化學發光底物液后30-90分鐘之間進行測量為最佳，其結果也較為準確。實施例2~3制備本發明的III型前膠原N端肽定量測定試劑盒除以辣根過氧化酶標記III型前膠原N端肽單克隆抗體、以魯米諾(luminol)系統作為化學發光底物，此化學發光底物包括A液和B液，基于1000mL所述化學發光底物A液，包括1.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯苯、0.012g4-硤苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值為8.0~10.0;基于1000mL所述化學發光底物B液，包括0.329g過氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP0412H20、8.74gNaH2P04.2H20,其pH值為7.0~7.6,分別以塑料珠、塑料管作為固相栽體、包被液的pH值為4.5、封閉液的pH值為7.5夕卜，其余均以與實施例1相同的方法制備III型前膠原N端肽定量測定試劑盒。實施例4制備本發明的III型前膠原N端肽定量測定試劑盒除以磁性顆粒作為載體外，磁性顆粒采用戊二醛法包被，其余均以與實施例l相同的方法制備III型前膠原N端肽定量測定試劑盒。實施例5本發明的試劑盒的使用方法以上實施例1制備的III型前膠原N端肽定量測定試劑盒的具體操作如下1)自4。C水箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘。2)取出包被板條，插入板架上。3)反應孔中分別加各濃度校準品和待測樣品，每孔加樣品和各標準品0、6.2、12.5、25、50、100ng/ml各25ul，每次實驗設空白1孑L,然后除空白孔外各孔加酶標記物100yl，用^f效量震蕩器充分振蕩混勻，37。C溫育l小時。4)甩去反應液，每孔加滿稀釋后的洗滌液，洗板5次，最后在干凈的吸水紙上扣干。5)各孔加化學發光底物液50y1,用微量震蕩器充分振蕩混合均勻，室溫(20~25°C)避光反應5分鐘。6)加化學發光底物液后的第530分鐘內測量，在化學發光測量儀上依序測量各孔的發光強度(RLU),測量時間1秒/孔。7)以校準品濃度為橫坐標，RLU值為縱坐標繪出標準曲線，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清內的III型前膠原N端肽的濃度。實施例6本發明的試劑盒與目前市場主流試劑的平行對比試驗(l)試劑盒的準備a)III型前膠原N端肽檢測試劑盒(化學發光法)的制備如實施例1;b)選取當前市場占有率較高、主流的III型前膠原氨基端肽酶聯免疫檢測試劑盒；(2)檢測樣本正常對照樣本180例，確診急性肝炎樣本50例，慢性肝炎樣本84例，肝纖維化樣本155例，診斷符合1995年中華醫學會《病毒性肝炎防治方案》中的肝纖維化標準。(3)檢測方法采用上述兩種III型前膠原氨基端肽檢測試劑進行平行檢測，檢測程序和結果判斷嚴格按照各試劑說明書進行。對上述兩種ni型前膠原氨基端肽檢測試劑盒分別進行精密性、特異性、靈敏度、準確性(回收率)等性能指標評價。(4)檢測結果表1兩種III型前膠原氨基端肽檢測試劑的性能指標評價<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表3兩種III型前膠原氨基端肽檢測試劑的檢測結果匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表1-3所述數據表明，本發明試劑盒精密性、特異性、回收率優于市場主流III型前膠原氨基端肽酶聯免疫檢測試劑盒，靈敏度顯著優于市場主流酶聯免疫檢測試劑盒。酶聯免疫檢測試劑盒檢出2份假陽性、3份假陰性，而本發明試劑盒檢測結果與臨床結果完全相符，與酶聯免疫檢測試劑盒的臨床符合率為98.92%、相關系數為R2=0.9232(見圖2)。權利要求1、一種III型前膠原N端肽化學發光免疫分析定量測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)III型前膠原N端肽校準品；2)包被有III型前膠原N端肽的單克隆抗體的固相載體；3)酶標記的III型前膠原N端肽的單克隆抗體；4)上述酶所作用的化學發光底物；以及5)濃縮洗滌液。2)包被有III型前膠原N端肽的單克隆抗體的固相栽體；3)酶標記的III型前膠原N端肽的單克隆抗體；4)上述酶所作用的化學發光底物；以及5)濃縮洗滌液。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或^茲性顆粒。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶；所述化學發光底物為1，2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發光底物液包含24gTris、160gNaCl、4gKC1、15mLHCl、200mL3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷(即AMPPD)、lmLProclin300、1000mL雙蒸水；或者，所述化學發光底物包括A液和B液，其中，基于lOOOmL所述化學發光底物A液，包括1.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯苯、0.012g4-碘苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值為8.0-10.0;基于lOOOmL所述化學發光底物B液，包括0.329g過氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP04.12H20、8.74gNaH2P04.2H20,其pH值為7.0~7.6。5、一種制備權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)以III型前膠原N端肽純品配制III型前膠原N端肽校準品；2)用酶標記III型前膠原N端肽的單克隆抗體；3)以III型前膠原N端肽的單克隆抗體包被固相栽體；4)配制化學發光底物；5)配制濃縮洗滌液；6)分裝上述III型前膠原N端肽校準品、酶標記的III型前膠原N端肽的單克隆抗體、該酶所作用的化學發光底物和濃縮洗滌液；以及7)組裝為成品。6、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述包被固相栽體的步驟3)包括以下方法1)包被將制備的包被緩沖液與III型前膠原N端肽的單克隆抗體混合，并將所得混合液負載于固相載體上；2)用生理鹽水洗滌上述固相載體；以及3)封閉將配制的封閉液封閉上述洗滌后的固相載體。7、如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。8、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶；所述化學發光底物為1，2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。9、如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明提供了一種III型前膠原N端肽(PIIINP)化學發光免疫分析定量測定試劑盒及其制備方法。根據本發明的試劑盒包括1)III型前膠原N端肽校準品；2)包被有III型前膠原N端肽的單克隆抗體的固相載體；3)III型前膠原N端肽的單克隆抗體酶標記物；4)化學發光底物；以及5)濃縮洗滌液。進一步，根據本發明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以III型前膠原N端肽純品配制III型前膠原N端肽校準品；2)以III型前膠原N端肽的單克隆抗體包被載體；3)以酶標記III型前膠原N端肽的單克隆抗體；4)配制化學發光底物；5)配制濃縮洗滌液6)分裝上述III型前膠原N端肽校準品、酶標記物、化學發光底物和濃縮洗滌液；以及7)組裝為成品。本發明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩定等優點。文檔編號G01N33/577GK101377509SQ200810102020公開日2009年3月4日申請日期2008年3月14日優先權日2008年3月14日發明者于尚永,宋勝利,應希堂,胡國茂,鄭金來,鵬高申請人:北京科美東雅生物技術有限公司